生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法

2023-05-21 19:54:46 1

專利名稱：：生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法
技術領域：
：本發明涉及深度處理飲用水源苯並芘(BaP)特效菌Fhhh生物膜技術方法。二
背景技術：
：國內外已有深度處理飲用水源的生物膜工程技術，典型的如德國繆爾海姆水廠；法國梅裡蘇瓦茲水廠；中國上海周家渡水廠等。國際上也有降解苯並芘[benzo(a)pyrene，BaP]的牛寺效菌株，如美國(J.Schneider,1996)Afyco6ac/en'w附s/.RJGII-135，美國(J.A.Rentz,2008)S/W"gowo"氾y朋o汰i/;;"eJAR02等。但是沒有深度處理飲用水源BaP的原生質體融合菌株生物膜技術株專利，原生質體融合菌株深度處理BaP目前仍是空白。BaP是一種強致癌性的持久性有機汙染物(persistentorganicpollutants,POPs)，如YZNJ飲用水源中含有25種POPs有機汙染物，其中BaP達0.024嗎/L;經過傳統的化學絮凝沉澱處理生產的自來水中BaP為0.022pg/L。飲用水中BaP致癌風險最低閾值為0.0029〃g/L(美國環保局，2008)。國內外已有深度處理飲用水源生物膜工程技術，典型的如德國繆爾海姆水廠；法國梅裡蘇瓦茲水廠；中國上海周家渡水廠等。但是，未見應用生物膜深度處理飲用水源強致癌汙染物苯並芘(BaP)的技術專一利。BaP是一種強致癌性的持久性有機汙染物(persistentorganicpollutants,POPs)，如YZNJ飲用水源中含有25種POPs有機汙染物，其中BaP達0.024pg/L;經過傳統的化學絮凝沉澱處理生產的自來水中BaP為0.022嗎/L。飲用水中BaP致癌風險最低閾值為0.0029嗎/L(美國環保局，2008)。本發明是為了應用特效菌生物膜技術高效去除飲用水源中BaP，使生產的自來水水中BaP達到飲用水標準，消除及降低飲用水中BaP的致癌風險威脅，保護人體健康o本申請人的中國專利申請號CN02138171.0為兩真菌與一細菌原生質體融合的特效菌株，即Fhhh特效菌株，是本申請發明人的原創性科研成果，由白腐真菌(親株l)真核細胞、土著細菌YZ1(親株2)原核細胞、釀酒酵母(親株3)真核細胞的兩界細胞原生質體，跨界融合構建而成。通過3個親本菌株兩界細胞的原生質體跨界融合、基因整合、鑑定篩選，從而獲得兼具3個親本菌株優勢特徵於一體的基因工程Fhhh特效菌株，為深度降解飲用水源BaP提供功能基因的整合資源。國際法公認原生質體融合構建的新物種/菌株，不存在基因汙染問題，所以Fhhh特效菌株也不存在基因汙染問題。菌株的保藏號是CGMCCNo.0783。(1)Fhhh特效菌液體培養基配方1000ml液體培養基中3gK2HP04;lgKH2P04;0.5gNH4NO3;0.1gNa2SO4;10mgMgS04.7H20;lmgMnS04.4H20;0.5mgCaCl2;lmgFeS04.7H20;5gCH3COONa;5g酵母浸膏；lOg蛋白腖；10g葡萄糖；200g馬鈴薯浸出汁，調pH至7.0，121QC、103kPa、溼熱滅菌20min。最適培養溫度33土2Gc;最適pH:7.0。(2)三種固體鑑別培養基(SIM1、SIM2、SIM3)配方固體培養基SM二Fhhh特效菌液體培養基+1.5X瓊脂糖。SIM卜SM+100u鏈黴素/ml(streptomycin,Sm)—真菌親株只能在SIM1上生長。SIM2:SM+100u制黴菌素/ml(nystatin,Nt)—細菌親株只能在SIM2上生長。SIM3=SM+Sml00u/ml+Ntl00u/ml(Sm+Nt)—只有跨界融合產物能在SIM3上生長。(3)兩次跨界融合Fhhh特效菌株由親株1白腐真菌(屍/^meroctoetecAo^ospon'wm)、親株2土著細菌YZ1(5flf"7/";y)、親株3釀酒酵母(&cc/zaram少ce;ycwev^fle)的3個親本菌株原生質體跨界融合而成。分別應用蝸牛酶脫去2種真核細胞親株的細胞壁，應用溶菌酶脫去l種原核細胞親株的細胞壁，生成原生質體；離心收集原生質體、經過緩衝液清洗，進行真核原核2界細胞的兩次跨界融合，最終篩選鑑定獲得Fhhh特效菌株。第一次跨界融合生成Fhh(雙親株跨界融合)等量混合親株1白腐真菌和親株2土著細菌YZ1的原生質體於聚乙二醇(PEG,MW=6000)和CaCl2、蔗糖配製的誘導液中，進行第一次跨界融合反應。之後離心收集融合產物，經高滲緩衝液清洗離心後，分別塗布於SIM1、SIM2、SIM3三種固體的含有不同抗生素的生化鑑別培養基上，30GC培養7天。能夠同時在三種固體培養基上長出的菌落，即為第一次雙親株跨界融合產物Fhh。親株1白腐真菌只能在SIM1上生長，親株2土著細菌YZ1，只能在SIM2上生長。第二次跨界融合生成Fhhh(三親株跨界融合)等量混合第一次跨界融合產物Fhh和皿i釀酒酵母的原生質體於聚乙二醇(PEG,MW=6000)、和CaCl2、蔗糖配配製的誘導液中，進行第二次跨界融合反應。之後經離心後收集融合產物、含蔗糖高滲緩衝液離心清洗後、塗布於三種固體鑑別培養基上。之後反覆畫線分離純化出能夠同時在SIM1、SIM2、SIM3三種培養基上長出的單菌落。再經掃描電子顯微鏡(SEM)的攝像確認挑選出不同於Fhh細胞形態的Fhhh單菌落。
發明內容本發明目的是採用生物膜技術高效去除飲用水源中BaP，使生產的自來水水中BaP達到飲用水標準，採用深度處理飲用水源BaP的原生質體融合特效菌生物膜方法，保障飲用水的人體安全健康；尤其是應用原創性的跨界原生質體融合特效菌Fhhh為出發菌株，強化生物膜技術系統深度處理飲用水源BaP的功能。本發明的目的是這樣實現的生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法，菌落為三親跨界融合的保存號為CGMCC.0783的菌落。此菌落融合白腐真菌(親株l)、土著細菌YZ(親株2)、釀酒酵母(親株3)三個親株真核原核細胞的原生質體，通過基因在同一個細胞內的重組整合，構建獲得基因工程特效菌株Fhhh。用所述特效菌生物膜反應器深度處理飲用水源苯並芘(BaP)的方法是Fhhh特效菌劑引入裝有活性炭載體的柱狀反應器中，悶曝溶解氧(DO)Smg/L，馴化掛膜5天，Fhhh在活性炭載體上形成生物膜。之後將飲用水源水引入反應器中，調試處理BaP的工藝參數曝氣溶解氧^2mg/L，pH值6.8-8.0，溫度30土2GC，48小時內負荷比增加至20m3/1112/11，菌體濃度達2-10g/L，去除化學耗氧量(COD)>10%為掛膜成功的結束標誌，之後進入處理運行階段，穩定運行處理階段的反衝洗強度為0.02m3/(m、)。原創性的跨界原生質體融合技術構建出的Fhhh特效菌，用於建立深度處理飲用水源BaP的生物膜技術系統。本發明應用原創性的跨界原生質體融合技術，將親株l一白腐真菌的高降解性、親株2—土著細菌YZ1的高適應性、親株3—釀酒酵母的高絮凝性的3高特徵，整合構建於Fhhh特效菌株的一個細胞之中。原創建立的深度處理飲用水源BaP的特效菌株Fhhh生物膜技術系統，配套相關的應用技術，在應用上具有持久性。本發明的有益效果(1)生產Fhhh特效菌劑成本低，Sl000元/噸，(2)Fhhh特效菌劑具有三親株的綜合優勢，深度處理去除BaP效率^68%。(3)Fhhh生物膜消除致癌風險效益是土著菌1.89倍，是化學絮凝處理法7.50倍。(4)Fhhh來自真核原核菌體核細胞的原生質體融合，不產生新基因及其汙染問題。總之，本發明Fhhh特效菌生物膜反應器深度處理飲用水源BaP比土著菌提高效率和節約費用289%，比傳統的化學絮凝沉澱法提高處理BaP效率7倍以上；處理出水中BaP為0.007ng/L，達到中國、WHO和歐盟飲用水標準0.01ng/L允容濃度的要求。本發明是原生質體融合原創性特效菌生物濾池，深度處理飲用水源BaP的首例，具有高降解優勢，並且性能穩定。四圖1為本發明深度處理飲用水源POPs特效菌株生物膜濾池工藝流程示意圖五具體實施例方式參見圖1深度處理飲用水源BaP特效菌株生物膜濾池工藝流程示意圖。Fhhh特效菌劑製備(1)Fhhh特效菌劑液體培養基配方同於Fhhh特效菌液體培養基配方。(2)製備Fhhh特效菌劑工藝參數發酵設備全自控生物反應器；發酵工藝連續穩定發酵系統；發酵溫度33±2GC;pH值7.0±1;反應器中溶解氧^2mg/L;礦物鹽流量0.001-0.005V/(V.d);菌體濃度2-10g/L;在含C、P、N培養液中培養。表l.發酵生產Fhhh特效菌劑工藝參數tableseeoriginaldocumentpage5特效菌Fhhh生物膜深度處理BaP方法:(1)掛膜馴化將Fhhh特效菌劑引入裝有活性炭載體的柱狀反應器中，曝氣溶解氧(DO)22mg/L，馴化掛膜5天，Fhhh在活性炭載體上形成生物膜。之後將飲用水源水引入反應器中，調試處理BaP的工藝參數曝氣溶解氧^2mg/L，pH值6.8-8.0，溫度30±2QC，48小時內負荷比增加至20mVm2/11，菌體生物膜濃度達2-10g/L，去除化學耗氧量(COD)210%為掛膜成功的結束標誌，之後進入處理運行階段，穩定運行處理階段的反衝洗強度為0.02m3/(m2's)。(2)飲用水源水質背景參數見表2。表2.特效菌Fhhh生物膜反應器深度處理飲用水源的水質參數(mg/L)tableseeoriginaldocumentpage5(3)生物膜反應器參數見表3。表3.特效菌Fhhh深度處理飲用水源BaP的生物膜反應器工藝參數參數名稱數值參數數值生物膜反應器柱體徑高比D/H《1/10混合載體密度Dd，g/cm31.2載體活性碳體積率Vac，％67生物膜載體裝量，Vacqs%280載體石英砂體積率Vqs,%33飲用水源水流速，m3/m2/h20活性碳和石英砂粒徑Si,mm0.8-1.2水力停留時間HRT，min>6活性碳比表面積Saac，m2/g簡流量Q，(m3/d)800,000石英砂比表面積S叫s，m2/g950溶解氧含量Do，(mg/L)1.5(4)處理結果健康效益特效菌Fhhh深度處理BaP人體健康效益推算結果見表4。表4.Fhhh生物膜反應器深度處理YZNJ飲用水源BaP運行健康參數推算結果序號參數單位Fhhh特效菌YZ土著細菌化學絮凝生物膜反應器生物膜反應器傳統工藝1飲用水源水進水流量(Qo)m3/d800,000800,000800,0002飲用水源水進水BaP濃度(So)嗎/L0.0240.0240.0243處理出水BaP濃度(Se)Hg/L0.0070.0150.0224去除BaP濃度(ABaP=So-Se)pg/L0.0170.0090.0025降解BaP生物負荷率(SLR)lOV3.021.60—6去除BaP質量(W-ABaPxQox365)pg/年4964x1062628x106584xl067承BaP致癌風險濃度(MRC)Hg/L0.00290.00290.00298BaP誘發1人致癌風險質量(MD)Hg/人/年511xl06511xl06511xl069消除致癌風險人數(HH二W/MD)人/年9.715.14U410致癌死亡風險費支出(//Cm)百萬Y/人0.45250.45250.452511消除致癌風險經濟效益(E)百萬Y/年4.39382.32590.5859—BaP致癌風險濃度(MRC):誘發106人口理論生命周期中人致癌的BaP濃度。**誘發1人致癌每年BaP質量(MD):MD=106x365xl.4xMRC，其中106為100萬人口數量，365為每年天數，1.4為每人每天理論飲水1.4升。實施例Fhhh菌株生物膜反應器深度處理YZNJ(長江南京)飲用水源BaP。(1)發酵生產Fhhh特效菌劑發酵生產工藝參數見表l，發酵生產特效菌劑的反應器為B.Braun全自控生物反應器。Fhhh特效菌劑添加巰基乙醇(SH)於4'C保存。(2)保存Fhhh特效菌劑方法在抗氧化劑巰基乙醇終濃度0.1-0.3X。+F,終濃度0.1-0.14%的配方中4QC保存。(3)特效菌Fhhh生物膜反應器深度處理飲用水源BaP工藝實施基因工程菌生物膜反應器中，生物膜反應器徑高比D/H《l/10;載體活性碳體積率Vac=67%;載體石英砂體積率Vqs=33%;活性碳和石英砂粒徑Si=0.8-1.2mm;活性碳比表面積Saac=1045m2/g;石英砂比表面積Saqs二950m々g;混合載體密度Dd=1.2g/cm3;生物膜載體裝量Vacqs^80X。發酵生產Fhhh特效菌劑的工藝參數見表1，建造特效菌Fhhh生物膜反應器的參數見表3。將發酵生產獲得的Fhhh特效菌劑引入裝有活性炭載體的柱狀生物膜反應器中，生物膜反應器基因工程菌掛膜馴化方法，悶曝溶解氧(DO)22mg/L，馴化掛膜5天，使得Fhhh在活性炭載體上形成生物膜。之後將飲用水源水引入反應器中，維持D0^2mg/L，pH值6.8-8.0，溫度30士20C，48小時內負荷比增加至20m3/m2/h，Fhhh菌體生物膜達2-10g/L，去除化學耗氧量(COD)WO。/。為Fhhh馴化掛膜成功的結束標誌，之後進入處理運行階段，穩定運行處理階段的反衝洗強度為0.02m3/(m2*s)。基因工程菌生物膜反應器深度處理飲用水源BaP的穩定運行參數，飲用水源水流速為20m3/m2/h;水力停留時間HRT》6min;溶解氧含量Do為2.0mg/L。(4)特效菌Fhhh生物膜反應器深度處理飲用水源BaP工藝實例總結2007年3-9月於NJBHK水廠進行了《深度處理飲用水源BaP特效菌Fhhh生物膜反應器技術》現場處理研究。其中42天穩定運行結果是Fhhh生物膜反應器中的生物負荷率為3.02>10％為掛膜成功的結束標誌，之後進入處理運行階段，穩定運行處理階段的反衝洗強度為0.02m3/(m2·s)。2、由權利要求1所述生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法，其特徵是製備所述基因工程菌的液體培養基的組成是1000ml中K2HP043g;KH2P04lg;NH4N030.5g;Na2SO40.1g;MgS04.7H2010mg;MnS04'4H20lmg;CaCl20.5mg;FeS04-7H20lmg;CH3COONa5g;酵母浸膏5g;蛋白腖10g;葡萄糖10g;200g馬鈴薯浸出汁，調pH至7.0;培養方法是在121GC、103kPa、溼熱滅菌20min後,接種發酵，培養溫度33-37GC;最適pH:7.0，發酵10-25小時。3、由權利要求1所述的生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法，其特徵是基因工程菌制的保存配方，在抗氧化劑巰基乙醇終濃度0.1-0.3。；+FeS+終濃度0.1-0.14。/。的配方中保存。4、由權利要求1所述的生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法，其特徵是基因工程菌生物膜反應器中，生物膜反應器徑高比D/H《l/10;載體活性碳體積率Vac=67%;載體石英砂體積率Vqs二33X;活性碳和石英砂粒徑Si二0.8-1.2mm;活性碳比表面積Saac=1045m2/g;石英砂比表面積Saqs=950m2/g;混合載體密度Dd=1.2g/cm3;生物膜載體裝量Vacqs^80%。5、由權利要求1所述的生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法，其特徵是生物膜反應器基因工程菌掛膜馴化方法，悶曝溶解氧(DO)22mg/L，馴化掛膜5天，基因工程菌在活性炭載體上形成生物膜。6、由權利要求1所述的生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法，其特徵是基因工程菌生物膜反應器掛膜馴化結束標誌，飲用水源水引入反應器中，調試處理BaP的工藝參數曝氣溶解氧^2mg/L，pH值6.8-8.0，溫度30±2QC，48小時內負荷比增加至20m3/m2/h，菌體濃度達2-10g/L，去除化學耗氧量(COD)>10%為掛膜成功的結束標誌。7、由權利要求1所述的生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法特效菌株生物膜反應器深度處理飲用水源苯並芘(BaP)的方法，其特徵是基因工程菌生物膜反應器深度處理飲用水源BaP的穩定運行參數，飲用水源水流速為20m3/m7h;水力停留時間HRT》6min;溶解氧含量Do為2.0mg/L。全文摘要生物膜深度處理飲用水源苯並芘方法，融合白腐真菌、土著細菌YZ、釀酒酵母三個親株真核原核細胞的原生質體，通過基因在同一個細胞內的重組整合，構建獲得基因工程菌，登記號為CGMCCNo.0783；用所述特效菌生物膜反應器深度處理飲用水源苯並芘的方法是基因工程菌劑引入裝有活性炭載體的柱狀反應器中，悶曝溶解氧(DO)≥2mg/L，馴化掛膜5天，基因工程菌在活性炭載體上形成生物膜。之後將飲用水源水引入反應器中，調試處理BaP的工藝參數曝氣溶解氧≥2mg/L，pH值6.8-8.0，溫度30±2℃，48小時內負荷比增加至20m3/m2/h，菌體濃度達2-10g/L，去除化學耗氧量(COD)＞10％為掛膜成功的結束標誌，之後進入處理運行階段，穩定運行處理階段的反衝洗強度為0.02m3/(m2·s)。文檔編號C02F3/12GK101381154SQ20081015565公開日2009年3月11日申請日期2008年10月28日優先權日2008年10月28日發明者兵吳,崔益斌,宴張,張徐祥,程樹培,趙大勇申請人:南京大學