一種區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒的pcr-rflp方法
2023-04-27 21:17:46
一種區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒的pcr-rflp方法
【專利摘要】本發明公開了一種區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒的PCR-RFLP方法，該方法是利用Rep蛋白基因序列酶切位點差異來進行區別的，包括DNA的提取，PCR擴增得到Rep蛋白基因片段，XhoⅠ酶切後進行RFLP分析。本發明鑑定方法簡單，效率和準確率較高。
【專利說明】—種區別鴨圓環病毒和觀圓環病毒的PCR-RFLP方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學【技術領域】，具體涉及一種利用水禽圓環病毒(鴨圓環病毒和鵝圓環病毒)Rep蛋白基因序列酶切位點差異區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒的聚合酶聯反應(PCR)-限制性片段長度多態性(RFLP)方法。
【背景技術】
[0002]鴨感染圓環病毒(duck circovirus, DuCV)最早由Hattermann等於2003年報導。我國臺灣學者Chen等對2002~2003年在我國臺灣地區採集的樣品檢測表明，圓環病毒檢出率為38.2 %。傅光華等首先在我國大陸地區報導有鴨圓環病毒感染，Jiang等有從鴨體內檢測到鴨圓環病毒的報導，其陽性率為33.29%，並伴有鴨I型病毒性肝炎(DHV-1)，鴨傳染性漿膜炎(RA)和鴨大腸桿菌病(E.coli)共感染。目前，幾乎所有的品種鴨均見有DuCV感染陽性的檢測報導。
[0003]鵝圓環病毒(GoCV)最早於1999年由德國學者Soike等從患病鵝病理組織中觀察到。病鵝主要表現發育不良、體重下降、羽毛凌亂等，病理組織學檢查發現法氏囊、脾臟和胸腺的淋巴細胞減少，其中法氏囊病變最明顯，甚至出現整個囊結構的破壞，並可觀察到嗜鹼性的包含體。2001年Todd等根據BFDV和PCV的R印蛋白的保守序列設計簡併引物，測定了 GoCV的全基因組序列。2002年中國臺灣學者Chen等應用9對引物分別擴增基因組不同片段，測序拼接後獲得了 12株GoCV的全基因組序列，並發現GoCV基因組序列間存在一定的差異。餘旭平等最早在我國浙江檢測到鵝圓環病毒，並對浙江省鵝圓環病毒的基因組結構和流行病學情況進行分析。萬春和等首次從朗德鵝中檢測到有GoCV感 染，並進行全基因測序。有報導DuCV和GoCV的ORF-Vl所編碼的蛋白(Itep蛋白)核苷酸同源性可達80.0%以上可設計一種引物來檢測DuCV和GoCV感染。
[0004]目前，已有研究報導多種鴨病毒性傳染病跨種傳播感染鵝的報導，如鴨肝炎病毒、番鴨呼腸孤病毒和黃病毒；也有鵝病毒性傳染病感染跨種傳播感染鴨的報導，如鵝細小病毒和鵝出血性多瘤病毒感染番鴨和半番鴨等報導。
[0005]目前，有報導DuCV和GoCV的0RF-V1所編碼的蛋白(Itep蛋白)核苷酸同源性可達80.0%以上可設計一種引物來檢測DuCV和GoCV感染，但對可能出現的跨種傳播仍無相應儲備檢測方法。本研究針對水禽圓環病毒(鴨圓環病毒和鵝圓環病毒)Rep蛋白基因差異特徵建立區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒PCR-RFLP方法相關報導，本發明的建立可填補國內外相關領域空白。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種利用水禽圓環病毒(鴨圓環病毒和鵝圓環病毒)Rep蛋白基因序列酶切位點差異區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒的PCR- RFLP方法。該方法能有效區分鴨圓環病毒和鵝圓環病毒感染(或共感染)，為水禽健康養殖提供技術保證。
[0007]本發明根據鴨圓環病毒和鵝圓環病毒基因組中Rep蛋白基因特徵，設計一組引物能同時對鴨圓環病毒和鵝圓環病毒進行陽性擴增，根據鵝圓環病毒擴增PCR產物中有特異性的Xho I酶切位點，而鴨圓環病毒擴增PCR產物中沒有Xho I酶切位點來對建立一種對鴨圓環病毒和鵝圓環病毒進行快速檢測的PCR-RFLP方法。
[0008]本發明採用以下技術方案:
一種區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒的PCR-RFLP方法，其特徵在於包括以下步驟:
(1)提取鴨圓環病毒和鵝圓環病毒基因組DNA；
(2)用引物Pl和P2同時對鴨圓環病毒和鵝圓環病毒進行PCR擴增，得到相應的Rep蛋白(replication protein,複製蛋白)基因片段；
(3)取PCR產物經XhoI酶切後進行RFLP分析。
[0009]其中，PCR引物需滿足如下要求:
(1)該PCR產物需選擇鴨圓環病毒和鵝圓環病毒Rep蛋白基因中的保守區域進行設計，以便能一個PCR反應能對鴨圓環病毒基因組DNA和鵝圓環病毒基因組DNA均能陽性擴增；
(2)該PCR產物需選擇鴨圓環病毒和鵝圓環病毒Rep蛋白基因中的保守區域進行設計時必須跨過鵝圓環病毒R印蛋白基因基因中309位的Xho I酶切位點，以便對膠回收產物能夠進行限制性片段長度多態性分析。
[0010]根據以上要求，所述的步驟(2)的擴增引物Pl和P2的序列為:
上遊引物 Pl:5』 -CATGA TGGGCAGTGGCTTCCT-3』，
下遊引物 P2:5』 -ACCTCCGTCTTCCAATCA-3』。
[0011]其中，所述的步驟(2) PCR擴增產物經膠回收大小為623bp。
[0012]其中，所述的步驟(3)Xho I酶切位點位於鵝圓環病毒基因組Rep蛋白基因序列的309位，鵝圓環病毒可被Xho I酶切後經瓊脂糖凝膠電泳檢測片段為2段，大小為364bp和259bp ;而鴨圓環病毒基因組Rep蛋白基因中沒有Xho I酶切位點，鴨圓環病毒經Xho I酶切後經瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小不變。
[0013]本發明的有益效果:鑑定方法簡單，效率和準確率較高。使用本方法對本臨床送檢20份(其中鴨和鵝組織病料各10份)疑似水禽圓環病毒(鴨圓環病毒和鵝圓環病毒)進行PCR- RFLP檢測，其中鴨圓環病毒陽性4份、鵝圓環病毒3株，沒有檢測到鴨圓環病毒和鵝圓環病毒共感染。根據建立的PCR- RFLP方法，可在5小時內對確定感染的水禽圓環病毒類型，同時還能對鴨圓環病毒和鵝圓環病毒類型進行正確分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為鴨圓環病毒和鵝圓環病毒進行快速檢測的PCR-RFLP方法的電泳圖。M為DL2000 DNA Marker, I為鴨圓環病毒PCR膠回收產物，2為鵝圓環病毒CR膠回收產物，3為經Xho I酶切鴨圓環病毒PCR膠回收產物，4為經Xho I酶切鵝圓環病毒PCR膠回收產物。
【具體實施方式】
[0015]下面實施例對本發明做進一步的描述。
[0016]實施例1
1、毒株:鴨圓環病毒(GenBank登錄號:GQ423744)和鵝圓環病毒(GenBank登錄號:⑶320569)均由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所分離鑑定和保存。[0017]2、引物設計與合成
根據鴨圓環病毒和鵝圓環病毒NS基因特徵設計引物Pl和P2，其中引物Pl和P2序列為:上遊引物Pl:5』_ CATGATGGGCAGTGGCTTCCT _3』，下遊引物P2:5』_ ACCTCCGTCTTCCMTCA-3，。
[0018]3、PCR 擴增
以常規方法提取鴨圓環病毒和鵝圓環病毒基因組DNA。用所設計的特異性引物Pl和P2進行PCR擴增，擴增片段大小約623bp。擴增體系為50 μ L，其中2 XGoTaq Master GreenMix 25 μ L、上下遊引物(20 μ M/mL)各I μ L、DNA模板I μ L,補充滅菌去離子水至終體積50 μ L0反應條件為94°C預變性5min，隨後進行94°C 50s,53°C 35s、72°C 45s，進行35個循環後，72°C延伸lOmin。 [0019]4、RFLP 分析
PCR反應結束後，將鴨圓環病毒和鵝圓環病毒PCR產物分別經膠回收試劑盒純化後進行Xho I酶切。酶切體系為20yL，其中IOXH Buffer 2 μ L，膠回收產物10 μ L，Xho I酶2yL、補充滅菌去離子水至終體積20yL。混勻後，經37°C水浴I小時，加入2 μ LlOXLoading Buffer終止,進行瓊脂糖凝膠電泳分析,對檢測樣品進行分析鴨圓環病毒和鵝圓環病毒類型。Xho I酶切位點位於鵝圓環病毒基因組R印蛋白基因序列的309位，鵝圓環病毒可被Xho I酶切後經瓊脂糖凝膠電泳檢測片段為2段，大小為364bpbp和259bp ;而鴨圓環病毒基因組R印蛋白基因中沒有Xho I酶切位點，鴨圓環病毒經Xho I酶切後經瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小不變。
[0020]5、臨床應用
使用本方法對本臨床送檢20份(其中鴨和鵝組織病料各10份)疑似水禽圓環病毒(鴨圓環病毒和鵝圓環病毒)進行PCR- RFLP檢測，其中鴨圓環病毒陽性4份、鵝圓環病毒3株，沒有檢測到鴨圓環病毒和鵝圓環病毒共感染。根據建立的PCR- RFLP方法，可在5小時內對確定感染的水禽圓環病毒類型，同時還能對鴨圓環病毒和鵝圓環病毒類型進行正確分析。
【權利要求】
1.一種區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒的PCR-RFLP方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)提取鴨圓環病毒和鵝圓環病毒基因組DNA； (2)用上遊引物Pl和下遊引物P2同時對鴨圓環病毒和鵝圓環病毒進行PCR擴增，得到相應的R印蛋白基因片段；上遊引物Pl和下遊引物P2的序列分別為:
上遊引物 Pl:5』 -CATGATGGGCAGTGGCTTCCT-3』，
下遊引物 P2:5』 -ACCTCCGTCTTCCAATCA-3』 ； (3)取PCR擴增產物經XhoI酶切後進行RFLP分析，可被酶切的為鵝圓環病毒，不可酶切的則為鴨圓環病毒。
2.根據權利要求書I中所述的區別鴨圓環病毒和鵝圓環病毒的PCR-RFLP方法，其特徵在於:所述的步驟(2)PCR擴增產物經膠回收大小為623bp ;所述的步驟(3)中RFLP分析具體為:Xho I酶切位點位於鵝圓環病毒Rep蛋白序列的309位,鵝圓環病毒可被Xho I酶切後經瓊脂糖凝膠電泳檢測片段為2段，大小為364bp和259bp ;而鴨圓環病毒基因組R印蛋白基因中沒有Xho I酶切位點，鴨圓環病毒經Xho I酶切後經瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小不變。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103602759SQ201310591203
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】萬春和, 黃瑜, 陳紅梅, 施少華, 傅光華, 程龍飛 申請人:福建省農業科學院畜牧獸醫研究所