一株高效降解鄰苯二甲酸酯的植物內生菌及其應用的製作方法
2023-05-19 16:02:41
本發明屬於微生物技術領域。更具體地，涉及一株高效降解鄰苯二甲酸酯的植物內生菌及其應用。
背景技術：
鄰苯二甲酸酯（phthalicacidesters，paes）別名酞酸酯，在日常及工業上被廣泛使用，有機化學上將鄰苯二甲酸酯定義為一類化學物質，含有多種異構體，其中的鄰苯二甲酸二丁酯（dibutylphthalate，dbp）被廣泛應用。paes一般為油狀，微溶於水，易溶於有機溶劑，其對環境的危害主要為對於人和其他動物的致畸、致癌、致突變「三致」上，另外對藻類等低等生物亦有毒理作用，而dbp在水生環境中具有急性或者慢性毒性。paes作為增塑劑，在日常及工業上被廣泛使用與塑料製品等產品，隨著人類的使用，時間的推移，遷移至環境，進入水、大氣、土壤等介質中，研究調查發現，我國各地土壤均受到了不同程度paes汙染，尤其是工農業地區。在我國各流域中，部分源水都有檢測出含有paes，而在長江流域多個採樣點地點檢出率為100%，且濃度較大，說明我國水域水體受paes汙染較為嚴重，且汙染面廣。paes在環境中的水解、光解的速率非常緩慢，屬於難降解物質，容易在環境和生物機體中富集，對環境和生物機體產生慢性毒害作用。目前，通過微生物降解環境中汙染物質是環境工程中的一大方向，而且收效頗豐，研究證明微生物降解是廉價且高效的。
植物內生菌是指能夠在植物細胞間隙或細胞內生存，且不對寄主植物產生生理毒害的微生物。在植物內生菌生物功能的研究中，除了其促進植物生長等功能外，還發現能將其應用於環境汙染治理中。馮仁軍等採用多種處理手段，從植物組織中均能提取出植物內生菌，一般稱為可培養內生菌。有研究發現部分水生植物對汙染水體的淨化作用與植物內生菌有一定的關係。而劉勁松等研究植物內生菌修復重金屬汙染的功能發現，植物內生菌對植物吸收的重金屬離子起生物毒性鈍化等作用，這些都說明了將植物內生菌應用於環境汙染修復的研究的可操作性與可實現性。在汙染的環境中，植物中內生菌能夠存活，很大程度說明其對汙染物質有一定抵抗作用。這種抵抗作用是如何進行的，抵抗作用的大小尚待研究。
目前，國內外已有部分學者針對paes中的dbp篩選出具有良好降解性能的菌株，如乙酸鈣不動桿菌（calciumacetateacinetobacter）、乳桿菌（lactobacillus）、深紅紅球菌（rhodococcusruber）、螢光假單胞菌（pseudomonasfluorescens）、銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）、elizabethkingiasp等。已有研究發現，植物內生菌有降解環境汙染物的功能，但其對環境汙染物的清除功能的大小，或者說其環保意義尚待深入研究。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一株可以高效降解鄰苯二甲酸酯的植物內生菌-枯草芽孢桿菌enb-n菌株。該菌株具有分泌吲哚乙酸能力，具有解鉀，解磷能力，對常見的幾種抗生素和重金屬均具有一定的抗性，能利用鄰苯二甲酸酯作為唯一碳源和能源進行生長繁殖，其對dbp的降解率能達到95%以上。
本發明的目的是提供一株高效降解鄰苯二甲酸酯的植物內生菌。
本發明的另一目的是提供上述植物內生菌的應用。
本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：
一株高效降解鄰苯二甲酸酯的枯草芽孢桿菌enb-n菌株，所述菌株於2017年5月4日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心，菌種保藏號為gdmccno：60173，分類命名號為bacillussubtilis；保藏地址為中國廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
本發明所述菌株由韶關市一處汙染水渠邊的植物樣品中分離、馴化並篩選得到。該菌株能在鄰苯二甲酸酯作為唯一碳源和能源的培養基上生長繁殖。菌落呈規則圓形，在長成菌落初期，菌落呈半透明，光滑表面，培養24h後，表面變粗糙，呈白色，不透明狀。接種後5～17小時為該菌的對數生長期。
而且該菌株具有分泌吲哚乙酸能力，具有解鉀，解磷能力；對常見的幾種抗生素具有一定的抗性，其中對利福平抗性較強，對慶大黴素抗性較弱；當氯黴素達到8ppm時，慶大黴素達到0.5ppm時可完全抑制生長；而鹽酸四環素在16ppm時對菌株影響較明顯，利福平在16ppm時開始對菌株出現影響；其24h生長量受重金屬影響，cu離子濃度達到75ppm時出現抑制生長狀況，100ppm時完全抑制生長；zn離子濃度達到30ppm時，其生長量受到明顯抑制，達到75ppm時，幾乎停止生長；cd離子濃度達到16ppm時，抑制生長現象逐漸明顯；hg離子濃度達到20ppm時，抑制生長現象逐漸明顯。根據重金屬土壤環境質量標準判斷，該菌株生長對cd、hg離子的抗性較強，而對cu、zn離子同樣具有一定抗性。
進一步地，所述枯草芽孢桿菌enb-n菌株的16srdna序列如seqidno：1所示。
本發明的枯草芽孢桿菌enb-n菌株懸濁液在含有paes的培養液中生長時，其對paes的最高降解效率可以達到95%以上。
因此，所述枯草芽孢桿菌enb-n菌株在降解鄰苯二甲酸酯中的應用，，以及在製備鄰苯二甲酸酯降解製劑中的應用，均應在本發明保護範圍內。
本發明還提供一種降解鄰苯二甲酸酯的菌株懸濁液，包含所述枯草芽孢桿菌enb-n菌株。
一種鄰苯二甲酸酯的降解製劑，包含有枯草芽孢桿菌enb-n菌株或其發酵液。
所述菌株懸濁液或降解製劑能夠高效降解鄰苯二甲酸酯，因此可將該菌株懸濁液或降解製劑應用於鄰苯二甲酸酯汙染物的治理。
優選地，所述應用的方法為：向鄰苯二甲酸酯汙染的待處理樣本中加入上述菌株懸濁液或降解製劑進行處理。
優選地，待處理樣本的ph調節為5.0～9.0（最優選6.0）。
優選地，應用的適宜溫度為25～35℃（最優選30℃）。
優選地，應用的處理時間為5～7天（最優選5天）。
優選地，所述鄰苯二甲酸酯汙染的待處理樣本與菌株懸濁液或降解製劑的體積比為40～60：1（最優選50：1）。
另外，優選地，由於本發明的枯草芽孢桿菌enb-n菌株對重金屬有一定的耐受性，因而適用於重金屬和鄰苯二甲酸酯雙重汙染的水體或土壤的治理。
進一步優選地，由於本發明的枯草芽孢桿菌enb-n菌株對抗生素也有一定的抗性，因而適用於抗生素、重金屬和鄰苯二甲酸酯三重汙染的水體或土壤的治理。
優選地，所述重金屬為cd、hg、cu、zn離子，所述抗生素為利福平。
另外，優選地，上述述鄰苯二甲酸酯為鄰苯二甲酸二丁酯。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明所述枯草芽孢桿菌enb-n菌株可高效降解鄰苯二甲酸酯，能利用鄰苯二甲酸酯作為唯一碳源和能源進行生長繁殖，其對dbp的降解率能達到95%以上；將該菌株用於鄰苯二甲酸酯汙染物的治理，具有較大的應用前景。
本發明篩選出能降解鄰苯二甲酸酯的植物內生菌，分析內生菌對鄰苯二甲酸酯的降解效能，對汙染物生物防治研究具有示範意義，為內生菌投入汙染物生物治理工程中提供科學依據。
附圖說明
圖1為本發明枯草芽孢桿菌enb-n菌株的電鏡掃描圖。
圖2為本發明枯草芽孢桿菌enb-n菌株的生長曲線圖。
圖3為培養時間對dbp的降解率的影響曲線圖。
圖4為培養溫度對dbp的降解率的影響曲線圖。
圖5為培養液ph對dbp的降解率的影響曲線圖。
圖6為dbp起始濃度對dbp的降解率的影響曲線圖。
具體實施方式
以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
下列實施例中用到的培養基配方如下所示：
lb培養基：胰蛋白腖10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，蒸餾水1l；ph7.2～7.4。
無機鹽基礎培養基：nacl1g/l，k2hpo4·3h2o1g/l，nh4cl0.5g/l，mgso4·7h2o0.4g/l，蒸餾水1l；ph7.2～7.4。
實施例1枯草芽孢桿菌enb-n菌株的分離鑑定
1、菌株的分離篩選
所述菌株由韶關一處汙染水渠邊的植物樣品中分離、馴化並篩選得到，具體方法包括如下步驟：
（1）從汙染水渠周邊採集若干類植物樣品，用於可培養植物內生菌的提取。
（2）將植物樣品帶回後洗淨，並用蒸餾水衝洗之後瀝乾水滴，將植物樣品地上地下部分剪斷分開，並分別剪成細段，用濃度體積分數為75%的酒精浸泡1min後移入無菌操作臺，繼續進行植物表面消毒，將浸泡後的樣品轉入新的滅菌的培養皿，倒入質量濃度為5%次氯酸鈉溶液和30%的雙氧水浸泡15分鐘左右，最後用滅菌的蒸餾水衝洗植物樣品若干次；收集最後一次衝洗後的蒸餾水，將其塗布在lb固體培養基上，培養24h後若沒有長出菌落，表明植物表面消毒達到要求。
（3）將衝洗後的植物樣品在無菌操作臺上瀝乾水分後在滅菌的的研磨缽上研磨，加入適量滅菌的生理鹽水攪拌後靜置，將研磨液用生理鹽水梯度稀釋後，分別塗布於lb固體培養基，培養24h，將明顯分辨的單株菌落分別進行提純，進一步純化培養。
（4）將純化培養的菌株在培養後期分別轉到以paes為唯一碳源的基礎培養基（濃度為200，400，800ppm）中進行培養，從而篩選和馴化得到目標菌株；具體為：
s1.配置無機鹽基礎培養基，50ml分裝於150ml錐形瓶中，封口後滅菌，待冷卻至約40℃時，準確加入以丙酮為溶劑配成的dbp母液，使降解培養液中dbp濃度為50ppm。
s2.待培養液冷卻至室溫，接種預先培養的菌株懸濁液1ml，用透氣隔菌封口膜封口，120r/min，30℃條件下振蕩培養培養5天。
s3.將培養後降解培養液倒入分液漏鬥，用少量二氯甲烷衝洗三次，用50ml二氯甲烷分3次（20+15+15ml）萃取降解液，萃取在250ml分液漏鬥中進行。（第一次為酸性萃取，加硫酸調ph至5.0左右，第二次加入適量nacl去乳化後萃取，第三次只加入二氯甲烷做萃取），來回顛倒振蕩數次，靜置10min後，待分層明顯，收集下層有機相溶液。
s4.合併萃取液，採用旋轉蒸發儀，50℃水溫蒸發二氯甲烷至幹，加25ml二氯甲烷封口後於超聲清洗鍋中溶解，然後準確吸取1ml於10ml容量瓶中，用二氯甲烷定容。最後吸取1ml於進樣瓶，蓋蓋子，並用封口膜封口，採用液相色譜-質譜聯用儀測試dbp剩餘量。初次實驗得到一單株菌體，該菌株能在鄰苯二甲酸酯作為唯一碳源和能源的培養基上生長繁殖，在本實施方式下其對dbp最高降解率達到99%，於是將該菌體保存於甘油管中，即為本發明菌體，其綜合屬性採用該保存菌體傳代培養後進行。
2、菌株的形態學鑑定
上述菌株的菌落呈規則圓形，在長成菌落初期，菌落呈半透明，光滑表面，培養24h後，表面變粗糙，呈白色，不透明狀。該菌株的電鏡掃描圖如圖1所示。
3、菌株的分子鑑定
將上述篩選和馴化得到的菌株提取細菌基因組dna，通過如下引物擴增其16srdna序列：
16srdna-f：5'-agagtttgatcctggctcag-3；
16srdna-r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'
取擴增產物進行電泳檢測並將擴增產物送測序，其16srdna序列如seqidno：1所示；通過ncbi資料庫進行blast比對，與資料庫中已知的枯草芽孢桿菌的16srdna相似度在99%，因此推測分離得到的細菌為枯草芽孢桿菌；將該菌株並命名為枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）enb-n菌株，並於2017年5月4日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心（gdmcc），菌種保藏號為gdmccno：60173，分類命名號為bacillussubtilis；保藏地址為中國廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
實施例2枯草芽孢桿菌enb-n菌株的生長曲線測定
由於細菌懸液的濃度與光密度（od600值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，即採用比濁法測定，並將所測的od600值與其對應的培養時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。
（1）選用25mllb液體培養基，接種本發明菌體培養的菌液，於30℃，120r/min條件下，在搖床上分別培養0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、20、24、26、32h，用分光光度計在波長600nm下測量光度值，即為od600值，繪製生長曲線圖。
（2）該菌株的生長曲線如圖2所示，可以看出，從接種到培養5小時內，該菌生長量基本不變，培養5小時後，菌體開始指數生長，約到17小時時生長趨勢減緩，可推測5～17小時為該菌的對數生長期。
實施例3枯草芽孢桿菌enb-n菌株的生物特性
1、實驗研究顯示，enb-n菌株具有分泌吲哚乙酸能力，可以促進植物內生菌所寄生的植物的生長發育等。
同時該菌株還具有解鉀，解磷能力；因此可以把土壤中一些礦物態的p和k轉化為游離態p和k，有利於微生物的生長繁殖。
2、實驗研究顯示，enb-n菌株對常見的幾種抗生素具有一定的抗性，其中對利福平抗性較強，對慶大黴素抗性較弱；當氯黴素達到8ppm時，慶大黴素達到0.5ppm時可完全抑制生長；而鹽酸四環素在16ppm時對菌株影響較明顯，利福平在16ppm時開始對菌株出現影響。
3、實驗研究顯示，enb-n菌株的24h生長量受重金屬影響，cu離子濃度達到75ppm時出現抑制生長狀況，100ppm時完全抑制生長；zn離子濃度達到30ppm時，其生長量受到明顯抑制，達到75ppm時，幾乎停止生長；cd離子濃度達到16ppm時，抑制生長現象逐漸明顯；hg離子濃度達到20ppm時，抑制生長現象逐漸明顯。根據重金屬土壤環境質量標準判斷，該菌株生長對cd、hg離子的抗性較強，而對cu、zn離子也具有一定抗性。
實施例4時間、溫度、培養液ph、降解液paes起始濃度對菌株降解效能的影響
1、培養時間對菌株降解效能的影響
（1）改變培養時間，分別以6h、12h、24h、36h、3天、5天作為梯度培養時間，paes起始濃度為50ppm，培養液ph為7.0，120r/min，30℃下振蕩培養探究培養時間對降解效能的影響。
（2）結果如圖3所示，降解培養12h後，降解率能達到80%；可見該菌株在較短時間內能達到較高的降解率，體現出其在工程應用上的高效性。降解培養5天後，與降解培養7天降解率相近，達到95%，基本完全降解。
2、培養溫度對菌株降解效能的影響
（1）降解培養液ph7.0，paes起始濃度為50ppm，120r/min，溫度分別為25℃，30℃、，35℃條件下振蕩培養5天，探究培養溫度對降解效能的影響。
（2）結果如圖4所示，結果表明在25～35℃可視為其適應溫度範圍，其降解率均能達到94%以上；其最適溫度為30℃，降解率達到95%以上。
3、培養液ph對菌株降解效能的影響
（1）降解培養液改變ph分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0作為梯度，paes起始濃度為50ppm，120r/min，30℃條件下振蕩培養5天，探究ph對降解效能的影響。
（2）結果如圖5所示，本發明菌體降解適應ph範圍較廣，在5.00～9.00範圍內能達到或接近90%，最適ph為6.00。
4、降解液paes起始濃度對菌株降解效能的影響
（1）改變降解培養液paes的起始濃度，分別為25ppm，50ppm，100ppm，200ppm作為梯度，培養液ph為7.0，120r/min，30℃條件振蕩培養5天，探究paes起始濃度對降解效能的影響。
（2）結果如圖6所示，當初始濃度為25ppm時也具有顯著的降解率，仍高達85%以上；當初始濃度達到200ppm時，降解率仍高達90%以上。
綜合考慮上述因素對菌株降解效率的影響，在降解液ph為5.5～9，25～35℃條件下培養5天左右，降解率能穩定地達到90%以上。
而在最適條件為：降解液ph為6.00，paes初始濃度為100ppm左右時，在28～33℃條件下培養5天左右，降解率能穩定地達到95%以上。
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華南農業大學
一株高效降解鄰苯二甲酸酯的植物內生菌及其應用
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