一種高效篩選單酶切基因表達載體的方法

2023-04-23 23:51:16 2

專利名稱：一種高效篩選單酶切基因表達載體的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及基因重組技術，特別涉及一種表達載體的構建和篩選方法，具體來說是一種高效篩選單酶切基因表達載體的方法。

背景技術：
基因重組技術是通過把目的基因重組至質粒或病毒等載體，轉染或感染細胞，在細胞中表達目的基因和/或目的基因翻譯的蛋白質的一種方法，該技術目前是研究基因或蛋白的常用方法之一。目前通過基因重組構建質粒或病毒載體時一般選用雙酶切方法，該方法具有能定向克隆的優點，載體及插入片段在雙酶切及連接後不需鑑定插入片段的方向性；但花費較大，選用的兩種限制型內切酶的酶切效率可能相差較大，技術要求較高，且要在多克隆位點插入多個片段時可能找不到合適的酶切位點。單酶切方法僅用一種限制型內切酶，花費少，對技術的要求較低，在多克隆位點插入多個片段時可供選擇的酶切位點相對雙酶切明顯要多；但是單酶切的缺點是不能定向克隆，連接後需測序鑑定是否存在插入片段及插入片段的方向是否正確，構建正確重組載體的概率小於50％，因此，測序的樣本量至少是雙酶切法的2倍，測序費用比雙酶切法明顯要多。


發明內容
本發明的目的在於提供一種高效篩選單酶切基因表達載體的方法，所述的方法要解決現有技術中的雙酶切方法構建重組載體選用的兩種限制型內切酶的酶切效率可能相差較大，技術要求較高，且在多次克隆時可能找不到合適的酶切位點和花費高的技術問題，同時要解決單酶切方法構建重組載體不能定向克隆，構建正確的重組載體的概率低和測序花費高的技術問題。
本發明一種高效篩選單酶切基因表達載體的方法，所述的方法包括一個選擇合適載體和限制性內切酶的過程，還包括一個利用限制性內切酶對載體進行酶切的過程，還包括一個選擇插入基因片段的過程，還包括一個利用上述的限制性內切酶對所述的基因片段進行單酶切的過程，將單酶切酶切後的載體和單酶切酶切後的基因片段轉化感受態細胞，根據理論上連接正確的重組質粒的基因序列為模板，以插入基因片段的載體的上序列設計上遊引物，根據插入基因片段序列設計下遊引物，進行菌落PCR，然後進行電泳，在菌落PCR產物電泳後出現的條帶為正確構建的重組載體的菌落。
本發明的工作原理是單酶切後載體及待插入片段均在兩端形成黏性末端，連接後會有以下3種情況 A.載體與插入片段連接且方向正確； B.載體與插入片段連接但方向不正確； C.載體自身連接； 以「載體與插入片段連接且方向正確(A情況)」的重組載體序列為模板，根據載體上的序列設計上遊引物，根據插入片段序列設計下遊引物；在菌落PCR時，正確構建的重組載體(A情況)轉化的細菌由於存在DNA模板及相應的上、下遊引物，因此PCR能擴增，電泳時可見條帶。而「載體與插入片段連接但方向不正確」(即B情況)轉化的菌落在PCR時由於插入片段的方向不正確，原先的下遊引物此時相當於上遊引物，即體系中缺失了下遊引物，因此不能擴增出條帶。而「載體自身連接」(即C情況)轉化的細菌在PCR時沒有下遊引物結合的序列，因此也不能擴增出條帶。因此，只要是PCR能擴增出條帶的菌落就是轉化有正確構建重組載體的菌落。
本發明和已有技術相比，其技術進步性是顯而易見的。本發明充分利用單酶切方法在多克隆位點插入多個片段時可供選擇的酶切位點相對雙酶切明顯要多的特點構建載體，轉化細菌後使用特定設計的引物，根據菌落PCR的結果，直接篩選出正確構建的重組載體，從而明顯減少測序費用，技術簡單，容易推廣使用，而且利用單酶切方法在限制型內切酶上花費也較少。由於採用雙酶切法構建重組載體，往往也需菌落PCR鑑定，因此本發明並不會增加額外的費用，解決了採用單酶切方法篩選正確構建重組載體時測序費用比雙酶切法明顯要多的問題。即使雙酶切法構建載體時不用行菌落鑑定，本發明的總費用也僅相當於1-2次的測序費用(也相當於1份限制型內切酶的費用)，較不用該方法時的花費明顯減少。



圖1是本發明採用限制性內切酶對載體進行單酶切後的示意圖。
圖2是本發明採用限制性內切酶對待插入片段進行單酶切的示意圖。
圖3是本發明採用限制性內切酶對載體進行單酶切後形成黏性末端的示意圖。
圖4是本發明採用限制性內切酶對待插入片段進行單酶切後形成黏性末端的示意圖。
圖5是本發明採用限制性內切酶對載體與插入片段進行酶切後連接且方向正確的示意圖。
圖6是本發明採用限制性內切酶對載體與插入片段進行酶切後連接但方向不正確的示意圖。
圖7是本發明採用限制性內切酶對載體與插入片段進行酶切後載體自身連接的示意圖。
圖8是本發明以正確構建的重組載體為模板，設計引物的示意圖。
圖9是本發明採用的pTracer-CMV/Bsd真核表達質粒示意圖。
圖10是本發明的CHMP5-pTracer質粒構建正確的原理示意圖。
圖11是本發明的CHMP5-pTracer質粒構建不正確的原理示意圖。
圖12是本發明的菌落PCR電泳圖，M為100bp Marker；1-13為各菌落PCR結果。
圖13是本發明的pTracer-CMV/Bsd質粒上Bst XI單酶切的位點前後的序列。
圖14是本發明的CHMP5-pTracer重組質粒載體測序結果圖。

具體實施例方式 本發明的單酶切法構建重組載體及轉化感受態細菌的實驗方法均為常規使用的方法，參考《分子克隆》等分子生物學書籍。
實施例1 本發明首先採用限制性內切酶對載體進行單酶切(如圖1所示)，然後再採用限制性內切酶對待插入片段進行單酶切(如圖2所示)，單酶切後載體在兩端形成黏性末端(如圖3所示)；及待插入片段均在兩端形成黏性末端(如圖4所示)；連接後會有以下3種情況 A.載體與插入片段連接且方向正確(如圖5所示)； B.載體與插入片段連接但方向不正確(如圖6所示)； C.載體自身連接(如圖7所示)；即 以「載體與插入片段連接且方向正確」(即A情況)的重組載體序列為模板，使用引物設計軟體如primer 5或「primer 2」等網上免費軟體，根據載體上的序列設計上遊引物，根據插入方向正確的片段序列設計下遊引物，(如圖8所示)，在菌落PCR時，正確構建的重組載體(A情況)轉化的細菌由於存在DNA模板及相應的上、下遊引物，因此PCR能擴增，電泳時可見條帶。而「載體與插入片段連接但方向不正確」(即B情況)轉化的菌落在PCR時由於插入片段的方向不正確，原先的下遊引物此時相當於上遊引物，即體系中缺失了下遊引物，因此不能擴增出條帶。而「載體自身連接」(即C情況)轉化的細菌在PCR時沒有下遊引物結合的序列，因此也不能擴增出條帶。因此，只要是PCR能擴增出條帶的菌落就是轉化有正確構建重組載體的菌落。
實施例2 本發明採用單酶切法構建重組載體時以「載體與插入片段連接且方向正確」的重組載體序列為模板，使用引物設計軟體如primer 5或「primer2」等網上免費軟體，根據載體上的序列設計上遊引物，根據插入方向正確的片段序列設計下遊引物，行菌落PCR，電泳有DNA條帶的即為構建正確的重組載體。
本實施例用單酶切法構建CHMP5-pTracer重組質粒載體。
2.CHMP5-pTracer重組質粒載體的構建真核表達質粒載體pTracer-CMV/Bsd購自Ivitrogen公司，如圖9所示，其有限制性內切酶BstXI酶切位點。
2.1高保真PCRCHMP5(Genbank編號NM_016410)，使用PrimerPremier 5設計引物，並在上、下遊引物5′端加上BstX I的酶切位點及保護性鹼基(下面小寫字部分)，上遊引物為5′tag cca gtg tgg tgg TGC TCAAGA TGAACC GAC TCT 3′，下遊引物為5′tgt cca ctg tgc tgg CGA AGAAAG CAT TTC CCA AGC 3′，按照設計，PCR後可得到一段編碼完整CHMP5蛋白的DNA序列，PCR產物長851bp。使用TAKARA公司的高保真Taq酶(LATaq)，按說明書行PCR，PCR反應條件為94℃4min；94℃45s，55℃1min，72℃45s，進行30個循環，最後72℃延伸10min結束反應。PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳。瓊脂糖凝膠電泳後使用北京鼎國生物公司的DNA快速純化/回收試劑盒回收、純化851bp的PCR產物，操作步驟如下紫外燈下切取含DNA片段的瓊脂糖(100mg-300mg)並移入1.5ml EP管中，用移液器吸頭搗碎後按切取重量溶液A的體積比為1∶3的比例加入溶液A。65℃水浴5-10min，振蕩2次，待膠完全融化後置室溫，加入15μl溶液B，充分混勻後轉入離心柱中，靜置2min，10000rpm 30s，棄下清。加500μl溶液C於離心柱中，10000rpm 30s，棄下清。重複此步驟一次。12000rpm再次離心1min，棄下清。將離心柱裝入新的離心管中，敞開離心管管口室溫靜置10min。加入20μl 50℃水浴預熱的溶液D，靜置2min，13000rpm離心1min，管底液體即為回收的DNA。
2.2Bst XI限制性內切酶單酶切使用MBI公司的限制性內切酶Bst XI分別酶切PCR產物及pTracer-CMV/Bsd質粒，瓊脂糖凝膠電泳後回收、純化酶切產物。酶切後的PCR產物及pTracer-CMV/Bsd質粒使用T4DNA連接酶(MBI公司)相連接，對照質粒為pTracer-CMV/Bsd空質粒。Bst XI酶切體系為40μl體系10×buffer O+4μl，Bst XI 2μl，pTracer-CMV/Bsd質粒或PCR產物4μl，ddH2O 30μl；55℃2h，4℃10min進行酶切。T4連接酶反應體系為10μl，包括酶切後的pTracer-CMV/Bsd質粒3μl，酶切後的PCR產物3μl，10×T4 Ligase Buffer 1μl，T4連接酶1μl，ddH2O2μl，混勻後，置22℃孵育16h。
2.3感受態細胞的轉化及陽性菌落的篩選取新鮮TOPO 10感受態菌200μl，加2μl連接物，混勻，冰上放置30min。42℃熱休克30s，冰上放置2min。加入250μl S.O.C培養基，37℃200rpm振搖1h。取40μl塗抗氨苄青黴素瓊脂平板，37℃過夜。
2.4菌落PCR篩選挑選單個菌落，置入5ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養液中，37℃200rpm振搖培養過夜後取2μl菌液行菌落PCR。由於我們採用的是Bst XI單酶切，酶切後pTracer-CMV/Bsd質粒與PCR產物在連接時方向可正可負，篩選出連接正確的重組質粒較困難，因此，在設計菌落PCR的引物時我們以連接正確的重組質粒的序列為模板，使用質粒上的T7測序引物位點作為上遊引物位點，並在CHMP5插入部分設計下遊引物。如果CHMP5片段插入方向正確(如圖10所示)，可擴增出長度約210bp的PCR產物，如果插入方向錯誤，則不能擴增出PCR產物(如圖11所示)。T7測序引物為5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′，CHMP5下遊引物為5′GTG CCA ATG CAG TCA GTC A 3′。PCR反應條件為94℃4min；94℃45s，58℃45s，72℃45s，進行30個循環，最後72℃延伸10min結束反應。PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳(如圖12所示)，在菌落PCR產物電泳後出現長度約210bp條帶的菌落中應該轉有正確構建的重組質粒。
圖10表明CHMP5片段正確插入質粒時，針對質粒上T7測序位點的上遊引物與CHMP5的下遊引物在行PCR時能擴出DNA條帶；圖11表明CHMP5片段反向插入質粒時，設計的上、下遊引物此時相當於兩條上遊引物，由於缺少下遊引物，因此不能擴出DNA條帶。同理，當載體自身連接時(沒有圖示)，由於沒有與設計的下遊引物結合的DNA模板，因此也不能擴增出條帶。由圖12可知，菌落7、9和13的PCR產物電泳後可見長度在200-300bp的條帶，與我們設計的PCR產物長度為210bp相符，說明在這三個菌落中有正確構建的重組質粒。
2.5測序鑑定取菌落PCR陽性的菌液(選用圖12中的7號)3ml，送上海生工生物公司測序；由於pTracer-CMV/Bsd質粒Bst XI單酶切的位點前後的序列為5′CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTC CAG TGTG(酶切位點)G TGGA3′(如圖13所示)，高保真PCR時的上遊引物(不是菌落PCR時的上遊引物)為5′tag cca gtg tg(酶切位點)g tgg TGC TCA AGA TGA ACCGAC TCT3′，因此，如果插入片段方向正確，測序結果應該為5′CCG AGCTCG GAT CCA CTA GTC CAG TGT G g tgg TGC TCA AGA TGA ACC GACTCT 3′。我們的測序結果表明重組質粒中插入序列的方向完全正確(如圖14所示)，表明我們篩選構建正確的單酶切基因表達載體的方法是有效的。
權利要求
1.一種高效篩選單酶切基因表達載體的方法，所述的方法包括一個選擇合適載體和限制性內切酶的過程，還包括一個利用限制性內切酶對載體進行酶切的過程，還包括一個選擇插入基因片段的過程，還包括一個利用上述的限制性內切酶對所述的基因片段進行單酶切的過程，其特徵在於將單酶切後的載體和單酶切後的基因片段轉化感受態細胞，根據理論上連接正確的重組質粒的基因序列為模板，以插入基因片段的載體的上序列設計上遊引物，根據插入基因片段序列設計下遊引物，進行菌落PCR，然後進行電泳，在菌落PCR產物電泳後出現的條帶為正確構建的重組載體的菌落。
全文摘要
一種高效篩選單酶切基因表達載體的方法，包括一個選擇合適載體和限制性內切酶的過程，一個利用限制性內切酶對載體進行酶切的過程，一個選擇插入基因片段的過程，一個利用限制性內切酶對基因片段進行單酶切的過程，將單酶切後的載體和單酶切後的基因片段轉化感受態細胞，根據理論上連接正確的重組質粒的基因序列為模板，以插入基因片段的載體上的序列設計上遊引物，以插入基因片段序列設計下遊引物，進行菌落PCR，然後進行電泳，在菌落PCR產物電泳後出現的條帶為正確構建的重組載體的菌落。本發明採用單酶切方法構建載體，轉化細菌後使用特定設計的引物，進行PCR，根據菌落PCR的結果，直接篩選出正確構建的重組載體，減少了測序費用。
文檔編號C12N15/63GK101333536SQ20071004303
公開日2008年12月31日 申請日期2007年6月28日 優先權日2007年6月28日
發明者王海嶸, 陳芳源 申請人:上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院