一株海洋蠟樣芽胞桿菌及其在水華魚腥藻防治方面的應用的製作方法

2023-05-19 16:08:26

本發明涉及環境微生物領域，一株具有分泌溶藻活性物質的海洋蠟狀芽孢桿菌hy339(bacilluscereushy339)及其在淡水藍藻水華魚腥藻生物防治領域中的應用。

背景技術：

當前階段藍藻水華的控制方法可分為物理、化學和生物方法。物理方法如超聲波除藻、氣浮除藻、過濾和機械清除等方法成本較高、費時費力、操作困難且往往治標不治本；化學方法包括化學藥劑法、光化學降解法和電化學法等，是目前較為成熟的除藻技術，但化學方法容易汙染環境、破壞生態系統，生物毒性大，容易造成藥物殘留和二次汙染，且長期使用會使藻類產生抗藥性。

所以，生物防控法越來越受到專家學者們的青睞。藍藻水華的生物防控過程中，微生物的利用至關重要，尤其以具有溶藻特性的微生物對藍藻水華的抑制發揮了重要作用。

水華魚腥藻是引起水華藍藻爆發的主要藻種之一，適應性強，就發生頻率和範圍來講，是僅次於微囊藻的有毒水華藍藻。對水華魚腥藻生長的抑制研究非常具有學術和應用價值，本領域的學者們致力於篩選出對水華魚腥藻的生長具有顯著抑制效果的溶藻細菌，同時研究其具有溶藻活性的次生代謝產物，開發微生物溶藻製劑，應用於藍藻水華問題的安全高效解決，對安全、經濟、高效地控制和治理水華具有重要價值。

技術實現要素：

為實現上述背景介紹中的問題，本發明提供了一株具有溶藻特性的海洋蠟樣芽胞桿菌hy339(bacilluscereushy339)及其代謝產物在水華魚腥藻生物防治中的應用。

本發明公開了一株具有溶藻特性的海洋蠟樣芽胞桿菌hy339(bacilluscereushy339)，保藏編號為cgmccno.14207。

進一步地，本發明提供了上述菌株hy339在水華魚腥藻生態防治中的應用。

進一步地，本發明提供了上述菌株hy339的發酵產物在水華魚腥藻生態防治中的應用。

進一步地，本發明提供了一種溶藻菌劑，所述溶藻劑中包含所述的菌株hy339。

進一步地，本發明提供了一種溶藻製劑，所述溶藻製劑中包含所述的菌株hy339的發酵產物，所述發酵產物為發酵液、發酵液濃縮物、發酵液粗提物或發酵液提取物。

優選地，菌液發酵條件為，菌株hy339接種於ph7.0的滅菌lb培養基中，25℃、150rpm條件下發酵5天得到菌株hy339發酵液，其中，lb培養基使用人工海水配製。

優選地，發酵產物萃取劑為乙酸乙酯混合5％體積比的丙酮，萃取體系中乙酸乙酯-丙酮混合液與發酵液的體積比為1:1，混合後進行震蕩5min，分離出的上層乙酸乙酯-丙酮混合液即為菌株hy339發酵液萃取液；萃取液以旋轉蒸發儀蒸乾後即為發酵液粗提物。

本發明所述的菌株hy339是海水裡分離出來的細菌，一般而言，海水細菌難以直接用於淡水水華防治。但本發明通過淡化培養發現，該菌可以適合低鹽度生長，且可在淡水條件下進行溶藻活動。

具體的菌株hy339的淡化培養方法如下：

①發酵培養所述的菌株hy339；

②取發酵液接種於不同鹽度培養基進行第二次發酵；

③以不同鹽度發酵液進行溶藻實驗。

其中，菌株hy339初始培養基為以人工海水配製的lb培養基，滅菌，發酵條件為：ph7.0，25℃、150rpm條件下發酵48h。

其中，淡化培養基鹽度梯度分別為0％、0.25％、0.5％、1％、2％和3.5％。結果表明菌株hy339雖然為海洋菌株，但在低鹽度條件下也可正常生長，可在淡水條件下進行溶藻活動。

本發明菌株hy339發酵液及發酵液粗提物對水華魚腥藻(anabaenaflos-aquae)的生長具有較強的抑制效果，且對菌株hy339的淡化培養並未影響其溶藻效果，有望開發新型水產抑藻菌劑並應用於淡水藍藻水華的生物防治領域。

附圖說明

圖1是本發明實施例1中篩選到的6株活性菌株對水華魚腥藻生長的抑制作用。

圖2是本發明實施例2中細菌發酵液以3％體積比添加時水華魚腥藻生物量4天變化圖。

圖3是本發明實施例3中細菌發酵液粗提物對水華魚腥藻藻生物量的影響。

圖4是本發明實施例4中不同鹽度培養條件下菌株hy339生長情況(490nm吸光度值)。

圖5是本發明實施例5中不同鹽度培養的菌株hy339發酵液以3％體積比添加時水華魚腥藻生物量4天變化圖。

圖6是菌株hy339經16srdna基因序列分析後所得系統發育樹。

本發明菌株hy339於2017年5月31日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，分類命名為蠟樣芽胞桿菌bacilluscereus，保藏編號為cgmccno.14207。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的海洋蠟樣芽胞桿菌hy339菌株及其乙酸乙酯粗提物在藍藻水華控制中的效果作進一步說明，以充分了解本發明的目的、特徵和效果。

實施例1活性菌株篩選

從連雲港海域海水、沉積物中共分離出細菌110株，將其活化培養，取培養48h的菌液1.5ml分別加入新接種的100ml水華魚腥藻藻液中，將藻液放入全自動光照培養箱培養，培養條件：溫度25℃，光照強度2000lux，光暗比14:10。每天定時取樣測定水華魚腥藻生物量(以單位體積內藻絲總長計)，發現其中104株抑藻活性不顯著，但有6株細菌，包括hy339、hy423、hy555、hy684、hy689、hy728，對水華魚腥藻的生長均具有顯著的抑制作用，結果見圖1。6株海洋細菌(hy339、hy423、hy555、hy684、hy689、hy728)在添加量體積比為1.5％時，對水華魚腥藻6天抑制率分別為93.0％、78.6％、80.4％、75.7％、84.0％和88.2％；其中菌株hy339，抑制率最高(93.0％)，活性最優。

實施例2溶藻性細菌hy339發酵液及其乙酸乙酯-丙酮萃取液製備方法

將菌株hy339按照1％的接種量接種於人工海水配製的lb培養基中，25℃、150rpm條件下搖床培養5d後得到發酵液。

將丙酮以5％體積比混入乙酸乙酯中得到乙酸乙酯-丙酮混合液。

將乙酸乙酯-丙酮混合液按照1:1的比例加入發酵液中，混合後進行震蕩5min，分離出的上層乙酸乙酯-丙酮混合液即為菌株hy339發酵液萃取液；將萃取液以旋轉蒸發儀蒸乾後即為發酵液粗提物。

實施例3菌株hy339發酵液對水華魚腥藻的溶藻效果

以人工海鹽配置lb培養基並對菌株hy339進行接種發酵5天，發酵條件：25℃，150rpm搖床培養。

將發酵好的菌液以3％接種率加入處於對數生長期的水華魚腥藻藻液中，同樣使用無菌的lb培養基以相同接種率加入藻液中作為對照，在光照培養箱中培養4天，每天取樣測定對照組和實驗組水華魚腥藻生物量，計算溶藻效率，對照組和實驗組各設三個平行樣，結果以平均值±標準差形式表示。水華魚腥藻抑制率公式：

如圖2所示，所述菌株hy339發酵液對藍藻代表水華魚腥藻fachb-1255(anabaenaflos-aquae)的4天抑制率可達到91.1±6.1％。

實施例4菌株hy339發酵液乙酸乙酯-丙酮混合液粗提物的溶藻效果

將丙酮以5％體積比混入乙酸乙酯中得到乙酸乙酯-丙酮混合液。

取菌株hy339發酵5天的菌液，將乙酸乙酯-丙酮混合液按照1:1的比例加入菌株hy339發酵液中，混合後進行震蕩5min，分離出的上層萃取液，將萃取液以旋轉蒸發儀蒸乾後得到發酵液粗提物，將粗提物用無菌水溶解至原菌液相同體積。對照為經相同處理後的未接種lb培養基。

將按照上述方法製得的發酵液初提物稀釋液和培養基初提物稀釋液分別以3％體積比添加量添加到處於對數生長期的水華魚腥藻藻液中，發酵液萃取液處理組為實驗組，培養基萃取液處理組為對照組。在光照培養箱中培養4天，每天取樣測定對照組和實驗組水華魚腥藻生物量，計算溶藻效率，對照組和實驗組各設三個平行樣，結果以平均值±標準差形式表示。

如圖3所示，菌液乙酸乙酯-丙酮溶液粗提物對水華魚腥藻(anabaenaflos-aquae)的4天抑制率可達到51.5±11.5％。

實施例5菌株hy339在不同鹽度條件下的生長情況

以不同鹽度人工海水配置lb培養基並接種菌株hy339發酵培養3天，培養前後在490nm測定培養液吸光度值。

lb培養基不同鹽度梯度設定為：0％、0.25％、0.5％、1％、2％和3.5％，實驗第0天和第3天取菌液測定其在490nm波長下的吸光度三次，結果以平均值±標準差形式表示，如圖4所示，吸光度分別為0.83、1.79、1.78、1.66、1.55、1.74，鹽度為0.25％的培養基培養3天後菌液吸光度最高，說明菌株hy339雖然為海洋菌株，但在低鹽度條件下也可正常生長，可在淡水條件下進行溶藻活動。

實施例6不同鹽度條件下菌株hy339的發酵液對水華魚腥藻生長的抑制效果

以不同鹽度人工海水配置lb培養基並接種菌株hy339進行發酵培養5天，發酵條件：25℃，150rpm搖床培養。

將不同鹽度培養條件下發酵好的菌液以3％接種率加入處於對數生長期的水華魚腥藻藻液中，使用無菌的lb培養基以相同接種率加入藻液中作為對照，在光照培養箱中培養4天，每天取樣測定對照組和實驗組水華魚腥藻生物量，計算溶藻效率，對照組和實驗組各設三個平行樣，結果以平均值±標準差形式表示。

如圖5所示，菌株在不同鹽度條件下(0％、0.25％、0.5％、1％、2％和3.5％)所培養的發酵液對水華魚腥藻的4天抑制率分別為53.6％、86.0％、75.8％、81.0％、75.3％和85.8％。考慮到各鹽度下菌株生長達到的密度差異，可分析出培養基鹽度對發酵液抑制水華魚腥藻生長的效果無顯著性影響，且在所設定鹽度範圍內鹽度為0.25％時發酵液抑制水華魚腥藻生長效果最佳，說明菌株hy339適應淡水和低鹽度培養後保持溶藻活性。

實施例7菌株hy339的16srdna序列分析和種屬鑑定

預先對菌株hy339進行純化培養並發酵2天後，由上海生工公司進行16srdna基因序列分析，根據基因序列分析結果構建該菌株系統發育樹，見圖6。如圖6所示，鑑定菌株hy339為蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)。