Tt1基因在提高植物產量中的用途的製作方法

2023-04-23 18:31:56 1

專利名稱：Tt1基因在提高植物產量中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及農作物育種技術領域，具體涉及TTl基因在提高植物產量中的用途。
背景技術：
預計本世紀30年代，我國人口將增加到16億，需要糧食6. 5億噸左右，人均耕地 將減少到1畝左右，面對人口逐年增加、耕地面積逐年減少，糧食自給成為人類的緊迫問 題。解決這一問題行之有效的手段就是通過農作物品種改良提高糧食單產。水稻是人類賴以生存的最重要的糧食作物，今天，全球50%以上的人口靠水稻果 腹。但在水稻生產中，由於病蟲草的危害和不良氣候與環境的影響，嚴重製約了水稻的高 產、優質和穩產，從而直接威脅到人類的生存與發展；同時隨著發展中國家城市化和農用土 地的退化，耕作用地面積將會持續減少，僅依靠現有常規雜交選育法提高產量的困難越來 越大。基於DNA水平的植物基因工程研究為21世紀新的「綠色革命」提供了新的技術平臺。 利用基因工程技術，大規模發掘可用基因，不但可以大幅度提高農作物生產率，而且還能選 育出抗幹早、耐鹽鹼、抗病蟲和其他性狀優良的農作物，從而解決人類、資源和環境之間日 益尖銳的矛盾，促進農業可持續發展。隨著水稻基因組學和分子遺傳學研究的快速發展，尋找水稻增產基因已取得大的 發展。分櫱是影響水稻產量的一種重要農藝性狀，水稻形成的分櫱數是決定穗數的前提，而 穗數又是構成產量的重要基礎。影響水稻分櫱發生的栽培條件和生理機制已有廣泛深入的 研究，但關於水稻如何控制分櫱發生的生物學機制，目前尚不清楚。水稻的分櫱按結實多少 可分為有效分櫱和無效分櫱。在生產上也不是分櫱越多越好，據有關研究資料表明，一棵直 播的水稻可分櫱120 130個，但如果不能完全結實則成無效分櫱，為了爭取更多的有效分 櫱必須爭取多的有效分櫱。至今尚鮮有報導發現有效分櫱數增多而株高不受影響或者降低 的水稻突變體。在申請人之前遞交的中國專利申請200810045667.8中記載了分離自油菜 的新基因，命名為TT1。將該基因轉入水稻中，可提高水稻有效分櫱數、千粒重以提高產量， 同時降低株高以抗倒伏。油菜是我國播種面積最大、地區分布最廣的油料作物。在幾種主要油料作物中，油 菜具有以下幾個顯著的優點①品種類型多，適應範圍廣，對自然條件要求不嚴。總的說來， 油菜是喜涼作物，對熱量要求不高，對土壤的要求也不嚴，酸、鹼、中性土壤均能種植。因此 油菜具有地區上廣泛分布的可能性。②它是油、肥兼收，用地、養地結合的作物。③油菜可以 利用冬閒地種植，不與糧棉爭地。在糧棉生產任務重而人多地少、耕地安排較緊張的地區， 擴大油菜種植較其他作物更為容易。新中國50年來，油菜作為最主要的油料和經濟作物發展穩中有升，新品種推廣實 現了三次革命。進入90年代，無論是種植面積、單產水平和總產量均繼續保持快速增長的 勢頭，但由於傳統育種方式過程複雜、耗時長，造成近幾年油菜產量增加達到瓶頸期。通過 轉基因技術與傳統育種相結合，全國20多個科研單位近二十年的協作科技攻關以及中國 一加拿大或澳大利亞、美國等重大國際合作研究，致力於研發出高產、穩產、性狀優良的優
3質新品種。可見利用基因工程方法獲得的油菜轉基因植株，使其成為生產上可以應用的新 品種就成為當今繼續提高油菜產量的新途徑。多年生黑麥草原產西南歐、北非和西南亞的溫帶。目前世界各國均有栽培。在我 國主要分布於華東、華中和西南等地，以長江流域的高山地區生長最好。多年生黑麥草質優 良，葉量豐富，莖葉柔嫩，適口性好，是馬、牛、羊、兔草食家畜的優質牧草；也是養魚的好飼 料。可青飼、青貯或調製乾草，也適於放牧利用。多年生黑麥草是一草多用的優良牧草。由 於其根系發達，生長迅速，耕地種植可增加種植地的土壤有機質，改善種植地土壤的物理結 構；坡地種植，可護坡固土，防止土壤侵蝕，減少水土流失。因而選擇高產、優質、抗逆牧草品 種就顯得十分重要。本領域需要開發出能夠提高作物產量的備選基因，以運用基因工程技術提高作物產量。

發明內容
本發明要解決的技術問題是為提高植物產量的轉基因技術領域提供一種新的有 效選擇。本發明解決該技術問題的技術方案是提供了 TTl基因在提高植物產量中的用途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。也能提高植物產量性。本發明同時提供了 TTl基因編碼的多肽在提高植物產量中的用途。上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。本發明還提供了一種培育產量植物的方法。該方法包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連於載體上的表達調控序列後，形成所述TTl基因的重組 載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉入植物細胞；(3)經篩選獲得轉化細胞，然後將轉化細胞培育成轉基因產量植株及其後代，所述 後代包括植物種子及植物組織。其中，上述植物可為一般的各種農作物，如常見禾本科或十字花科植物。其中的禾 本科植物如小麥、水稻等農作物和黑麥草等牧草物，十字花科植物如油菜、甘藍等作物。本發明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，該 基因來源於十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因為誘餌蛋白，根據酵母雙雜交方法，篩選到油菜中 的一個EST序列，再根據這段篩選到的序列，通過5』RACE的方法獲得序列表中SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。然後根據SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列設計一對PCR引物，從油菜cDNA中擴增SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。在本發明中，「在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核 苷酸衍生序列」的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO. 1所編碼的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同 胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO. 1同 源性低至約89%的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所述的序列。另外，「在SEQ ID NO. 1 中的核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列」的含義還包括能在中度 嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該 術語還包括與SEQ IDN0. 1中的核苷酸序列的同源性至少80 %，較佳地至少89 %，更佳地至 少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。在本發明中的相同功能是指提高植物的產量。該術語還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO. 1相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1 90個，較佳地1 60個，更佳地1 20個，最佳地1 10個)核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為 10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其編碼的 多肽也能提高植物的產量。本發明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領域 已知的各種載體，尤其是真核表達載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發明用上述重組載 體轉化宿主植物細胞，篩選獲得轉化細胞。然後將轉化細胞培育成轉基因高產量植株及其 後代，所述後代包括植物種子及植物組織。本發明中所述的「可操作地連於」表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽 的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA ；如果啟動子控制序 列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位 置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰，而對於分泌前 導序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發明的有益效果在於本發明提供了 TTl基因在提高植物產量方面的用途，在 本發明的實施例中也通過實驗證明轉入了 TTl基因並過表達的植物較野生型的各項產量 相關指標，如種子數，有了顯著的提高。本發明培育出高產量植物的方法也簡便而有效，為 提高植物產量提供了新的有效選擇，具有好的應用前景。


圖1、轉基因水稻植株中潮黴素hpt基因的PCR電泳檢測結果。從左至右依次為分 子量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽性對 照(+)，野生型陰性對照(_)，待檢測植株1 6號。圖2、轉基因水稻植株中TTl基因的PCR電泳檢測結果。從左至右依次為分子 量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽性對照 (+)，野生型陰性對照(_)，待檢測植株1 5號)。圖3、轉基因水稻植株中TTl基因的RT-PCR電泳檢測結果。從左至右依次為分子量 Maker (M，片段大小依次為 2000bp ； 1000 ；750bp ；500bp ；250bp ； 100bp)，l 號為野生型陰
性對照，2 5號為待檢測植株。圖4、水稻的外觀直接比較。1 3為轉基因陰性植株；4 6為轉基因陽性植株。圖5、TTl基因過量表達甘藍型油菜的PCR檢測結果。從左至右依次為分子量 Marker (M，片段大小依次為 2000bp ； 1000 ；750bp ；500bp ；250bp ； IOObp)，1 4 為 TTl 基因
過量表達甘藍型油菜。圖6、轉基因黑麥草植株中TTl基因的PCR電泳檢測結果。從左至右依次為分子 量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽性對照 ⑴，野生型陰性對照㈠，空白對照(0)，待檢測植株1 6號)。
具體實施例方式下面通過實施例並結合附圖，進一步說明而不限定本發明。下述實施例中，凡未註明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的 常規條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。下述實施 例中，所用農桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)採用章魚鹼型菌系的LBA4404菌株；大 腸桿菌(E. coli)採用Dffia菌株，菌株均購自於Qiagen公司。載體pBI 121購自於Clontech 公司。其餘化學實際均為市售分析純。下述實施例中，「SEQ ID N0:1」單獨出現時，本領域 技術人員可理解1其為「SEQ ID NO 1所示核苷酸序列」的簡稱。實施例一使用TTl基因增加水稻產量一、TTl基因的克隆及獲取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因為誘餌蛋白，根據酵母雙雜交方 法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根據這段篩選到的序列，通過5』RACE (見Takara公司所公開的資料)的方法獲得本發明 所述提高植物經濟產量的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根據SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設計引物，上遊引物(SEQID N0. 3) :5，-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下遊引物(SEQID N0. 4) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然後經PCR從油菜cDNA中擴增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。PCR程序如下195 0C4min (預變性)
295 0C30s(變性)
353 0C30s(復性)
472 0C50s(延伸)
52 4步驟循環30次
672 0C5min (終延伸)
74 0C保存。 對PCR產物純化(見Qiagen公司所公開的PCR產物純化資料)，經測序驗證，得到 序列SEQ ID NO 1的基因片段。
二、過表達TTl基因的水稻植株製備1、採用的水稻材料(Oryza sativa L.)為粳稻日本晴，為四川農業大學水稻研究 所保存。農桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)採用章魚鹼型菌系的LBA4404菌株；大腸 桿菌(E. coli)採用Dffia菌株。根據SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設計引物，構建目的基因過量表達重組質粒。上遊引物(SEQID NO. 5) :5，-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下遊引物(SEQID NO. 6) :5，-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。用上述引物，經PCR，從油菜cDNA中擴增完整的SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列， PCR程序如下1. 95°C 4min (預變性)2. 95°C30s (變性)3. 53°C 30s (復性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2 4步驟循環30次6. 72 "C5min(終延伸)7.4V保存。對PCR產物純化(見Qiagen公司所公開的資料)，然後用BamHl與Mcl酶切，膠 回收，與載體PBI121連接(連接位點=BamHl與Mel)，獲含SEQ ID NO 1的過量表達重組 質粒。在大腸桿菌DH5ci中繁殖後，提取質粒(見Qiagen公司公開資料)，將含SEQ ID NO 1的過量表達重組質粒轉入農桿菌LBA4404中。2、外植體培養方法幼胚愈傷組織的誘導和繼代取田間開花後12-15天的水稻未成熟穎果，剝殼後 在75%酒精中浸泡1分鐘，用無菌水衝洗乾淨後，0. 升汞滅菌20分鐘，再用無菌水衝洗 乾淨。在超淨工作檯上晾乾，用鑷子剝取幼胚接種在誘導培養基(NB+2，4-D 2. 5mg/L)上， 於^TC下暗培養。一周後統計愈傷組織的誘導情況並進行繼代，以後每2周繼代一次。成熟胚愈傷組織的誘導和繼代選取外觀健康，飽滿，無病斑的成熟種子脫去穎 殼，75%酒精中浸泡1分鐘，用無菌水衝洗乾淨後，0. 1 %升汞滅菌20分鐘，再用無菌水衝洗 乾淨。在超淨工作檯上晾乾，接種到誘導培養基上，於26°C下暗培養。2周後統計愈傷組織 的誘導情況並進行繼代，以後每2周繼代一次。3、水稻基因轉化實驗方法3. 1、工程菌的活化用無菌牙籤在平板上挑取農桿菌單菌落，放在IOmlYEP培養液(酵母提取物 (YeastExtract) IOg+ 姨蛋白腺(Tryptone) 5g+NaCl IOg+ 力口 /K 至 1L+Rif 50 μ g/mL+Hyg 25 μ g/mL)中培養；或著取保存於_20°C冰箱無菌農桿菌菌液50-100 μ 1於2ml的含相應 抗生素的YEP培養基上，250r/min, 培養過夜。取過夜培養液300 μ 1於3ml的含相應 抗生素的YEP液體培養基中，在250r/min，28°C的條件下遮光振動培養，至菌液達0D600 = 0.5左右，即可用於轉化。上述含目的基因的菌液在無菌的50ml的離心管中以5000r/min離心5分鐘後回 收菌體，用30ml的NBCO (NB+2，4_D 2. Omg/L+AS (乙醯丁香酮)100 μ mol/L)液體培養基重懸含目的基因的菌體。選擇生長狀態良好的，顆粒狀胚性愈傷組織用無菌鑷子將其適當夾 小，創造傷口，然後放在菌液中浸泡，一般浸染時間為10 30min，之後放入有濾紙的平皿 中吸乾多餘菌液。3. 2、共培養將吸乾菌液的愈傷置於NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+AS (乙醯丁香酮)100 μ mol/L) 固體培養基上，共培養培養基上放1層濾紙，濾紙上放愈傷組織。22-25°C暗培養2-3天，直 至愈傷組織上出現少量菌斑為止。3. 3、脫菌與篩選共培養的愈傷組織放在廣口瓶中，用無菌水清洗至清澈，再浸泡於含Cef (頭孢黴 素)500mg/l NBCO液體培養基中，在搖床上中速振蕩30-60min，棄液，將愈傷組織用無菌濾 紙吸乾或在超淨工作檯上吹乾後接放在一篩培養基上暗培養三周，再轉入二篩培養基上暗 培養三周，溫度控制在25 27°C。3. 4、分化與生根選擇將兩次篩選後新長出的抗性愈傷組織接種到預分化培養基(NB+KTlmg/ L+NAAO. 25mg/L)上，暗培養 10 天。再轉到分化培養基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/ L+6-BAlmg/L+Hyg(潮黴素)25mg/L)上光照培養，用日光燈每天照明12小時，溫度控制在 25 27°C。約1 2個月，可獲得2cm左右高的幼苗。將幼苗轉到生根培養基上培養，當 根長到2cm左右高時取出，洗淨根部的培養基，移栽於大田。3. 5、轉基因水稻的檢測3. 5. 1、取一小片再生植株新鮮葉片，抽提總DNA (見Qiagen公司所公開的資料)， 以提取的DNA做模板，分別進行檢測。轉基因水稻植株中潮黴素hpthpt基因的PCR檢測潮黴素hpt基因的PCR引物序列為上遊引物hpt-l(SEQ ID NO. 7) 5，-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3，下遊引物hpt-2(SEQ ID NO. 8)5，-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3，PCR程序如下1. 95°C 4min (預變性)2. 95°C30s (變性)3. 53°C 30s (復性)4. 72°C50s (延伸)5. 2 4步驟循環37次6. 72 "C5min (終延伸)7. 40C保存以上PCR反應完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結果見圖1，若有有目標條帶出現 則代表目的基因已轉入水稻中。轉基因水稻植株中TTl基因的PCR檢測TT1基因的PCR引物序列為TTl-KSEQ ID NO. 9) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，TT1-2(SEQ ID NO. 10) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATATTG-3，
PCR程序如下1. 95°C 4min (預變性)2. 95°C 30s (變性)3. 53°C 30s (復性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2 4步驟循環37次6. 72 "C5min (終延伸)7.4V保存以上PCR反應完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結果見圖2。有目標條帶出現則代 表目的基因已轉入水稻中。RT-PCR 檢測提取了經PCR檢測為陽性的植株和野生型植株，抽提植株的總RNA(見Qiagen公 司所公開的資料)，進行RT-PCR檢測。檢測轉基因植株是否在RNA水平上得到了表達。One Step RT-PCR 的方法在RNase-free 0. 2ml PCR 管中加入(50 μ 1 體系)
0111]IOXOne Step RT-PCR buffer5μ 1
0112]MgCl2 (25mM)10 μ 1
0113]dNTP Mixture(IOmM)5μ 1
0114]RNase Inhibitor(40U/μ 1)1 μ 1
0115]AMV Rtase XL (5U/μ 1)1 μ 1
0116]AMV-Optimized Taq(5U/yl)1 μ 1 011 7]上遊特異引物QO μ Μ)1 μ 1
0118]下遊特異引物QO μ Μ)1 μ 1
0119]Total RNA (彡 1 μ g)1 μ 1
0120]RNase Free ddH2024 μ 1
0121]Total50 μ 1/SampIeRT-PCR的反應程序為1. 50°C30min2. 94°C3min3. 94°C 40s4. 58°C 30s5. 72°C 40s6. 3 5步驟循環40次7. 72 °C5min8. 4°C保存電泳檢測結果見圖3，在陰性對照植株中沒有擴增出特異條帶，而在待檢測植株中 擴增出與目的片段大小一致條帶，證明在顯示條帶的植株中，轉入的TTl基因發生了轉錄， 在RNA水平上得到了表達。三、過表達TTl基因的水稻農藝性狀分析
將檢測確定的轉基因植株及未檢測出的陰性對照移至溫室大棚中，使其自交結 實，以備單株收種。水稻成熟後，兩種材料各選取10株進行室內考種，考察得到結果見表1，直觀比較 見圖4。表ITTl轉基因水稻與陰性對照的產量性狀比較
權利要求
1.TTl基因在提高植物產量中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.TTl基因編碼的多肽在提高植物產量中的用途。
4.根據權利要求3所述的用途，其特徵在於所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
5.根據權利要求1或3所述的用途，其特徵在於所述的植物為禾本科植物或十字花科 植物。
6.一種培育高產量植物的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連於載體上的表達調控序列後，形成所述TTl基因的重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉入植物細胞；(3)經篩選獲得轉化細胞，然後將轉化細胞培育成轉基因高產量植株及其後代，所述後 代包括植物種子及植物組織。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，具體涉及TT1基因在提高植物產量中的用途。本發明要解決的技術問題是為提高植物產量的轉基因技術領域提供一種新的有效選擇。本發明解決技術問題的技術方案是提供了TT1基因在提高植物產量中的用途，經實驗證明轉入了TT1基因並過表達的植物的產量有了明顯的提高。本發明培育出高產量植物的方法也簡便而有效，為本領域提供了新的有效選擇。
文檔編號A01H4/00GK102115750SQ20091031271
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者楊毅 申請人:四川貝安迪生物基因工程有限公司