非對稱多色螢光髮夾探針鏈反應在病原菌檢測中的應用的製作方法
2023-05-20 11:52:56 1
專利名稱：非對稱多色螢光髮夾探針鏈反應在病原菌檢測中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物反應技術，特別是涉及基於非對稱多色螢光髮夾探針鏈反應在病原菌檢測中應用。
背景技術：
分子診斷學方法依據細菌核酸特徵進行檢測，為臨床病原微生物快速檢測帶來了新契機。核酸分子固相雜交法、DNA測序法、毛細管電泳分析、基因晶片技術等檢測方法的先後建立，將細菌分子檢測方法提高到一個嶄新的階段，但是這些分子診斷學方法大多需要特殊的大型儀器，技術難度大，難以在臨床中普及應用。因此，針對上述問題，如能開發出一種基於新型探針技術，對多種病原菌基因組進行並行檢測的快速、特異、簡便的分子診斷學方法，對推進分子診斷學技術的實用化顯然具有十分重要的意義。Applied Gene Technologies公司的專利名稱為「髮夾形核酸探針技術」(NucleicAcid Hairpin Probes),專利號為6380377涉及到一種莖環形DNA探針技術,與標準的單鏈核酸探針相比結構更穩定，酶反應更高效，對錯配更加敏感，產生了更少的非特異性靶位結合。這些優點都提高了基因分析的特異性。與傳統的PCR、固相核酸雜交等技術相比，該技術具有更為突出的優點檢測效率高，檢測速度快，該技術同時進行分子識別和級聯信號放大，可在10分鐘內完成核酸檢測；反應體系簡單，無需酶及其他複雜的分子生物學試劑；單管反應，所有檢測在單一閉管中進行，操作步驟簡單，並且有效地避免了傳統技術存在的實驗室汙染問題；該方法還適合與其他檢測方法整合。突光共振能量轉移(Fluorescenceresonance Energy Transfer, FRET)技術是指當一個螢光分子(又稱為供體分子)的螢光光譜與另一個螢光分子(又稱為受體分子)的激發光譜相重疊時，且供、受體空間距離相近時(一般為7 IOnm)，則供體螢光分子的激發能誘發受體分子發出螢光，同時供體螢光分子自身的螢光強度衰減，這種現象被稱為螢光共振能量轉移。FRET技術具有靈敏度高、專屬性強、重現性好等特點，並能避免散射光的影響，比常規螢光法和共振光散射法具有更強的抗幹擾能力。FRET技術已被廣泛應用於生物及醫學研究等方面。FRET探針即共振能量轉移的供-受體對，主要分為以下幾類螢光蛋白，有機螢光染料，鑭系染料和量子點，其中有機螢光染料種類繁多，應用廣泛，可根據需要選擇適合的染料，並可以和其它類探針配對使用。
發明內容
本發明設計了一種非對稱髮夾探針鏈反應技術，巧妙地結合了分子雜交的高特異性和鏈式聚合的高效性，通過DNA聚合釋放的自由能驅動分子級聯放大，並將高靈敏的多色螢光共振能量轉移技術引入到鏈式反應中，從而建立一種簡單、快速、靈敏的病原菌DNA檢測方法。非對稱多色螢光髮夾探針鏈反應在病原菌DNA檢測中的應用，包括液相雜交鏈反應體系，所述反應體系中同時加入有非對稱髮夾探針I和非對稱髮夾探針2以及待測靶序列，其中非對稱髮夾探針1，包括迴文序列、兩條莖臂和連接於一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接於迴文序列的兩端且具有互補的核酸序列，所述迴文序列為與待測靶序列無關的序列，所述莖臂與其連接的粘性末端具有靶序列的互補核酸序列；其中非對稱髮夾探針2，包括迴文序列、兩條莖臂和連接於一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接於迴文序列的兩端且具有互補的核酸序列，所述迴文序列與其相連的一條莖臂具有靶序列，所述另一莖臂上相連的粘性末端具有和非對稱髮夾探針I中迴文序列的互補核酸序列，所述非對稱髮夾探針I的5』端和3』端分別標記螢光受體分子和螢光供體分子或非對稱髮夾探針2的5』端和3』端分別標記螢光供體分子和螢光受體分子。
所述螢光供體分子和螢光受體分子分別標註於非對稱髮夾探針2的兩端。所述螢光供體分子為有機螢光染料FAM和HEX，螢光受體分子為BHQl。所述非對稱髮夾探針I的粘性末端位於5』端，所述非對稱髮夾探針2的粘性末端位於3』端；或者所述非對稱髮夾探針I的粘性末端位於3』端，所述非對稱髮夾探針2的粘性末端5 』端。優選所述非對稱髮夾探針I的粘性末端位於5』端，所述非對稱髮夾探針2的粘性末端位於3』端。 所述粘性末端為6-8個鹼基。所述待測靶序列為細菌的16S rDNA序列。所述細菌為銅綠假單胞菌，所述非對稱髮夾探針I、非對稱髮夾探針2和待測靶序列分別為PA-HlCGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC,PA-H2 ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT,Tpa :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。所述細菌為肺炎克雷伯菌，所述非對稱髮夾探針I、非對稱髮夾探針2和待測靶序列分別為KP-Hl GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC,KP-H2 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG,Tkp :AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。非對稱髮夾其基本原理是兩條特異性自組裝探針由靶核酸特異序列和一迴文序列組成，在無靶序列存在的情況下，處於亞穩定的髮夾結構，而一旦加入待測靶序列，即觸發無需酶參與的鏈式聚合反應，此時特異性自組裝探針的靶核酸特異序列部分與對應靶核酸位點結合，其餘探針則兩兩復性成兩段均為迴文序列的部分雙鏈探針，在分子識別雜交的同時大幅度地增強檢測信號，從而實現了待測靶序列的快速檢測。本研究即聯合非對稱髮夾探針鏈反應技術和FRET技術，建立了一種基於非對稱多色螢光髮夾探針鏈反應技術的病原菌檢測技術。在此優選的方法中，將有機螢光染料(FAM和HEX)作為螢光供體，BHQl作為螢光受體分別標記於髮夾探針兩端，當體系中無靶序列存在時，髮夾探針處於亞穩定狀態，兩基團構成FRET對，無螢光信號產生；而當靶序列加入反應體系觸發鏈式聚合反應時，髮夾結構打開，產生螢光信號，並且由於是線性放大，螢光信號強度與靶序列拷貝數成正比(如圖I所示)。在發明方法將高靈敏的多色螢光共振能量轉移技術引入到鏈式反應中，從而建立一種簡單、快速、靈敏的病原菌DNA直接檢測方法，克服了原非對稱髮夾探針進行鏈式反應時瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測結果靈敏度較低的缺陷。在本發明的實施例中，針對細菌的特異性核酸靶序列，設計多重特異性非對稱髮夾探針，結合FRET技術，提供了一種高效、靈敏的信號檢測方法，可實現快速並行檢測細菌的目的。
圖I.非對稱髮夾探針鏈反應技術原理圖
圖中H1、H2L、I :髮夾探針I、髮夾探針2、待測靶序列；A和a、B和b、C和c為互補
核酸序列， 是螢光受體,★是熒螢光供體，圖2:PCR擴增產物，M DL2,000DNA maker, K :KpnPCR 產物，P P. aerPCR 產物，-:空白對照圖3 :PCR擴展產物酶切，M DL 2，OOODNAmaker，K* Kpn 酶切產物，P* P. aer 酶切產物，K Kpn PCR 產物，P P. aer PCR 產物，圖4 PA組不同濃度靶序列螢光HCR，其中，A :無靶序列存在；B :靶序列濃度為IuM5C :靶序列濃度為0. 5uM；D :靶序列濃度為0. IuM5E :靶序列濃度為0.05 u M ；F :靶序列濃度為0. 01 u M，圖5 KP組不同濃度靶序列螢光HCR，其中，A :無靶序列存在；B :靶序列濃度為IuM5C :靶序列濃度為0. 5uM；D :靶序列濃度為0. IuM5E :靶序列濃度為0.05 u M ；F :靶序列濃度為0. 01 u M，圖6 PA組不同濃度不對稱PCR產物的螢光HCR，其中A :1 ii I 單鏈 DNA ；B 2u I 單鏈 DNA ；C 3u I 單鏈 DNA ；D 4u I 單鏈 DNA ；E 5 u I單鏈DN A ;F :6 ill單鏈DN A ；G :無單鏈DNA存在；H :無探針存在圖7 KP組不同濃度不對稱PCR產物的螢光HCR，其中A :1 ii I 單鏈 DNA ；B 2u I 單鏈 DNA ；C 3u I 單鏈 DNA ；D 4u I 單鏈 DNA ；E 5 u I單鏈DN A ;F :6 ill單鏈DN A ；G :無單鏈DNA存在；H :無探針存在。
具體實施例方式本發明的原理如圖I所示。(A)待測靶序列I從探針Hl的粘性末端開始發生嚴格鹼基配對的鏈置換反應從而打開探針的髮夾結構，產生新的粘性末端；(B)Hl的粘性末端與H2L的粘性末端發生反應繼續打開探針的髮夾結構，猝滅基團和報告基團間距離增大，產生螢光信號，繼而探針Hl和H2L之間發生交替雜交反應，形成鏈式聚合體大幅度放大信號。本發明的具體實施例主要針對於兩種病原菌，本領域技術人員可以按照本發明的原理，將其應用於任何微生體的檢測，只要找到合適的特異性的待測靶序列。I、特異性非對稱HCR髮夾探針的設計米用Array Designer 4. 0和Primer Premier 5. 0軟體設計非對稱髮夾式探針，用Omiga 2. 0軟體進行探針間、探針與靶序列的互補性分析，設計探針的時候，序列中間需要標記猝滅基團的位置上對應的鹼基需設計為T，以便使猝滅基團能夠連接到探針上。設計的備選探針序列提交Genbank資料庫進行特異性分析，並將設計好的探針提交http://mfold. rna. albany. edu/網站進行二級結構的預測,進一步驗證了設計探針的特異性和有效性。表I :探針和靶序列設計 綠膿桿菌HCR探針
PA-Hl__CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC_
PA-H2L~^CCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGTACTTTg
Tpa~^CCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG
肺炎克雷伯菌HCR探f
KP-HI~~GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC
KP-H2L~^ACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG
TkpAACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC2、將提取的基因組DNA進行PCR實驗，製備單鏈PCR產物。引物16S_a 5』端標記PO4基團，以利於下遊進行酶切反應。反應體系如下表2 :PCR擴增反應體系
reagentper sample vol([jl)
TaKaRa Ex Taq(5U/^il)0.25 IOXPCR buffer(Mg2+ Free) 5
MgC12(25mM)4
dNTP mixture(各 2.5mM)4模板DNA I
16s-s(4uM)4
16s-a(4uM)2
Sterile dd H2029.75
total volume50反應條件如下預變性94°C，5min ;變性 94。。，60s ;退火 53°C，45s ;延伸 72°C，45s ；30 個循環；延長 72°C，10min，4°C保存。PCR反應產物進行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳，每孔5. 0 ill上樣。實驗結果如圖2所示，用所設計的通用引物進行PCR擴增，電泳可見明顯目的條帶，擴增產物可用於酶切實驗。3, A-核酸外切酶消化PCR產物將PCR產物用入-核酸外切酶消化，製備單鏈DNA (ssDNA)。
反應體系為取45iil PCR反應產物，加入5 ii I IOXReacton Buffer,再加入IOU入-核酸外切酶。
反應條件將反應體系置於37°C水浴5min。於80°C水浴中終止反應。其結果如圖3所示，PCR產物經入-核酸外切酶消化後，雙鏈DNA大量減少，酶切效率較高，所得單鏈DNA可用於進行下遊實驗。4、不同濃度靶序列螢光HCR實驗3. 0 ill螢光HCR反應體系包括40uM的探針H10. I u I ；40uM的探針H2L 0. I ;
3X HBVbuffer I u I ;無菌水0. 8 u I ;不同濃度的靶序列I l.Ou I0反應條件如下99°C,8min ;50°C，lh ;4°C保存。將HCR反應產物轉移至毛細管內，3，OOOrpm離心2min.。將毛細
管至於導致螢光顯微鏡下觀察螢光並照相。實驗結果如圖4、圖5所示，所設計的HCR特異性探針均可成功啟動雜交鏈反應，發生無需酶作用的鏈式反應，使得髮夾探針結構打開，螢光供體分子在一定波長的光的激發光下發出螢光。當初始靶序列濃度大於或等於0. IyM時，可觀察到明顯螢光，即12iU反應體系中靶序列達0. 4pmol時可以檢測到螢光，說明所設計的探針具有較好的特異性和敏感性。5、單鏈PCR產物的螢光HCR實驗用以上不對稱PCR方法製備的單鏈DNA為模板，進行螢光HCR實驗。反應體系如下表3 :單鏈PCR產物的螢光HCR反應體系
權利要求
1.非對稱多色螢光髮夾探針鏈反應在病原菌DNA檢測中的應用，包括液相雜交鏈反應體系，所述反應體系中同時加入有非對稱髮夾探針I和非對稱髮夾探針2以及待測靶序列，其中非對稱髮夾探針1，包括迴文序列、兩條莖臂和連接於一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接於迴文序列的兩端且具有互補的核酸序列，所述迴文序列為與待測靶序列無關的序列，所述莖臂與其連接的粘性末端具有靶序列的互補核酸序列；其中非對稱髮夾探針2，包括迴文序列、兩條莖臂和連接於一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接於迴文序列的兩端且具有互補的核酸序列，所述迴文序列與其相連的一條莖臂具有靶序列，所述另一莖臂上相連的粘性末端具有和非對稱髮夾探針I中迴文序列的互補核酸序列，所述非對稱髮夾探針I的5』端和3』端分別標記螢光受體分子和螢光供體分子或非對稱髮夾探針2的5』端和3』端分別標記螢光供體分子和螢光受體分子。
2.根據權利要求I所述的應用，所述螢光供體分子和螢光受體分子分別標註於非對稱髮夾探針2的兩端。
3.根據權利要求2所述的應用，所述螢光供體分子為有機螢光染料FAM和HEX，螢光受體分子為BHQl。
4.根據權利要求I所述的應用，所述非對稱髮夾探針I的粘性末端位於5』端，所述非對稱髮夾探針2的粘性末端位於3』端。
5.根據權利要求I所述的應用，所述粘性末端為6-8個鹼基。
6.根據權利要求I所述的應用，所述待測靶序列為細菌的16SrDNA序列。
7.根據權利要求I所述的應用，所述細菌為銅綠假單胞菌，所述非對稱髮夾探針I、非對稱髮夾探針2和待測靶序列分別為PA-HlCGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC,PA-H2 : ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT，Tpa :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。
8.根據權利要求I所述的應用，所述細菌為肺炎克雷伯菌，所述非對稱髮夾探針I、非對稱髮夾探針2和待測靶序列分別為KP-Hl GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC,KP-H2 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG,Tkp :AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。
全文摘要
本發明涉及「非對稱多色螢光髮夾探針鏈反應在病原菌DNA檢測中的應用」，屬於生物技術檢測領域。本發明聯合非對稱髮夾探針鏈反應技術和FRET技術，建立了一種基於非對稱多色螢光髮夾探針鏈反應技術的病原菌檢測技術。當體系中無靶序列存在時，髮夾探針處於亞穩定狀態，兩基團構成FRET對，無螢光信號產生；而當靶序列加入反應體系觸發鏈式聚合反應時，髮夾結構打開，產生螢光信號，並且由於是線性放大，螢光信號強度與靶序列拷貝數成正比。在發明方法將高靈敏的多色螢光共振能量轉移技術引入到鏈式反應中，從而建立一種簡單、快速、靈敏的病原菌DNA直接檢測方法，克服了原非對稱髮夾探針進行鏈式反應時瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測結果靈敏度較低的缺陷。
文檔編號C12Q1/04GK102643910SQ20121010324
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月10日 優先權日2012年4月10日
發明者夏涵, 府偉靈, 梁盼盼, 黃慶 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院