一種用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法
2023-04-24 04:27:11 1
專利名稱：一種用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法
技術領域：
本發明涉及油田採油領域中一種用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法。
背景技術：
隨著三次採油技術的發展，大慶油田進入高含水開發後期，對於低滲透油田而言，微生物採油技術具有較好的應用前景。對於維持油田的高產穩產，以及可持續發展具有重 要的意義。油藏微生物群落的解析和認知是開發和應用微生物採油技術的基礎。傳統上採用 純培養的方法來研究和認識油藏微生物群落，由於傳統培養的方法存在著(1)沒有充分 考慮和模擬環境條件，導致只有極少數的微生物(0.01% )能夠在人工培養條件下成 活和被培養；(2)人工培養條件對微生物具有不同的選擇性和富集效果，因而所檢測到的 微生物在種類、數量和功能上的相對情況是通過選擇和富集後的結果，並不能完全準確地 反映油藏中的真實情況；(3)無法準確地研究和了解油藏中微生物生態系統的規律；(4)無 法指導人們科學地調控油藏微生物群落達到提高採收率目的等問題。所以利用傳統培養方 法對油藏微生物群落的認知與實際情況存在較大的偏差，從而導致無法對油藏微生物群落 進行準確、有效地調控，也無法高效地提高原油採收率。目前，通過純培養技術分離到的微生物僅佔自然界的0. 15%左右，隨著分 子生物學和系統發育分析方法的發展，尤其是基於16SrRNA基因的PCR擴增和探針雜交技 術，能使我們更準確全面地認識特定生態系統中的微生物種群多樣性，通過分子生物學的 方法對油藏微生物生態系統的研究報導還比較少。其中Orphan等通過對樣品總DNA建立了 16S rDNA克隆文庫分析了高溫油田微生物群落結構的組成；Watanabel等通過螢光原位雜 交(FISH)、構建文庫、對原油儲坑地層水中微生物群落進行了研究，並通過競爭PCR(cPCR) 對其中優勢菌群進行定量分析。所有研究結果表明原油儲層存在很高的微生物多樣性，這 些結果使人們進一步了解了原油儲層微生物生態系統。
發明內容
為了克服背景技術中存在的不足，本發明提供一種用於微生物採油過程優勢菌群 監測的方法，該方法能準確反映油藏微生物真實數量，能夠準確而且快速地解析採油微生 物在油藏中分布、遷移和變化，為提高石油採收率提供重要的理論指導。本發明的技術方案是本發明的方法包括下列步驟(1)、首先取油井採出液為樣品，對樣品中微生物的總DNA進行提取；(2)、篩選合適的PCR-DGGE引物，通過對已知的用於PCR-DGGE的引物，進行篩選；(3)、篩選引物的PCR擴增體系的優化；(4)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)優化；(5)、優勢條帶的膠回收測序；(6)、優勢條帶的網絡比對和分析。
上述方案中總DNA的提取①將ImL油井採液振蕩5min，然後3000r/min離心，留 上清液；②加入2倍體積的10 XPBS進行洗滌，振蕩5min，然後12000r/min離心5min，去掉 上清液；③加入10XPBS緩衝液100 μ L，然後超聲40s ；④用華舜「DNA小量細菌提取試劑 盒」，進行後續的DNA提取，然後保存在-20°C冰箱中；上述方案中篩選適合步驟(1)提取的DNA的PCR-DGGE引物，確定的引物為， DQF338 :5』 -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，； DQR534 :5』 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3』 ；上述方案中引物的PCR擴增體系PCR反應體系(20 μ L)如下10 Xbuffer 2. 0 μ L, 2. Ommol/L dNTP 2 μ L, 10pmol/L 引物各 1 μ L, TaqDNA 酶 0. 3 μ L ；PCR 擴增條件為 95°C預變性 5min，94°C變性 lmin，52°C退火 30s，72°C延伸 2min，30 個循環，72°C延伸 20min。上述方案中變性梯度凝膠電泳(DGGE)條件①變性梯度膠的製備使用梯度混合 裝置，製備6% (w/w)和8% (w/w)的聚丙烯醯胺凝膠，變性劑濃度從40%到60%,100%的 變性劑為7mol/L的尿素和40% (w/w)的去離子甲醯胺的混合物，其中變性劑和丙烯醯胺的 濃度從膠的上方向下方依次遞增；②PCR樣品的加樣待變性梯度膠完全聚合後，將膠板放 入裝有電泳緩衝液的電泳槽中，取PCR樣品5μ 1和5μ 1的IOX加樣緩衝液混合後加入上 樣孔；③電泳及染色引物擴增片斷，在130V的電壓下，60°C電泳7h ；引物電泳結束後，將 凝膠進行銀染；④膠圖掃描將染色後的凝膠用UMAX PowerLook 1000透射掃描儀掃描後 獲取膠圖。上述方案中優勢條帶的膠回收測序用膠回收試劑盒切膠回收，後與pGEM-Τ載體 連接，轉化到大腸桿菌T0P10感受態細胞；LB固體培養基中加入氨苄青黴素Amp (5 μ g/mL) 禾口 X-gal，藍白斑篩選轉化子；提取質粒，用載體引物T7 :5』 -TAATACGACTCACTATAGGG-3』禾口 SP6 :5，-ATTTAG GTGACACTATAGAAT-3，檢測；然後去測序。上述方案中優勢條帶的網絡比對和分析所測定的序列與GenBank資料庫中的已 知序列進行相似性比較分析，確定是否為採油菌種和優勢菌種。本發明具有如下有益效果本發明以微生物DNA、RNA為研究對象的「微生物分子 生態學」非純培養技術，不受微生物可培養性的限制，也克服了選擇性培養不能準確反映油 藏微生物真實數量的缺點，能夠更準確、直接和全面地反映群落的結構及多樣性。能夠準確 而且快速地解析採油微生物在油藏中分布、遷移和變化，這不僅對微生物驅油過程中微生 物群落結構的研究和調控具有重要的指導意義，而且還為更有效的獲得各種油藏微生物資 源、調控油藏微生物群落，提高石油採收率提供重要的理論指導。
圖1是微生物採油前、中、後單口油井的16S rRNA V3 V6區DGGE圖譜；
圖2是PCR-DGGE克隆序列與它們在GenBank中最相似的序列的系統進化樹；圖3微生物採油前、中、後的16S rRNA V3 V6區DGGE圖譜；圖4PCR-DGGE克 隆序列與它們在GenBank中最相似的序列的系統進化樹。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明
實施例1、北2-4-P49單井微生物採油種群動態變化監測方法，該方法包括下列步驟(1)、在厭氧條件下取油井採出水，對水樣進行總DNA進行提取①將ImL採出水振 蕩5min，然後3000r/min離心，留上清液；②加入2倍體積的10 XPBS進行洗滌，振蕩5min， 然後12000r/min離心5min，去掉上清液；③加入10XPBS緩衝液100 μ L，然後超聲細胞破 碎儀(S-450D)超聲40s ；④用華舜是「DNA小量細菌提取試劑盒」，進行後續的DNA提取，然 後保存在_20°C冰箱中；應用PBS緩衝液對油藏樣品的洗滌有效地消除較高的背景值，有利 於後續的試劑盒的提取；樣品中的細菌的充分的裂解是DNA提取的另一個重要的前提。(2)、篩選合適的PCR-DGGE引物，通過對已知的用於PCR-DGGE的引物，確定的引物 為DQF338 :5』 -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，； DQR534 :5』 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3』。(3)、篩選引物的PCR擴增體系的優化，引物的PCR擴增體系PCR反應體系 (20 μ L)如下10 Xbuffer 2. 0μ L,2. Ommol/L dNTP 2 μ L，lOpmol/L 引物各 1 μ L，Taq DNA 酶0. 3μ L。PCR擴增條件為95°C預變性5min，94°C變性lmin，52°C退火30s，72°C延伸2min， 30個循環，72°C延伸20min。(4)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)優化，變性梯度凝膠電泳(DGGE)電泳條件①變 性梯度膠的製備使用梯度混合裝置，製備6%和8%的聚丙烯醯胺凝膠，聚丙烯醯胺分子 量300-900萬，變性劑濃度從40% (w/w)到60% (w/w) (100%的變性劑為7mol/L的尿素和 40% (w/w)的去離子甲醯胺的混合物)，其中變性劑和丙烯醯胺的濃度從膠的上方向下方 依次遞增。②PCR樣品的加樣待變性梯度膠完全聚合後，將膠板放入裝有電泳緩衝液的電 泳槽中，取PCR樣品5μ 1和5μ 1的10Χ加樣緩衝液混合後加入上樣孔。③電泳及染色 引物擴增片斷，在130V的電壓下，60°C電泳7h。引物電泳結束後，將凝膠進行銀染其結果見 圖1。④膠圖掃描將染色後的凝膠用UMAX PowerLook 1000透射掃描儀掃描後獲取膠圖。(5)、優勢條帶的膠回收測序用膠回收試劑盒切膠回收後與pGEM-T載體(從 Promega公司購買)連接，轉化到大腸桿菌T0P10感受態細胞(由天為時代公司購買)。LB 固體培養基中加入氨苄青黴素Amp (5 μ g/mL)和X_gal，藍白斑篩選轉化子。提取質粒，用載 體引物 T7 :5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，和 SP6 :5，-ATTTAGGTGACACTATAGAAT-3，檢測。 然後去測序。 (6)、優勢條帶的網絡比對和分析所測定的序列與GenBank資料庫中的 已知序列進行相似性比較分析，結果如圖2，主要的優勢種群為Pseudomonas sp.、 Acinetobacter sp. 、Clostridia bacterium、Thermomicrobium sp. 、Agrobacterium sp.、 Firmicutes bacterium、candidate division，同時還有許多的未知的菌種。採油菌種為 Clostridiabacterium,表明在微生物採油過程中該菌株變得不再是優勢菌株，有力的解釋 了微生物採油效果一般的問題。需要採油工藝進一步的改進。實施例2、北2-4-P47單井微生物採油種群動態變化監測方法，步驟同實施例1。實驗針對不同的條帶進行膠回收和克隆測序，見圖3和圖4。主要的優勢種群為 Acinetobacter johnsonii、Pseudomonasfluorescens.、Pseudomonas sp.、Bosea sp.、 SyntrophothermusIipocalidusλ Aeromonas media。
權利要求
一種用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法，該方法包括下列步驟(1)、首先取油井採出液為樣品，對樣品中微生物的總DNA進行提取；(2)、篩選合適的PCR-DGGE引物，通過對已知的用於PCR-DGGE的引物，進行篩選；(3)、篩選引物的PCR擴增體系的優化；(4)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)優化；(5)、優勢條帶的膠回收測序；(6)、優勢條帶的網絡比對和分析。
2.根據權利要求1所述的用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法，其特徵在於 總DNA的提取①將lmL油井採出液振蕩5min，然後3000r/min離心，留上清液；②加入2 倍體積的10XPBS進行洗滌，振蕩5min，然後12000r/min離心5min，去掉上清液；③加入 10 XPBS緩衝液100 u L，然後超聲40s ；④用「DNA小量細菌提取試劑盒」，進行後續的DNA提 取，然後保存在_20°C冰箱中；
3.根據權利要求1所述的用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法，其特徵 在於篩選適合步驟⑴提取的DNA的PCR-DGGE引物，確定的引物為，DQF338 :5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3』 ；DQR534 5， -ATTACCGCGGCTGCTGG-3』 ；
4.根據權利要求1所述的用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法，其特徵在於 引物的 PCR 擴增體系PCR 反應體系(20 u L)如下10Xbuffer 2. 0u L,2. Ommol/L dNTP 2u L, lOpmol/L 引物各 1 u L, Taq DNA 酶 0. 3 ii L ；PCR 擴增條件為 95°C預變性 5min, 94°C變 性 lmin, 52°C退火 30s, 72°C延伸 2min, 30 個循環，72°C延伸 20min。
5.根據權利要求1所述的用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法，其特徵在於變 性梯度凝膠電泳(DGGE)條件①變性梯度膠的製備使用梯度混合裝置，製備6% (w/w)和 8% (w/w)的聚丙烯醯胺凝膠，變性劑濃度從40%到60%,100%的變性劑為7mol/L的尿素 和40% (w/w)的去離子甲醯胺的混合物，其中變性劑和丙烯醯胺的濃度從膠的上方向下方 依次遞增；②PCR樣品的加樣待變性梯度膠完全聚合後，將膠板放入裝有電泳緩衝液的電 泳槽中，取PCR樣品5iU和5iU的10X加樣緩衝液混合後加入上樣孔；③電泳及染色引 物擴增片斷，在130V的電壓下，60°C電泳7h ；引物電泳結束後，將凝膠進行銀染；④膠圖掃 描將染色後的凝膠用UMAX PowerLook 1000透射掃描儀掃描後獲取膠圖。
6.根據權利要求1所述的用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法，其特徵在於優 勢條帶的膠回收測序用膠回收試劑盒切膠回收，後與PGEM-T載體連接，轉化到大腸桿菌 T0P10感受態細胞；LB固體培養基中加入氨苄青黴素Amp(5iig/mL)和X_gal，藍白斑篩 選轉化子；提取質粒，用載體引物 T7 :5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3』 和 SP6 :5』 -ATTTAG GTGACACTATAGAAT-3，檢測；然後去測序。
7.根據權利要求1所述的用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法，其特徵在於優 勢條帶的網絡比對和分析所測定的序列與GenBank資料庫中的已知序列進行相似性比較 分析，確定是否為採油菌種和優勢菌種。全文摘要
本發明涉及一種用於微生物採油過程優勢菌群監測的方法。該方法包括下列步驟(1)首先對微生物採油整個過程中代表性的樣品在厭氧條件下取樣，採用改良的DNA提取方法對總DNA進行提取；(2)篩選合適的PCR-DGGE引物，通過對已知的用於PCR-DGGE的引物，進行篩選；(3)篩選引物的PCR擴增體系的優化；(4)變性梯度凝膠電泳(DGGE)優化；(5)優勢條帶的膠回收測序；(6)優勢條帶的網絡比對和分析。該方法能準確反映油藏微生物真實數量，能夠準確而且快速地解析採油微生物在油藏中分布、遷移和變化，為提高石油採收率提供重要的理論指導。
文檔編號C12Q1/68GK101864488SQ20101019965
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月30日 優先權日2010年5月30日
發明者任國領, 伍曉林, 侯兆偉, 卞立紅, 宋考平, 魏利, 黃永紅 申請人:大慶石油管理局