抗逆楊樹的分子標記、篩選方法、試劑盒及應用的製作方法
2023-04-24 00:16:21 1
抗逆楊樹的分子標記、篩選方法、試劑盒及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種篩選抗逆楊樹的分子標記、篩選方法、試劑盒及應用。其中，該分子標記為採用MSAP法檢測的分子標記，分子標記包括MS1，MS2，MS3，MS4，MS5，MS6，MS7，MS8，MS9，MS10。應用本發明確定的篩選抗逆楊樹的分子標記，可以在楊樹生長的早期進行篩選出逆境脅迫適應性強、生活力高的植株，極大地縮短林木育種選擇周期，對發展楊樹速生豐產紙漿林、確保我國林業持續穩定地提供高得率工業紙漿原料具有重要的戰略意義。
【專利說明】抗逆楊樹的分子標記、篩選方法、試劑盒及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學【技術領域】，具體而言，涉及一種篩選抗逆楊樹的分子標記、 篩選方法、試劑盒及應用。
【背景技術】
[0002] DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，是基因組DNA在轉錄水平上進 行調控的一種修飾方式，它參與了基因表達、生物的生長發育和逆境響應應答等過程，其 中，在基因表達調控中具有重要作用。對基因組甲基化進行研究最常用的技術是甲基敏感 擴增多態性技術（Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)，該方法是利 用識別5 '-CCGG序列的同裂酶Hpa II和Msp I對基因組DNA甲基化敏感性不同，相同序列 可以擴增出不同的譜帶，來檢測甲基化水平以及有效區分出基因組DNA的甲基化狀態。
[0003] 楊樹是我國北方的主要造林樹種。但隨著全球氣候變暖，極端天氣頻發，嚴重影響 楊樹的生長與發育，進而影響林木生產的可持續發展。其中，小葉楊是楊樹屬植物中具典型 抗逆特徵的樹種，是設施困難立地造林的主要樹種。而且，利用傳統育種選擇抗逆性好的楊 樹費時而且難度大、成本高。因此，以小葉楊為材料對研究影響楊樹抗逆性狀的分子調控機 制尤為重要，而近年來對楊樹分子生物學方面的研究大多集中在群體遺傳結構與遺傳多樣 性等方面，與其適應性密切相關的DNA甲基化表觀遺傳變異尚未見報導。
[0004] 目前，亟需開發有效的與楊樹抗逆相關的分子標記。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在提供一種篩選抗逆楊樹的分子標記、篩選方法、試劑盒及應用，以解決 現有技術中利用傳統育種選擇抗逆性好的楊樹費時而且難度大、成本高的技術問題。
[0006] 為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種篩選抗逆楊樹的分子標 記。該分子標記為米用MSAP法檢測的分子標記，分子標記包括鹼基序列為SEQ ID NO. 1的 MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5， SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9, SEQ ID NO. 10 的 MSlO。
[0007] 進一步地，待篩選楊樹中能夠檢測到上述分子標記的植株的抗逆性強於檢測不到 上述分子標記的植株。。
[0008] 根據本發明的另一個方面，提供一種篩選抗逆楊樹的方法。該方法包括以下步驟： S1，提取待篩選毛白楊的基因組DNA ;S2,採用MSAP法測定待篩選毛白楊的基因組DNA中是 否含有鹼基序列為 SEQ ID NO. 1 的 MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的MS8, SEQ ID NO. 9的MS9, SEQ ID NO. 10的MSlO的分子標記；S3,根據步驟S2中的測定 結果判斷待篩選毛白楊的抗逆性。
[0009] 進一步地，待篩選楊樹中能夠檢測到分子標記的植株的抗逆性強於檢測不到分子 標記的植株。
[0010] 進一步地，MSAP法所用的EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO : 11和SEQ ID NO :12， Hpall/MspI接頭的序列為SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14, EcoRI預擴增引物的序列為SEQ ID N0:15，HpaII/MspI預擴增引物的序列為SEQ ID N0:16,篩選引物序列為SEQ ID NO: 17 ?20。
[0011] 進一步地，S2中進行MSAP法測定時的雙酶切連接反應體系的總體積為20 μ 1，包 括基因組 DNA200ng，Hpa II/Msp I7.5U，EcoR I7.5U，10X 緩衝液 2yl，50pmol 的 HpaII/ MspI 接頭和 5pmol EcoR I 接頭，T4DNA 連接酶 2. 5U，加 ddH20 至 20μ 1，37°C保溫 12h。
[0012] 根據本發明的再一個方面，提供一種篩選抗逆楊樹的試劑盒。該試劑盒包括採用 MSAP法檢測權利要求1中所述的分子標記時的EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12, Hpall/MspI 接頭的序列為 SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14, EcoRI 預擴增引物 的序列為SEQ ID N0:15，HpaII/MspI預擴增引物的序列為SEQ ID N0:16,篩選引物序列為 SEQ ID NO : 17 ?20。
[0013] 進一步地，該試劑盒包括PCR擴增試劑，擴增試劑包括PCR擴增緩衝液， 25mmolI -1MgCl2, IOmmoir1 dNTP，Taq DNA 聚合酶和雙蒸水。
[0014] 根據本發明的再一個方面，提供一種鹼基序列為SEQ ID NO. 1的MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2，SEQ ID N0.3 的 MS3，SEQ ID N0.4 的 MS4，SEQ ID N0.5 的 MS5，SEQ ID N0.6 的 MS6， SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9, SEQ ID NO. 10 的 MSlO 的 MSAP分子標記在楊樹分子標記輔助選擇育種中的應用。
[0015] 應用本發明確定的篩選抗逆楊樹的分子標記，可以在楊樹生長的早期進行篩選出 逆境脅迫適應性強、生活力高的植株，極大地縮短林木育種選擇周期，對發展楊樹速生豐產 紙漿林、確保我國林業持續穩定地提供高得率工業紙漿原料具有重要的戰略意義。另外，本 發明的分子標記可以用於進一步的抗逆候選基因篩選，可以為作為遺傳標記用於抗逆性狀 的關聯分析，也可以作為候選位點用於進一步的DNA甲基化調控基因表達研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示 意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0017] 圖1示出了楊樹MSAP技術擴增結果，其中H是採用Hpa II/EcoR I雙酶切的結果， M是採用Msp I/EcoR I雙酶切的結果；CK是對照組處理結果，D是經過乾旱處理的結果；以 及
[0018] 圖2示出了 MS2通過回收克隆得到的DNA差異位點核甘酸序列在基因中的位置， 其中，紅色代表通過雙酶切得到的差異條帶，黃色代表甲基化修飾的CCGG位點，綠色代表 5'UTR、藍色代表外顯子、粉色代表3'UTR等基因結構。
【具體實施方式】
[0019] 需要說明的是，在不衝突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特徵可以相 互組合。下面將參考附圖並結合實施例來詳細說明本發明。
[0020] 利用傳統育種選擇抗逆性好的楊樹費時而且難度大、成本高，穩定性差，為了解決 這一技術問題，本發明開發出與篩選抗逆楊樹的分子標記，可以在早期就鑑定出抗逆性好 的單株，從而大大加速育種進程。
[0021] 根據本發明一種典型的實施方式，提供一種篩選抗逆楊樹的分子標記。該分子標 記為採用MSAP法檢測的分子標記，分子標記包括鹼基序列為SEQ ID NO. 1的MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9, SEQ ID NO. 10 的 MS10,具體序列如下
[0022] >MS1 (SEQ ID N0:1)
[0023] ACAAACTCGATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGGTCTTAGGGCGATAATCCAATTACC GGCCATAGCAC CTCCTAAGCGTCTTGCCAAACGCTCAGGAAGTATTTCTTCAAGTATTTCT CGTTGATTGCTCGCTAAAGGG
[0024] >MS2 (SEQ ID NO:2)
[0025] GGATAACTCTATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCAGCTTCGAAT TTGTAGAAAA AATGCGGGTTACTCCCTGCTACCAACACACGCCCATCTGGTAAAAGGCTA GCTGTTGAATGGTACAATCTGGGTAC AGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
[0026] >MS3 (SEQ ID NO:3)
[0027] AGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAATGAGACCGATCGACTCTCCCTGCTAG CTTTTAAGGCT CAAATTACCAATGATCCTCTTGGTAAGCTGAATTGGTACGCAGTCAAGG G
[0028] >MS4 (SEQ ID NO:4)
[0029] CGGTGGCTCGTTAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCAGCATTGTA GTGAACTTGAA GGCTTGCCTGAAGAAGGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
[0030] >MS5 (SEQ ID NO:5)
[0031] CGGTGACTACTATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAACGC AAACTCCTGGA TGAATTGGTACGCAGTCAAGGG
[0032] >MS6 (SEQ ID NO:6)
[0033] TACGACTCACTATAGGGCGAATTGAAGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAAA GCACTCCAATC TAATATTCATATCCAGCATGACATTTCCGTGCTTGATCCAGCTGAATTGGT ACGCAGTCAAG
[0034] >MS7 (SEQ ID NO:7)
[0035] GGGAACTCTATAGGGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCATTATGCC CATGGCCTTGC TTGAGATCCCTATATCTGGATGAACTTGCTTCAGCACCTTAAAGATGTAG ATCTTGTATGTCTCTGTGCTCTTCTT CACCCTCTTTTTCTTCTTCTTTCCGAGCAGGACTCA TGATAAGGG
[0036] >MS8 (SEQ ID NO:8)
[0037] TACGACTCACTATAGGGCGAATTGAAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCATCAGT GCCATAGCTTT CACCACATGCTCCGCAAGTAGCACCCTGTTCGTCATCTTCTTCTTCCTCT TCCCCACTCTCATAGTCTTCCTTGGG TGGTGCAGATACCTTTACTGCCTTAGTCTGGGACT CAGGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
[0038] >MS9 (SEQ ID NO:9)
[0039] GGATGACTCCTATAGGGGCGGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCCCATCAT TTGCAGTTTC CGAGCAGGACTCATGATATGACTGCGTACCAATTCCCATCATTTGCAGTTT CCGAGCAGGACTCATGATAGGTGAC TGCGTACCAATTCCCATCATTTGCAGTTTCCGAGC AGGACTCATGATAAGGG
[0040] >MS10 (SEQ ID NO: 10)
[0041] AGGATTTGTCATGAGATATCAAAAGATCTCACTAGATCCTTCACTAAAATGAAGATTA ATCACTAAGT ATATGAATATCTGGCTGACGTCACATGCCTATTCATTAGC
[0042] 應用本發明確定的篩選抗逆楊樹的分子標記，可以在楊樹生長的早期進行篩選出 逆境脅迫適應性強、生活力高的植株，極大地縮短林木育種選擇周期，對發展楊樹速生豐產 紙漿林、確保我國林業持續穩定地提供高得率工業紙漿原料具有重要的戰略意義。另外，本 發明的分子標記可以用於進一步的抗逆候選基因篩選，可以為作為遺傳標記用於抗逆性狀 的關聯分析，也可以作為候選位點用於進一步的DNA甲基化調控基因表達研究。
[0043] 本發明所示的標記是利用MSAP技術發現的乾旱處理材料與對照組DNA甲基化有 差異的片段，然後再經過DNA純化及分子克隆手段得到相關具多態性DNA片段序列，因此， 待篩選楊樹中能夠檢測到上述分子標記的植株的抗逆性強，反之亦然。
[0044] 根據本發明一種典型的實施方式，提供一種篩選抗逆楊樹的方法。該方法包括以 下步驟：S1，提取待篩選毛白楊的基因組DNA ;S2,採用MSAP法測定待篩選毛白楊的基因組 DNA中是否含有上述分子標記（MS1-10) ;S3,根據步驟S2中的測定結果判斷待篩選毛白楊 的抗逆性。
[0045] 本發明所示的標記是乾旱處理材料與對照組DNA甲基化有差異的片段，待篩選楊 樹中能夠檢測到上述分子標記的植株的抗逆性強，反之亦然。
[0046] 根據本發明一種典型的實施方式，MSAP法所用的接頭、預擴增引物和篩選引物序 列如表1中所示。
[0047] 表 1
[0048]
【權利要求】
1. 一種篩選抗逆楊樹的分子標記，其特徵在於，所述分子標記為採用MSAP法檢測的分 子標記，所述分子標記包括鹼基序列為SEQ ID NO. 1的MSI，SEQ ID NO. 2的MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9, SEQ ID NO. 10 的 MS10。
2. 根據權利要求1所述的分子標記，其特徵在於，待篩選楊樹中能夠檢測到所述分子 標記的植株的抗逆性強於檢測不到所述分子標記的植株。
3. -種篩選抗逆楊樹的方法，其特徵在於，包括以下步驟： S1，提取待篩選毛白楊的基因組DNA ; 52, 採用MSAP法測定所述待篩選毛白楊的基因組DNA中是否含有鹼基序列為SEQ ID NO. 1 的 MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9， SEQ ID NO. 10的MS10的分子標記； 53, 根據所述步驟S2中的測定結果判斷所述待篩選毛白楊的抗逆性。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，待篩選楊樹中能夠檢測到所述分子標記 的植株的抗逆性強於檢測不到所述分子標記的植株。
5. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，MSAP法所用的EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO :12, Hpall/MspI 接頭的序列為 SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14， EcoRI預擴增引物的序列為SEQ ID N0:15，HpaII/MspI預擴增引物的序列為SEQ ID NO: 16,篩選引物序列為SEQ ID NO :17?20。
6. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述S2中進行MSAP法測定時的雙酶切連 接反應體系的總體積為20μ1，包括所述基因組DNA200ng，Hpa II/Msp I7.5U，EcoR I7.5U， 10X 緩衝液 2yl，50pmol 的 Hpall/MspI 接頭和 5pmol EcoR I 接頭，T4DNA 連接酶 2.5U， 加 ddH20 至 20 μ 1，37°C 保溫 12h。
7. -種篩選抗逆楊樹的試劑盒，其特徵在於，包括採用MSAP法檢測權利要求1中所述 的分子標記時的EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12，HpaII/MspI接頭的 序列為 SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO : 14,EcoRI 預擴增引物的序列為 SEQ ID NO : 15,Hpall/ MspI預擴增引物的序列為SEQ ID NO :16,篩選引物序列為SEQ ID NO :17?20。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，進一步包括PCR擴增試劑，所述擴增試 劑包括PCR擴增緩衝液，25臟〇11^\%(：1 2, lOmmoirMNTP，Taq DNA聚合酶和雙蒸水。
9. 鹼基序列為 SEQ ID NO. 1 的 MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的MS8, SEQ ID NO. 9的MS9, SEQ ID NO. 10的MS10的MSAP分子標記在楊樹分子標記輔助 選擇育種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293775SQ201310298867
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優先權日:2013年7月16日
【發明者】張德強, 次東, 宋躍朋, 田敏, 周大凌 申請人:北京林業大學