用於防止心臟缺血-再灌注損傷的多肽的製作方法

2023-05-20 12:43:56 2

用於防止心臟缺血-再灌注損傷的多肽的製作方法
【專利摘要】如下式的肽或者所述GLP-1肽的某些類似物：R1-NH-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK-CONR2R3，其中，R＝H或含1-10個碳原子的有機化合物，且R2R3＝各自獨立地為H或具1-4個碳原子的烷基；可用於治療和預防心臟缺血-再灌注損傷。
【專利說明】用於防止心臟缺血-再灌注損傷的多肽
[0001]本發明涉及一種用於防治心臟缺血-再灌注損傷(heart ischemia-reperfus1ninjury)的多肽。
[0002]在對冠狀動脈分支(一種供給心肌的動脈)閉合進行治療之後，發生心肌損傷。此損傷稱作再灌注損傷。該現象可以在一個實驗環境中進行模擬，在此情況下模擬對大鼠離體心臟進行。
[0003]缺血-再灌注損傷(IRI)是一種在足夠長的中斷之後的血流恢復時影響心肌的綜合症，例如冠狀動脈血栓形成或心臟手術[1，2]中所遇到的情況。該綜合症的主要組成包括:心肌細胞死亡、心肌頓抑、心律失常和無複流[I]。在最近30年中，為闡明IRI的病理生理學性質，積累了大量的實驗研究素材，其中主要關注心肌細胞死亡及限制其的方案。一類這樣的方案是藥物後調理(pharmacological postcondit1ning),其中在血流恢復的同時施以心臟保護劑。這種時間選擇使得後調理與臨床前瞻性相關，其中在冠狀動脈血栓形成和ST段抬高型心肌梗死之後的不可逆心肌損傷的限制仍是主要目標[3]。
[0004]Bose, A.K.等[4]在 Card1vasc Drugs Ther (2007) 21:253-256 中公開了單用GLP-1未能降低心肌梗塞，而當與GLP-1分解抑制劑纈氨酸吡咯烷(VP)聯用時心肌梗塞的發生顯著降低。 [0005]EP -A-1012188公布了用於治療糖尿病和肥胖症的N-Ac-GLP-1-(7-34)-醯胺及其衍生物。
[0006]本發明的一個目的是提供一種心臟缺血-再灌注損傷療法，該方法通過給予可作為單組分進行施用的GLP-1類似物並避免給予該藥物與第二化合物。
[0007]本發明基於這樣的意外發現:本發明的肽具有心血管保護作用而無需同時給予其它化合物，具體地，它們具有保護心臟抵禦缺血-再灌注損傷的作用。使用N末端封閉、C末端截斷的N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺進行後調理限制了大鼠離體心臟中的缺血-再灌注損傷。心舒期高攣縮減弱和梗塞面積減小體現了 N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺的該有益效果。
[0008]圖1:該圖概括了含氧量正常㈧和缺血-再灌注⑶實驗的時間進程。
[0009]圖2:缺血-再灌注對左室舒張壓(LVD)、左室發展壓(LVDEV)和心率血壓乘積(RPP)的作用如圖2A-C所示。在A圖中，*表明與「無肽」條件相比，P〈0.05。
[0010]圖3 =N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺對梗塞面積的作用。各柱代表平均梗死面積(IS) (N=7-14),計算為心肌缺血面積(Area at Risk, AAR) (% IS/AAR)的百分率,而各短棒指示SEM。各治療組的命名如圖2所示。*是指與「無肽」條件相比，P〈0.05。
[0011]根據本發明，式
[0012]Rl-NH-HAEGTFTsDVssYLEGQAAKEFIAffLVK-CONR2R3 所示肽可用於治療和預防心臟缺血-再灌注損傷，
[0013]其中，R為H或含1-10個碳原子的有機化合物，且R2、R3獨立地為H或具1_4個碳
原子的烷基；
[0014]可用於治療和預防心臟缺血-再灌注損傷。
[0015]在該肽的序列中，胺基酸用單字符表示，但明確標明N末端(R1-NH-)和C末端(-CONR2R3)。
[0016]在本發明所用的肽中，R1代表醯基。
[0017]特別地，R1為甲醯基、乙醯基、丙醯基、異丙醯基，和/或，特別地，R2、R3獨立地為龜！、甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基，特別是，R2 = R3，為氣、甲基或乙基。例如，肽的C末端可以是醯胺、二甲基醯胺、二乙基醯胺，但也可以是混合醯胺，如單甲基醯胺、單乙基醯胺、甲基乙基醯胺等等。本領域技術人員不難理解這些組合。
[0018]該肽可經修飾，其中R-GLP-1- (7-34)-醯胺8位的A被選自下組的中性胺基酸取代:s、st、G、C、Ct、Sar、β -丙氨酸和 Aib ;和 / 或
[0019]R-GLP-1-(7-34)-醯胺10位的G被中性胺基酸取代；和/或
[0020]R-GLP-1-(7-34)-醯胺15位的D被酸性胺基酸取代。
[0021]特別地，在該肽中，A可以被S、St、G、C、Cl.、Sar、β_丙氨酸和Aib取代。
[0022]該肽可以與適合的藥學上可接受的載體組合配製。這樣的載體為本領域普通技術人員所熟知，並可容易地獲自藥物製劑的教科書。
[0023]例如，可將本發明的肽配製成永久性或脈動性釋放劑型，或配製成用於皮下、靜脈內、動脈內、經口、 [0024]作為本發明的肽的一個代表，N-Ac-GLP-1-(7-34)-醯胺，一種天然激素GLP-1的合成類似物，其已經顯示在大鼠離體心臟中減弱這種心臟缺血-再灌注損傷，而無需與抑制GLP-1分解的物質，例如VP —同給藥。
[0025]N-Ac-GLP-1-(7-34)_醯胺效應之應用模式的通用類型稱作藥物後調理。這類生物效應的細胞和分子細節仍不為人充分理解。在想不束縛於作用模式的如何假設或原理，但N-Ac-GLP-1-(7-34)-醯胺作用的一個可能機制可涉及心肌細胞上GLP-1受體的激活，其進而激活若干細胞內的信號傳導機制，增加其存活能力。
[0026]籍下文的實施例進一步闡釋本發明，但這些實施例不應被理解為限制保護範圍。單獨的或作任何組合的前述說明和以下實施例中公開的特徵，皆是實施不同形式的本發明的材料。
實施例
[0027]方法
[0028]將全心缺血(35min)_再灌注(120min)施於離體的、逆行灌注的大鼠心臟。在再灌注發生時，肽存在15min。在整個灌注期間測量心臟功能參數(每分鐘心跳、左心室發展壓和舒張壓、心率血壓乘積)。用氯化2，3, 5-三苯基四氮唑(2，3, 5-tripehyItetrazoliumchloride)染色和測面積法進行測定收集的心臟梗死面積。
[0029]結果。
[0030]N-Ac-GLP-1 (7-34)-醯胺將梗死面積 g 28.4% (SEM2.8，N = 14)降低至 11.4%(SEM3.2，N = 8 ；P<0.05)。N-Ac-GLP-1 (7_34)-醯胺顯著減弱了缺血後舒張攣縮。當進行施加而沒有前期缺血時，N-Ac-GLP-1 (7-34)-醯胺對左心室發展壓(LVDEV)或心率血壓乘積(RPP)未有顯著效果，亦未影響任一心臟功能參數。共同給予GLP-1受體拮抗劑艾塞那肽(exendin，9-39)消除了 N-Ac-GLP-l (7-34)-醯胺的效果。
[0031]材料和方法[0032]化學品
[0033]N-Ac-GLP-1 (7-34)-酸胺由 Polypeptide Laboratories 公司(美國聖地牙哥)合成。艾塞那肽(9-39)購自Bachem公司(瑞士)。
[0034]動物和實驗步驟
[0035]使用了雄性Sprague Dawley大鼠(330_370g,購自丹麥Taconic公司)。這些動物研究符合《實驗動物護理和使用指南》(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)
(全國衛生出版學院，Nat1nal Institutes of Health Publicat1n, N0.85-23，1996 修訂)以及管理動物實驗的丹麥法規(1987)，並且，在得到了丹麥司法部動物實驗監管局(AnimalExperiments Inspectorate, Ministry of Justice, Denmark)批准後，進行上述動物研究。
[0036]為進行麻醉，皮下給予咪達唑侖(2.5mg/kg)、氟阿尼酮(2.5mg/kg)和芬太尼朽1檬酸鹽(0.08mg/kg)的混合物。肝素(1000即每kg)通過股靜脈進行給藥。動物經氣管切開術，通以35% 02/65%N2的混合物，並且胸腔被打開。將切除的心臟立即放入冰凍冷卻的Krebs Henseleit緩衝液中。該心臟被迅速固定至Langendorff灌流系統(購自英國 ADInstruments)並用改良的 Krebs-Henseleit 溶液(NaCl118.5mM、KC14.7mM、NaHC0325.0mM, MgSO4L 2mM、CaCl2L 4mM、葡萄糖 11.1mM)進行灌注，用 5% C02/95 % O2 的混合氣體於37°C平衡至pH7.4。移除左心耳(Ieftauricle)並將一個7碼的7氣球(ADInstruments)通過左心房插入左心室並調節舒張壓至4_10mmHg。灌注壓設為70mmHg並通過伺服控制系統(ML175STH泵控制器，ADInstruments)維持於該平均值，根據流動阻力持續調節該蠕動泵轉動。使心臟穩定20min，然後在接下來的1min中對左心室功能參數基線值進行記錄:壓 力(收縮期，LVS ;舒張期，LVD ;發展，LVDEV = LVS-LVD)，每分鐘心跳次數(BPM)和心率血壓乘積(RPP)。購自 ADInstruments 的 Power Lab8/30 系統和 Chart5Pro軟體用於這些記錄。
[0037]淘汰標準
[0038]如穩定期間的最後10分鐘均值無法滿足以下標準，則將心臟淘汰:BPM:210 -350min_\LVDEV: 80 - 150mm Hg,RPP: >22, 000 (mmHgXmirT1)。如果再灌注過程中發生心室顫動持續5分鐘以上，則亦淘汰心臟。
[0039]治療組
[0040]圖1概括了含氧量正常㈧和缺血-再灌注⑶實驗的時間進程。實驗組為:含氧量正常對照，未添加肽；含氧量正常，N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺0.3nM ;缺血-再灌注(IR)對照，未添加肽；IR，N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺 0.3nM ；IR, N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺 0.3nM+ 艾塞那肽(9-39) 3nM; IR，艾塞那肽(9_39)3nM。圖1.顯示了示意含氧量正常灌注(A)和缺血-再灌注(B)的灌注時期的方案圖。「Stab」是指30min穩定期。當存在時，自灌注(A)或再灌注⑶的最後120min起,添加肽,持續15min。總灌注時間總是185min,由以下組成:30min穩定,接著為155min的含氧量正常灌注(圖1A)或35min全心缺血_120min再灌注(圖 1B)。
[0041]測定梗死面積
[0042]再灌注後，如前所述，心臟進行氯化2，3，5-三苯基四氮唑染色和測定平面梗死面積[5]。由對實驗條件未知的調查員進行定量測定。梗死面積(IS)表示為有風險的缺血總面積百分比(AAR) (% IS/AAR)。[0043]統計分析
[0044]所有數值以均值呈現，SEM在括號中給出。單向ANOVA與Dunnett事後檢驗(GraphPad Prism?5)用於比對處理結果和對照條件。P〈0.05視為顯著。
[0045]結果
[0046]功能參數
[0047]基線參數值為(在所有實驗中均為N= 14):BPM291(7)min_1, LVDEV105.2 (5.4)mmHg, LVD8.3 (0.7)mmHg, RPP30302 (1434)mmHg mirT1。在含氧量正常灌注結束時，這些值為(N = 5):BPM215 (H)HiirT1, LVDEV75.2 (8.6)mmHg, LVD19.2(5.2)mmHg 和 RPP16060 (1740)mmHg mirT1。在含氧量正常實驗中這些參數的時間曲線未因灌注的35min和50min之間(即，與缺血-再灌注實驗中施加肽所對應的期間)N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺的存在而受影響。
[0048]缺血-再灌注對LVD、LVDEV和RPP的影響示於圖2A-2C。缺血-再灌注實驗中左心室舒張壓(LVD) (A)、左心室發展壓(LVDEV) (B)和心率血壓乘積(RPP) (C)的時間進程。點代表7-14次實驗的均值，短棒表示SEM。標出了缺血和再灌注時期的起始、施加肽的時期(在灌注開始起15min)以及計算曲線下面積(AUC)的時期。以下的治療組用標識(在A-C中為相同標識)不出意:對照缺血_無妝存在；N-Ac_GLP_l (7-34)酸胺0.3nM ；N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺 0.3nM+Exe (9-39)(艾塞那肽(9-39)) 3nM ；Exe (9-39) 3nM。「基線值」標記的諸點代表在穩定期間最後1min各組的均值。*是指與「不含肽」條件相比，P〈0.05。
[0049]在血流中斷後LVD急劇上升，在朝向缺血期間末期有所下降，並在再灌注開始時再一次急劇上升(圖2A)。在再灌注開始後約5-10min達到峰值，約60min後降至近平臺(near-plateau)。曲線 下面積(AUC)用作再灌注的最後60min間功能參數值的時間積分測量值。在用N-Ac-GLP-1- (7-34)醯胺作後調理之後，與對照缺血相比，這些LVD的AUC值顯著降低；在有GLP-1受體拮抗劑艾塞那肽存在下使用N-Ac-GLP-1-(7-34)醯胺進行後調理(9-39)，或在單用艾塞那肽(9-39)時，它們並未受影響(圖2A)。
[0050]用N-Ac-GLP-1- (7-34)醯胺進行後調理並未顯著降低LVDEV或RPP的AUC值(分別為圖2B和2C)。向著LVDEV增加的趨勢可能曾是明顯的。
[0051]梗死面積
[0052]不作後調理(對照缺血-再灌注)時，梗死面積為24.8% (2.8%，N = 14)(圖3)。該圖亦顯示了用N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺0.3nM作後調理對梗死面積IS/AAR)的影響。治療組入圖2那樣命名。*指與「無肽」條件相比，P〈0.05。用N-Ac-GLP-1-(7-34)醯胺0.3nM進行後調理將梗死面積降低至11.4% (3.2%,N = 8，P〈0.05)。艾塞那肽(9_39)顯示消除了 GLP-1的梗塞限制作用。在有艾塞那肽(9-39)存在下，用N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺進行後調理得到梗死面積為21.4% (2.4, N = 8),並與對照缺血的情況或僅艾塞那肽(9-39)單獨存在下的數值(21.7% ；3.6，N = 9)無差異。
[0053]本發明公開了 N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺所示例的本發明肽的心臟保護效果。N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺是N末端乙醯化、C末端截斷的GLP-1類似物。
[0054]測試了 N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺作為後調理劑的心臟保護性作用。在全心缺血後立即施加N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺，15min，其中再灌注持續120min。以該種方式，N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺在心肌性能水平以及梗塞面積方面皆具有有益的效果。LVD是受影響最為強烈的參數，在使用N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺進行後調理後顯示出顯著的降低(圖2A)。缺血後的LVD升高，或高攣縮(hypercontracture)是導致再灌注時心肌細胞死亡的主要機制之一，這是因機械應力導致肌纖維膜破裂所致[6]。N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺的LVD-降低效果被艾塞那肽(9-39) (GLP-1受體拮抗劑)的存在而封閉。因此，N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺對缺血後攣縮的改善性活性是由已知在心肌中存在的GLP-1受體所介導[7]。
[0055]舒張高攣縮可能反映了恢復的肌細胞中ATP合成的恢復不足和/或Ca2+循環異常[8]。N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺後調理並未以統計學上顯著的方式來影響LVDEV或RPP(圖2B)。然而，用N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺進行後調理之後，朝向LVDEV改善的趨勢看來存在，並且因艾塞那肽的存在而消除(9-39)(圖2B)。
[0056]未發現N-Ac-GLP-1-(7-34)醯胺在含氧量正常條件下灌注期間對心肌性能有影響。
[0057]N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺後調理導致梗死面積顯著下降(圖3)，相對減小值約54%。與前文討論的對LVD的作用一致，N-Ac-GLP-1 (7-34)醯胺的這種梗塞面積限制作用在有GLP-1受體拮抗劑艾塞那肽(9-39)存在下被消除。
[0058]參考文獻 [0059][l]Yellon DM, Hausenloy DJ(2007)心肌再灌注損傷(Myocardialreperfus1ninjury).N.Engl.J Med.357:1121-1135
[0060][2]Turer AT, Hill JA(2010)心肌缺血再灌注損傷的發病機理以及治療的理論基石出(Pathogenesis of myocardial ischemia-reperfus1n injury and rat1nale fortherapy).Am J Card1l106:360-368
[0061][3]0vize M, Baxter GF, Di Lisa F等(2010)再灌注損傷的後處理和保護:我們處在什麼位置？來自歐洲心臟病學會心臟細胞生物學工作組的意見書(Postcondit1ningand protect1n from reperfus1n injury:where do we stand ? Posit1n paper fromthe working group of cellular b1logy of the heart of the European Society ofCard1logy).Card1vasc Res87:406-423
[0062][4]Bose A.K., Mocanu MM, Carr RD, Yellon DM(2007)心肌缺血再灌注損傷在體外大鼠心臟中為完整的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)所減弱，且可涉及P70S6K途徑(Myocardial ischaemia-reperfus1n injury is attenuated by intact glucagon likepeptide-1(GLP-1)in the in vitro rat heart and may involve the p70s6K pathway).Card1vasc Drugs Ther21:253-256
[0063][5]Ossum A, van Deurs U, Engst「0m T, Jensen JS, Treiman M.(2009)GLP-1 和
GLP-1 (9-36)在分離的大鼠心臟中的後處理效應的心臟保護性和肌肉收縮性成分(Thecard1protective and inotropic components of the postcondit1ning effects ofGLP-1 and GLP-1 (9-36) a in an isolated rat heart).Pharmacol Res60:411-417
[0064][6] Inserte J, Barrabes JA, Hernando V, Garcia-Dorado D (2009)再灌注損傷的孤革巴點(Orphan targets for reperfus1n injury).Card1vasc.Res.83:169-178
[0065][7]Ban K, Noyan-Ashraf MH, Hoefer J, Bolz SS, Drucker DJ, Husain M(2008)膜高血糖素樣肽I的心臟保護性和血管舒張性活性為胰高血糖素樣肽I受體依賴性和非依賴性途徑所介導(Card1protective and vasodilatory act1ns of Glucagon-likePeptidelare mediated through both Glucagon-Like Peptidelreceptor-dependentand-1ndependent pathways)。發行 117:2340-2350
[0066] [8] Ladi1v Y，Efe 0，Schafer C 等(2003)再充氧誘導性僵型攣縮(Reoxygenat1n -1nduced rigor-type contracture).J Mol Cell Card1l.35:1481-1490
【權利要求】
1.一種如下式的肽
Rl-NH-HAEGTFTsDVssYLEGQAAKEFIAffLVK-CONR2R3 其中，R為H或含1-10個碳原子的有機化合物，且R2、R3獨立地為H或具1-4個碳原子的烷基； 用於治療或預防心臟缺血-再灌注損傷。
2.如權利要求1所述的肽，其特徵在於，R1代表醯基。
3.如權利要求1或2所述的肽，其中R1為甲醯基、乙醯基、丙醯基、異丙醯基和/或R2、R3獨立地為氣、甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基，特別地，R2 = R3且為氣、甲基或乙基。
4.如權利要求1-3中至少一項所述的肽，其特徵在於， R-GLP-1-(7-34)-醯胺8位的A被選自下組的中性胺基酸取代:S、St、G、C、Ct、Sar、β -丙氨酸和Aib ;和/或 R-GLP-1-(7-34)-醯胺10位的G被中性胺基酸取代；和/或 R-GLP-1-(7-34)-醯胺1 5位的D被酸性胺基酸取代。
5.如權利要求4所述的肽，其特徵在於，A被S、St、G、C、C十、Sar、β-丙氨酸和Aib取代。
6.如權利要求1-5中至少一項所述的肽，其與適合的藥學上可接受載體組合。
7.如權利要求1-6中至少一項所述的肽，其特徵在於，所述的肽配製成永久性或脈動性釋放劑。
8.如權利要求1-6中至少一項所述的肽，其特徵在於，所述的肽配製成用於皮下、靜脈內、動脈內、經口、肌內或經肺給藥。
【文檔編號】A61K38/26GK104039344SQ201280053163
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年10月29日 優先權日:2011年10月28日
【發明者】M·特雷曼, H·K·薩林, K·杜樂, T·恩斯特龍 申請人:法瑞斯生物技術有限公司