一種提高豬細胞重編程能力的方法及應用的製作方法
2023-05-20 06:00:31 3
一種提高豬細胞重編程能力的方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高豬細胞重編程能力的方法及應用，屬於細胞移植和胚胎發育【技術領域】。本發明所提供的方法是在獲取並培養豬卵母細胞和豬胎兒成纖維細胞後，進行體細胞核移植，最後進行iPS誘導並進行鹼性磷酸酶染色。方法中利用小分子藥物GSK126進行了處理，其使用方式有以下三種：1)豬胎兒成纖維細胞在核移植前利用小分子藥物GSK126進行處理；2)在豬胎兒成纖維細胞體細胞核移植後，利用小分子藥物GSK126處理融合胚胎；3)用於iPS誘導的豬胎兒成纖維細胞，在培養成熟後接種前利用小分子藥物GSK126進行處理。本發明所提供的方法可以顯著提高克隆胚胎的發育率和iPS誘導效率，提高幅度分別達到44.7％和111.3％。
【專利說明】一種提高豬細胞重編程能力的方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種提高豬細胞重編程能力的方法及應用，屬於細胞移植和胚胎發育
【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 體細胞核移植技術是一種細胞重編程技術，自從克隆羊"Dolly"誕生以來，該技術 先後在多種哺乳動物上取得成功，但克隆效率普遍很低，平均在〇. 1% -2. 0%之間。為提高 核移植效率，研究人員在核移植技術程序、卵母細胞成熟質量、體外胚胎培養條件、供核細 胞的篩選和預處理等方面進行了大量的研究，雖然取得了一定進展，但克隆效率仍然有待 提高。目前認為克隆效率低下的最主要原因是體細胞核重編程不完全。體細胞核重編程是 指供體細胞核移入卵母細胞後停止本身的基因表達程序，恢復為胚胎發育所必需的特定基 因表達程序。這個過程主要是卵母細胞對供體細胞表觀遺傳修飾進行重新編寫，其中包括 染色體重塑、DNA甲基化重建、組蛋白修飾改變和印記基因表達調控等。如果體細胞核移植 過程中，供體細胞的組織特異的表觀遺傳修飾不能被有效地消除，將會影響胚胎的正常發 育。因此促進體細胞核表觀遺傳重編程將有助於提高核移植效率。
[0003]目前，已經發現了一些藥物處理供體細胞或克隆胚胎能夠在一定程度上提高克隆 效率，如甲基化或去乙醯化抑制劑（5-氮胞苷（542六-(1〇，曲古抑菌素4〇^六)）。542六-況 和TSA通過促進甲基化和乙醯化水平的重編程來提高克隆效率。但這些藥物都沒有徹底解 決克隆效率低下的問題。
[0004] 採用甲基化或去乙醯化抑制劑處理供體細胞或克隆胚胎，通過調節甲基化和乙醯 化水平不能有效的提高克隆效率的原因是：導致克隆胚胎發育率低下的核移植重編程異常 是多方面的，不止包括甲基化和乙醯化水平異常，雖然甲基化或去乙醯化抑制劑的預處理 能夠改善核移植重編程的某些方面，但要想讓克隆效率達到一個更高水平，人們必須從更 多角度進行探索促進核移植重編程的方法。
[0005]H3K27me3是一種重要的組蛋白修飾，對基因表達有抑制作用。在豬體外受精胚胎 (IVF)中，H3K27me3在Ι-cell位於雌原核中，在2-cell以後水平急劇下降，4-cell以後一 般檢測不到其存在，直到晚期囊胚才在滋養層細胞中又開始出現。人們一般認為H3K27me3 在早期胚胎的迅速擦除有利於早期胚胎（特別是合子基因激活）時期的基因表達。但在豬 克隆胚胎中，H3K27me3的分布情況，即H3K27me3是否被有效的重編程還沒有被報導。
[0006] 誘導多能性幹細胞（iPS)技術是體細胞核移植技術以外另一種細胞重編程技術。 它通過人為向細胞中導入幾個外源基因使細胞命運發生改變。但是目前iPS技術誘導效率 普遍偏低。雖然iPS技術和核移植技術的技術路徑和原理有著很大的不同，但是這兩種方 法的重編程過程卻有著很大的相似性，都需要克服源頭細胞的分化狀態的表觀修飾來達到 多能性狀態。所以提高克隆效率的方法也有可能能夠提高iPS誘導效率。
[0007]GSK126是一種高效和特異性的EZH2的小分子抑制劑，能夠降低H3K27me3的整體 水平，GSKl26可以作為治療EZH2突變的淋巴瘤的藥物。但是，在重編程領域一直沒有應用， 目前尚未發現GSK126可用於提高胚胎發育或iPS誘導效率的作用。
【發明內容】
[0008] 為解決上述問題，本發明提供了一種提高豬細胞重編程能力的方法，採取的技術 方案如下：
[0009] -種提高豬細胞重編程能力的方法，是在獲取並培養豬卵母細胞和豬胎兒成纖維 細胞後，進行體細胞核移植，最後進行iPS誘導並進行鹼性磷酸酶染色，其特徵在於，以下 列任意一種方式使用小分子藥物GSK126 :
[0010]1)豬胎兒成纖維細胞在核移植前利用小分子藥物GSK126進行處理；
[0011] 2)在豬胎兒成纖維細胞體細胞核移植後，利用小分子藥物GSK126處理融合胚胎；
[0012] 3)用於iPS誘導的豬胎兒成纖維細胞，在培養成熟後接種前利用小分子藥物 GSK126進行處理。
[0013] 1)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用0. 5-3. 0μM的GSK126處理 40-50h。
[0014] 優選地，1)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用0· 5μM的GSK126處 理 48h。
[0015] 2)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用0. 05-0. 15以11的651(126處理 18-30h。
[0016] 優選地，2)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用0· 1μM的GSK126處 理 24h。
[0017] 所述方法用於提高克隆胚胎的發育率。
[0018] 3)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用0. 5-3. 0μM的GSK126處理 40-50h。
[0019] 優選地，3)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用0. 75yi^^GSK126& 理 48h。
[0020] 所述方法用於提高誘導多能幹細胞的誘導效率。
[0021] 本發明有益效果：為解決現有技術中細胞核移植效率低的問題，克服現有技術通 過甲基轉移酶或去乙醯化酶抑制劑處理體細胞或核移植胚胎不能全面促進核移植重編程 的局限性，本發明通過對豬卵裂期的受精胚胎和克隆胚胎的H3K27me3的分布模式進行比 較，發現豬克隆胚胎中的H3K27me3不能被正常重編程，早期克隆胚胎的H3K27me3水平高 於IVF胚胎。小分子藥物GSK126是一種高效和特異性的EZH2的小分子抑制劑，能夠降低 H3K27me3的整體水平，GSK126常作為治療EZH2突變的淋巴瘤的藥物。發明人在研究過程 中意外發現，小分子藥物GSK126對提高克隆胚胎的發育率和iPS的誘導效率具有積極作 用。據此，本發明通過用小分子藥物GSK126處理供體細胞或克隆胚胎，促進H3K27me3的 重編程，最終使得豬克隆胚胎的發育率提高了 44.7%。本發明在誘導豬多能性幹細胞時用 GSK126進行處理，使得豬多能性幹細胞誘導效率，提高幅度達到111. 3%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1為豬胎兒成纖維細胞（PEF)經不同濃度GSK126處理48後細胞數及H3K27me3 水平變化；
[0023] (a，GSK126濃度對PEF細胞數的影響；b，GSK126濃度對H3K27me3水平影響）。
[0024] 圖2為經GSK126處理的PEF核移植後l-cell、2-cell克隆胚胎的H3K27me3水平。
[0025] 圖3為克隆胚胎經GSK126處理24h後的H3K27me3水平。
[0026] 圖4為經GSK126處理的PEF誘導iPS時的鹼性磷酸酶（AP)陽性克隆數。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。
[0028] 以下實施例中所用試劑、材料、儀器和方法，未經特別說明，均為本領域中常用的 試劑、材料、儀器和方法。
[0029] 實施例1
[0030] 1.豬卵母細胞的成熟培養
[0031] 由屠宰場收集卵巢並用37°C的生理鹽水運送回實驗室，抽取3_5mm直徑的有腔卵 泡收集卵丘卵母細胞複合體，實體顯微鏡下挑選具有完整的三層以上卵丘細胞的卵母細胞 用於成熟培養；成熟培養的培養條件為38. 5 °C，5 %二氧化碳、95 %空氣的氣體環境，飽和 溼度；成熟培養42小時後採用0. 5%透明質酸酶去除卵丘細胞，獲的MII期卵母細胞，作為 核移植受體。
[0032] 2.豬胎兒成纖維細胞的獲得和培養
[0033] 無菌操作取35天豬胎兒組織，採用常規0. 25%胰蛋白酶（Gibco)消化法分離組織 細胞，DMEM(Gibco)添加20%胎牛血清原代培養，DMEM添加10%胎牛血清傳代培養，培養條 件為38. 5°C，5%二氧化碳、95%空氣的氣體環境，飽和適度；採用3-5代的接觸抑制的胎兒 成纖維細胞消化為單個懸浮細胞進行核移植。
[0034] 3.體細胞核移植
[0035] 豬體細胞核移植採用融合法進行，過程如下：盲吸法去除MII卵的紡錘體及第一 極體，體細胞注於透明帶下，並使之與卵母細胞質膜緊密接觸，直流電擊（I. 2kv/cm、30μs、 2次脈衝）誘導體細胞與去核卵胞質融合形成重構胚並使之被激活，培養於ΡΖΜ-3培養液 中，培養條件為：38. 5 °C，5 %C02，飽和溼度。培養至48h計算卵裂率，146h計算囊胚率。5mg/ LHoechst33342對囊胚進行染色5min，螢光鏡下觀察記囊胚細胞數；所用工具、液體、儀 器如下：固定管內徑為30μm，注射管內徑25μm;卵母細胞操作液為含5mg/mlBSA的改進 型TCM199 (Gibco)，卵母細胞顯微操作液為添加7. 5μg/ml細胞鬆弛素B(CB)的操作液，融 合液為含I.OmM鈣離子和0.ImM鎂離子的3%甘露醇溶液；顯微作業系統為日本Narishige 公司NT-88NE系統；融合儀為美國BTX公司BTX2001型電細胞融合儀。
[0036] 4.iPS誘導及鹼性磷酸酶染色
[0037] 採用鼠源6因子方法誘導1卩5(聽1叩，了.，611，〇.，他〇，丄，了1&，￥.，父脫，8.，"11，!1· ,Ma, J. , Wei, R. , Hai, T. , Kong, Q. , Bou, G. , Xia, P. , Zhou, Q. , Wang, L. , and Liu, Z. (2013). Tbx3and Nr5alpha2play important roles in pig pluripotent stem cells. Stem Cell Rev.9,700 - 708.)。按照之前方法製備逆轉錄病毒和飼養層細胞。P3或P4代的PEF用於 誘導iPSCs。Day-I :接種I X IO5PEF到每個6孔板的孔中；DayO :按MOI為5的病毒量把6 個因子的病毒同時加到事先接種好的PEF裡，同時加8ug/mL polybrene ;Dayl :換液，從今 天開始可以加青黴素鏈黴素的培養液；Day3:換液，觀察細胞，並準備飼養層；Day4:感染細 胞長至90%以上的匯合度時，將PEF傳到飼養層上，用10%FBS的DMEM培養液培養；Day5: 棄去10 %FBS的DMEM培養液，用X培養液培養，以後每天換液；X培養液配方為（50mL): 19mLK0-DMEM、12.25mLDMEM/F12、12.25mLNeurabasal、5mLK0SR、250uLB27、125uLN2、 250uL穀氨醯胺（2mM)、25uLβ-巰基乙醇、500uL雙抗、250uL非必需胺基酸、4uLbFGF、5uL hLif、31.25uL2%BSA。Day9:做鹼性磷酸酶染色。先用PBS洗三遍，再用4%多聚甲醛室 溫固定90s，PBS洗三次，每次5分鐘（或放置室溫15分鐘），用lOOmmol/LTris-HCl(pH 9. 5)，lOOmmol/LNaCl，50mmol/LMgC12混合緩衝液洗5分鐘，在ImlPBS中加入四氮唑藍 (NBT) 4. 5μ1和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽（BCIP) 3. 5μ1，避光顯色20分鐘?1小時，隨 時觀察染色情況。用PBS洗滌3遍，直接在倒置顯微鏡下即可觀察，照相。
[0038] 實施例2
[0039] 1.豬卵母細胞的成熟培養（同實施例1)
[0040] 2.豬胎兒成纖維細胞的獲得和培養
[0041]PEF在核移植前分別用0. 5μΜ、0. 75μM和3μMGSK126處理48h。其餘同實施例 1〇
[0042] 3.體細胞核移植（同實施例1)
[0043] 實施例3
[0044] 1.豬卵母細胞的成熟培養（同實施例1)
[0045] 2.豬胎兒成纖維細胞的獲得和培養（同實施例1)
[0046] 3.體細胞核移植
[0047] 融合後的胚胎用0. 05μM、0. 1μM和0. 15μMGSK126處理24h。之後將胚胎置於 正常PZM-3中繼續培養。其餘同實施例1。
[0048] 實施例4
[0049] 1.豬胎兒成纖維細胞的獲得和培養（同實施例1)
[0050] 2.iPS誘導及鹼性磷酸酶染色
[0051] 用於iPS誘導的PEF在往6孔板接種前用0. 5μM、0. 75μM和3μMGSK126處理 48h。其餘同實施例1。
[0052] 實施例5
[0053] 1.不同濃度GSK126對細胞數和H3K27me3水平變化的影響
[0054] 為了降低供體細胞的H3K27me3水平，我們用不同濃度的GSK126處理PEF48h。圖 1為PEF經不同濃度GSK126處理48後細胞數（A)及H3K27me3水平⑶變化。從圖1中可 以發現0-3μM時各組的細胞狀態良好，並且各組的細胞數也沒有差異（A)。對各組細胞的 H3K27me3水平進行檢測，發現GSK126能夠降低PEF的H3K27me3水平，特別是濃度XX5μM 時效果較為顯著（Ρ〈〇. 05) (B)。
[0055] 2. GSK126處理PEF對克隆胚胎發育的影響
[0056] 表1經GSK126處理的PEF的克隆胚胎發育率
[0057]
【權利要求】
1. 一種提高豬細胞重編程能力的方法，是在獲取並培養豬卵母細胞和豬胎兒成纖維細 胞後，進行體細胞核移植，最後進行iPS誘導並進行鹼性磷酸酶染色，其特徵在於，以下列 任意一種方式使用小分子藥物GSK126 : 1) 豬胎兒成纖維細胞在核移植前利用小分子藥物GSK126進行處理； 2) 在豬胎兒成纖維細胞體細胞核移植後，利用小分子藥物GSK126處理融合胚胎； 3) 用於iPS誘導的豬胎兒成纖維細胞，在培養成熟後接種前利用小分子藥物GSK126進 行處理。
2. 權利要求1所述方法，其特徵在於，1)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是 利用 0? 5-3. 0 ii M 的 GSK126 處理 40-50h。
3. 權利要求2所述方法，其特徵在於，所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用 0? 5iiM 的 GSK126 處理 48h。
4. 權利要求1所述方法，其特徵在於，2)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是 利用 〇? 05-0. 15 ii M 的 GSK126 處理 18-30h。
5. 權利要求4所述方法，其特徵在於，所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用 0. liiM 的 GSK126 處理 24h。
6. 權利要求1-5所述方法，其特徵在於，用於提高克隆胚胎的發育率。
7. 權利要求1所述方法，其特徵在於，3)中所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是 利用 0? 5-3. 0 ii M 的 GSK126 處理 40-50h。
8. 權利要求7所述方法，其特徵在於，所述利用小分子藥物GSK126進行處理，是利用 0. 75 ii M 的 GSK126 處理 48h。
9. 權利要求1，7和8所述方法，其特徵在於，用於提高誘導多能性幹細胞的誘導效率。
【文檔編號】C12N15/877GK104357483SQ201410613163
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】孔慶然, 解炳騰, 劉忠華 申請人:東北農業大學