一種檢測禽流感病毒的實時螢光rt-hda試劑盒及引物的製作方法

2023-08-06 00:37:06 2

專利名稱：一種檢測禽流感病毒的實時螢光rt-hda試劑盒及引物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測禽流感病毒的實時螢光RT-HDA試劑盒及引物，屬於檢驗檢疫領域。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒引起的禽類感染和/或疾病綜合症。禽流感歷史悠久，第一次發現是1878年,Perroncito首次報導禽流感在義大利發生，已被國際獸醫局(OIE)列為A類烈性傳染病，世界衛生組織(WHO)認為Al是對人類造成潛在威脅的最主要的疾病之一，我國也將高致病性禽流感(HPAI)列入一類動物傳染病進行防制。近些年來，我國很多地區都存在禽流感的流行，給養禽業帶來 不同程度的打擊，迄今為止已經發生多起高致病性禽流感感染人致死的事件，對養殖業發展和人類健康造成巨大威脅。目前，全世界已有15個國家和地區發現禽流感人類感染病例，死亡率高達60%以上。因此，建立禽流感快速檢測技術，將對禽流感的監測與防控發揮重要作用。目前，我國使用的禽流感檢測標準有2項行標和7項國標,主要檢測方法有病毒分離、各類血清學試驗及免疫學試驗(瓊擴、血凝血抑、ELISA)、分子生物學檢測方法(RT-PCR和螢光RT-PCR)等。但是，每種檢測方法均存在一定的局限性。傳統的病毒分離和血清學方法繁瑣耗時，不適於流行病學普查和高通量口岸檢疫。PCR和螢光PCR方法已經得到廣泛應用，並在疾病檢測和過境檢疫中發揮了重要作用。但是，傳統的PCR技術仍然存在一些不足需要昂貴的設備，尤其是螢光PCR儀造價不菲；容易受到多種因素的影響；擴增時間往往需要幾個小時。上述問題使得傳統的PCR技術難以在基層推廣應用，不利於疾病的「早發現、早報告、早處理」。近年來，分子診斷技術日新月異，產生了多種新型分子擴增技術，推動著分子診斷技術向操作簡單、儀器要求不高的方向發展。其中，依賴解旋酶恆溫基因擴增技術(Helicase-Dependent Isothermal Amplification,HDA)是 2004 年 BioHelix 的研究人員模擬動物體內DNA的複製機制發明的一種新的體外恆溫擴增技術。該技術利用DNA雙鏈解旋酶打開雙鏈DNA，同時在單鏈結合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，擴增靶片段，實現目的基因的體外擴增。此外，實時螢光定量檢測病原技術是近些年來應用越來越廣泛的一種檢測方法。使用SyberGreen螢光染料，結合溶解曲線的分析，可對螢光PCR進行實時定量檢測。若將螢光定量方法與HDA技術結合，建立實時螢光RT-HDA方法，則能將兩種技術的優勢發揮至最大。實時螢光RT-HDA技術的優勢I. HDA技術與普通PCR技術相比，具有很多優勢。HDA技術的引物設計比較簡單易學，由於是恆溫擴增技術，不論檢測何種病原均可使用同一種反應溫度，因此，即可在同一條件下分管同時檢測不同的病原，也可建立多重HDA方法同時檢測多種病原，不需要特意將不同擴增片段的退火溫度設計成一樣。此外，由於體系中使用了耐高溫的BstDNA擴增酶，使得HDA技術具有更高的特異性和敏感性。HDA技術與其他恆溫擴增技術相比，是一種真正的恆溫擴增方法，完全不需95°C變性，因而，該技術不需要PCR儀，操作簡單方便，非常適合基層檢測和現場快速診斷。2.本發明使用EvaGreen作為實時定量HDA方法中的DNA結合染料。EvaGreen是一種可結合於雙鏈DNA小溝中的螢光染料，與雙鏈DNA結合後，其螢光大大增強，這一性質使其用於擴增產物的檢測非常理想。該染料的諸多優點使它遠勝於目前常用的SYBRGreen I。除了有相似的光譜特性，EvaGreen有三個主要特點使它區別於SYBRGreen
I:①EvaGreen對PCR的抑制性遠小於SYBRGreen I，因此，使用EvaGreen進行的qPCR實驗可以使用快速PCR步驟。同時，EvaGreen在實驗中可以使用較高的濃度，從而獲得遠強於SYBRGreen I的擴增信號。較高濃度的EvaGreen也消除了 「染料重分布」的缺陷，使EvaGreen既可用於多重PCR,也可用於高解析度(高清晰)熔解曲線分析(HRM)。②EvaGreen的穩定性極強。在正常的儲存、操作和PCR過程中不會被破壞。在緩衝溶液中的染料可以安全的儲存在室溫或冰箱裡，也可以反覆凍融。與之相反，SYBRGreen I不穩定而且降解後對PCR的抑制性更強。③EvaGreen降低了細胞膜透性，因而比SYBRGreen I更加安全。獨 立實驗室的測試結果顯示，EvaGreen既沒有誘變性也沒有細胞毒性，更符合生物安全要求。3.將EvaGreen螢光染料加入HDA反應體系，建立實時螢光HDA技術，利用S型擴增曲線結合溶解曲線分析，可對特定病原核酸進行檢測。實時螢光HDA的反應程序設定簡單、操作方便快捷，不僅進一步提高原有HDA方法的靈敏度，還能對檢測過程進行實時監測，可在更短的時間內得知樣本的檢測結果。使用標準品建立標準曲線，還可對樣品進行定量檢測。總之，與同類新型PCR技術相比，實時螢光HDA技術更簡單高效，具有靈敏度高、特異性強、快速診斷、高通量、操作簡單、重複性好、自動化程度高、易標準化操作和試驗的生物安全性高等突出優點，靈敏度比普通PCR靈敏度高100倍以上，能夠最大限度的避免交叉汙染，是一種嶄新的基因擴增方法，極具應用價值和市場前景。目前，國際上對於實時螢光HDA技術的研究尚處於起步階段，國內外還沒有關於實時螢光HDA檢測動物病毒的研究。我們將首次建立起快速檢測禽流感病毒的實時螢光HDA技術。該項研究成果將成為動物疫病分子診斷領域的突破性技術，是動物流感檢疫技術體系的進一步完善和發展。HDA技術的建立將真正實現簡單、便捷的臨床和實驗室診斷，適用於基層檢疫，可全面提升口岸檢疫的檢測能力，縮短檢疫時間，真正實現高通量檢測，為我國禽流感的有效防製作出重大貢獻。

發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供一組作為引物使用的、檢測禽流感病毒的寡核苷酸序列。本發明要解決的第二個技術問題是提供一種特異、靈敏、高效的檢測禽流感病毒的試劑盒。為解決第一個技術問題，本發明採用以下技術方案一組檢測禽流感病毒的引物，為序列表SEQ ID No : I和SEQ ID No :2所示的寡核苷酸序列，詳見表I。表I.引物序列
~I序列(5』 -3』)I序列表編號~
引物 I GTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAASEQ ID No. I
引物 II GACCTCCTTAGCCCCATGGAATGTTATSEQ ID No. 2注胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)。其中序列引物I和引物II分別為檢測禽流感病毒的正義引物和反義引物。為解決第二個技術問題，本發明採用以下技術方案一種檢測禽流感病毒的實時螢光RT-HDA試劑盒，保存於_20°C，由以下試劑組成 (I)TriZol 裂解液；(2) RT-HDA 反應液，其包括HDA 緩衝液、MgS04、NaCl、dNTP、引物 I、引物 II ;進一步地，優選為 IXHDA 緩衝液、3. 5mM MgSO4,40mM NaCl.O. 2ImMdNTP、IOOnM 引物 I、100nM 弓I物II ;其中，IXHDA緩衝液由10XHDA緩衝液稀釋製備而成，所述10XHDA緩衝液包括IOmmoI/L KCl、20mmol/L Tris-Cl (pH 8. 8,25° C);引物 I 的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO: I所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 2所示；(3)酶混合物，其包括DNA解旋酶、Bst DNA擴增酶和反轉錄酶，其中，所述DNA解旋酶10 μ g, Bst DNA擴增酶1000U,反轉錄酶優選為ThermoScript反轉錄酶，IOOU ；(4)突光染料包括 EvaGreenDye 和 Rox Reference Dye ；(5 )無RNA酶的滅菌純化水；(6)陰性對照無核酸滅菌水；(7)陽性對照為體外轉錄的非感染性RNA片段。回收禽流感病毒A/Duck/HB/(H5N1)株M基因的RT-PCR擴增產物，長度為1002bp，與pMD_T20載體(購自TAKARA公司)進行連接，轉化TOPlO感受態細胞，鹼裂解法提取質粒DNA，經PCR和酶切鑑定後獲得陽性重組質粒，命名為PMD-T20-AIV-M。以純化的質粒為模板，將質粒線性化之後，用Promega公司的 Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem_SP6 試劑盒進行體外轉錄；將體外轉錄產物用DNase除去其中的DNA模板後經TRIZOL提取後進行測定後，即得到製備禽流感病毒陽性對照品所需的RNA陽性對照品母液；禽流感病毒株A/Duck/HB/(H5N1)株M基因片段如序列表中SEQ ID NO 3所示。本發明還提供了一種檢測禽流感病毒實時螢光RT-HDA的方法，包括如下步驟I)提取樣品RNA;2)對提取的樣品RNA進行實時螢光RT-HDA擴增弓丨物序列為①5 』 -GTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAA-3 』②5， -GACCTCCTTAGCCCCATGGAATGTTAT-3，反應條件第一步66°C，5s；65°C，lmin55s (收集螢光)；40 60 個循環；第二步溶解曲線分析，使用螢光PCR儀默認程序。3)結果分析條件設定，讀取檢測結果。
閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點。不同儀器可根據儀器噪音情況進行調整。①質控標準，陰性對照無Ct值並且無擴增曲線。②陽性對照的Ct值應彡35. 0，並出現特定的S型擴增曲線，且溶解曲線出現單一峰值，並且單一峰在退火溫度附近。如陰性對照和陽性條件不滿足以上條件，此次實驗視為無效。③結果描述及判定陽性Ct值彡35.0，並出現特定的S型擴增曲線，且溶解曲線出現單一峰值，並且單一峰在退火溫度附近，表示樣本中存在禽流感病毒；
陰性無Ct值並且無擴增曲線，表明樣品中無禽流感病毒。本發明中發明人以實時螢光RT-HDA對模板進行檢測，驗證了該方法的特異性。本發明以通過對陽性對照提取RNA進行系列稀釋的模板檢測，開展了敏感性實驗。實驗結果顯示，最低可以檢測到10拷貝/反應的RNA模板量，具有較高的靈敏度。用該方法對實驗室採集保存的80份雞場拭子、30份組織病料和4份禽流感病毒增殖的尿囊液進行檢測。實驗結果表明，該方法是一種特異、靈敏、高效的檢測方法。這項技術在禽流感病毒的監控和診斷中都具有極大的應用前景，尤其對於基層養殖場或者實驗條件不能滿足檢驗檢疫要求的地區或實驗室。本發明的優點是首次將新型恆溫擴增技術結合螢光染料方法建立的實時螢光RT-HDA應用於禽流感病毒的檢測中，與AIV現有的檢測方法相比①HDA檢測方法更快、更便捷，安全可靠。傳統的病毒分離和血清學方法耗時較長，且存在生物安全危險性；HDA方法模仿體內天然的複製機制，安全性高，且反應快速，最多僅需2h即可完成檢測與螢光PCR相比，程序設定更簡單，不需要摸索退火溫度等反應條件，從技術層面上講更便於掌握和操作。且通過反應條件的優化，實時螢光RT-HDA方法最低可檢測至10個拷貝/反應的病毒核酸。該方法還對實驗室採集保存的80份雞場拭子、30份組織病料和4份禽流感病毒增殖的尿囊液進行了檢測，實驗結果表明，AIV實時螢光RT-HDA方法是一種特異、靈敏、高效的檢測方法。這項技術在禽流感病毒的監控和診斷中都具有極大的應用前景，是一種極具推廣應用價值的診斷工具。下面結合說明書附圖和具體實施方式
對本發明作進一步說明，凡依照本發明公開內容所做的任何本領域的等同替換，均屬於本發明的保護範圍。


圖I為AIV實時螢光RT-HDA反應體系優化後，得到的擴增曲線圖IA和溶解曲線分析圖IB ;其中，I :陽性對照；2 :陰性對照；圖2為檢測禽流感病毒的實時螢光RT-HDA檢測試劑盒的特異性試驗結果；其中，2A為擴增曲線圖，2B為溶解曲線分析圖；1 :禽流感病毒H5亞型；2 :禽流感病毒H7亞型；3 禽流感病毒H9亞型；4 :新城疫病毒；5 :雞傳染性支氣管炎病毒；6 :陰性對照；圖3為檢測禽流感病毒的實時螢光RT-HDA檢測試劑盒的靈敏性檢測結果；其中，3A為擴增曲線圖，3B為溶解曲線分析圖；Γ8 =IO8-L O拷貝/微升(依次作10倍梯度稀釋)9 :陰性對照。
具體實施例方式本發明所用禽流感病毒H5亞型、禽流感病毒H7亞型、禽流感病毒H9亞型、新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒，均為北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心保存。實施例I :HDA引物的設計與合成根據Genbank中登錄的禽流感病毒基因序列，用DNAMAN軟體進行比對分析，選擇AIV-M基因高度保守的區域，使用在線軟體Primer3 (http://frodo. wi. mit. edu/)進行引物設計，並結合01igo6. O軟體對引物進行分析評價，設計出針對禽流感病毒的通用型引物。引物序列同表I。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。實施例2 :禽流感病毒RNA的提取
使用RNA提取試劑提取禽流感病毒RNA。具體操作如下①取η個I. 5mL滅菌Eppendorf管，其中η為待檢樣品數、一管陽性對照及一管陰性對照之和，對每個管進行編號標記。②每管加入600μ L TRIZOL裂解液，然後分別加入待測樣本、陰性對照和陽性對照各200 μ L，一份樣本換用一個吸頭；再加入200 μ L三氯甲烷，混勻器上震蕩混勻5s。於4°C條件下，12000r/min 離心 15min。③取與①中相同數量的I. 5mL滅菌Eppendorf管，加入500 μ L異丙醇(_20°C預冷)，對每個管進行編號。吸取5. 3. 2離心後各管中的上清液轉移至相應的管中，上清液至少吸取500 μ L，注意不要吸出中間層，顛倒混勻。④於4°C條件下，12000r/min離心15min (Eppendorf管開口保持朝離心機轉軸方向放置)。輕輕倒去上清，倒置於吸水紙上，吸乾液體，不同樣品應在吸水紙不同地方吸乾。加入600 μ L 75%乙醇，顛倒洗滌。⑤於4°C條件下，12000r/min離心IOmin (Eppendorf管開口保持朝離心機轉軸方向放置)。輕輕倒去上清液，倒置於吸水紙上，吸乾液體，不同樣品應在吸水紙不同地方吸乾。⑥4000r/min離心10s，將管壁上的殘餘液體甩到管底部，用微量加樣器儘量將其吸乾，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉澱一面，室溫乾燥3min。不宜過於乾燥，以免RNA不溶。⑦加入11 μ L DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，冰上保存備用。提取的RNA須在2h內進行RT-PCR擴增或放置於_70°C冰箱備用。實施例3 :實時螢光RT-HDA的建立一、對引物濃度、MgSO4濃度和NaCl濃度分別進行了優化，建立了實時螢光RT-HDA的反應體系。按照實施例2方法獲得禽流感病毒RNA，模板濃度約為IO4拷貝/微升，進行實時螢光RT-HDA，優化反應體系。對各成分的優化範圍見表2，反應體系見表3，所用引物和探針序列見表I。表2AIV RT-HDA反應體系中各成分的優化範圍
權利要求
1.一組檢測禽流感病毒的引物，其特徵在於，該引物序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQID NO :2所示，其中SEQ ID NO :I為檢測禽流感病毒的引物I，SEQ ID NO :2為檢測禽流感病毒的引物II。
2.一種檢測禽流感病毒的實時螢光RT-HDA試劑盒，其特徵在於，由以下組分組成 (1)TriZol 裂解液； (2)RT-HDA反應液，其包括HDA緩衝液、MgS04、NaCl、dNTP、引物I、引物II ;其中，所述引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ IDN0:2所示； (3)酶混合物，其包括DNA解旋酶，BstDNA擴增酶和反轉錄酶； (4)突光染料包括EvaGreenDye 和 Rox Reference Dye ； (5)無RNA酶的滅菌純化水； (6)陰性對照無核酸滅菌水； (7)陽性對照為體外轉錄的非感染性RNA片段，其對應的DNA序列為序列表SEQIDNo. 3所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的實時螢光RT-HDA試劑盒，其特徵在於所述反轉錄酶為ThermoScript 反轉錄酶。
4.根據權利要求2所述的實時螢光RT-HDA試劑盒，其特徵在於所述RT-HDA反應液為 IXHDA 緩衝液、3. 5mM MgSO4,40mM NaCl、0. 21mM dNTP、100nM 引物 I 和 IOOnM 引物 II。
5.一種檢測禽流感病毒的PCR方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)提取樣品RNA； (2)對提取的樣品RNA進行實時螢光RT-HDA擴增； (3)反應條件 第一步66°C,5s ；65°C,lmin55s (收集螢光);40 60個循環； 第二步溶解曲線分析，使用螢光PCR儀默認程序； (4)結果描述及判定 ①質控標準，陰性對照無Ct值並且無擴增曲線； ②陽性對照的Ct值應<35. O,並出現特定的S型擴增曲線，且溶解曲線出現單一峰值，並且單一峰在退火溫度附近，如陰性對照和陽性條件不滿足以上條件，此次實驗視為無效； ③結果描述及判定 陽性Ct值< 35. O,並出現特定的S型擴增曲線，且溶解曲線出現單一峰值，並且單一峰在退火溫度附近，表示樣本中存在禽流感病毒； 陰性無Ct值並且無擴增曲線，表明樣品中無禽流感病毒。
全文摘要
本發明公開了一種檢測禽流感病毒的實時螢光RT-HDA試劑盒及引物。一組檢測禽流感病毒的引物，為序列表SEQ ID No1和序列表SEQ ID No2所示的寡核苷酸序列。本發明的優點是首次將新型恆溫擴增技術HDA應用於禽流感病毒的檢測中，與AIV現有的檢測方法相比①HDA檢測方法更快、更便捷，安全可靠。傳統的病毒分離和血清學方法耗時較長，且存在生物安全危險性；HDA方法模仿體內天然的複製機制，安全性高，且反應快速，最多僅需2h即可完成檢測；②與螢光PCR相比，程序設定更簡單，不需要摸索退火溫度等反應條件，從技術層面上講更便於掌握和操作。且通過反應條件的優化，實時螢光RT-HDA方法最低可檢測至10個拷貝/反應的病毒核酸。這項技術在禽流感病毒的監控和診斷中都具有極大的應用前景，是一種極具推廣應用價值的診斷工具。
文檔編號C12R1/93GK102876813SQ20121041477
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月25日 優先權日2012年10月25日
發明者蒲靜, 劉環, 喬彩霞, 高志強, 汪琳, 張偉, 谷強 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局