一種靈菌紅素的提取分離方法
2023-05-20 03:20:41
一種靈菌紅素的提取分離方法
【專利摘要】本發明公開了一種靈菌紅素的提取分離方法，該靈菌紅素的提取分離方法包括：選取實驗室優化的菌種，經斜面活化後接入種子培養基，進行發酵培養；提取靈菌紅素：取發酵液，離心，加入適量酸性丙酮，超聲提取，用旋轉蒸發器旋轉蒸乾得到丙酮粗提物，用石油醚進行脫酯；利用薄層層析的方法來進行矽膠柱層析前的預實驗，通過改變配比進行多次試驗，得到最好的溶劑配比；進行柱層析；進行二次柱層析分離純化。本發明的先離心，去掉含靈菌紅素較少的上清液，用酸性丙酮對菌體進行粗提取，選擇常用的矽膠柱層析來進行精分離，採用氯仿-乙酸乙酯溶劑系統和氯仿-乙酸乙酯-甲醇的溶劑系統梯度洗脫，分離得到靈菌紅素及未知物質，分離純度高。
【專利說明】一種靈菌紅素的提取分離方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物化學【技術領域】，尤其涉及一種靈菌紅素的提取分離方法。
【背景技術】
[0002]靈菌紅素是一種主要由微生物產的天然紅色素，1929年Amako等在研究沙雷氏菌(Serratia)生長時發現,而首先分離得到靈菌紅素的是Harashima等在1960年完成的。隨著研究人員對靈菌紅素的性質及生物活性的不對深入研究，發現它具有抗細菌、抗瘧疾、抗真菌、抗原生動物，以及人們最關注的免疫抑制活性和引起腫瘤細胞凋亡的作用，因此作為一種天然色素，靈菌紅素在醫學、食品、印染、紡織、飼料添加劑、環境治理等領域，均有巨大的應用潛力和廣闊的市場前景。且靈菌紅素作為一種微生物所產的色素，克服了植物色素提取的諸多弊端，如生產周期短，同時不受資源、時間和空間等因素的限制，並且易於工業化生產。因此，靈菌紅素的前景極其廣泛。
[0003]微生物產天然色素有多方面的優點，但縱使有千萬種優點，不能分離得到目的產品也是枉然，所以本實驗旨在得到一種合適的分離靈菌紅素的方法。微生物的次級代謝產物分離純化的目的是從發酵液中分離得到高純度，能符合食品藥品等質量要求的產品，但由於發酵液中成分多且雜，故分離純化的成本往往較高，佔產品總成本的比例很大，不同的產品，分離純化的成本約佔40-70%之間。所以研究合理的下遊工程技術及計算該技術所需的成本價格，對靈菌紅素商品化生產的經濟效益具有重要意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種靈菌紅素的提取分離方法，旨在得到一種合適的分離靈菌紅素的方法，降低分離純化成本。
[0005]本發明是這樣實現`的，一種靈菌紅素的提取分離方法包括以下步驟:
[0006]步驟一、選取實驗室優化的菌種，經斜面活化後接入種子培養基，進行發酵培養；
[0007]步驟二、提取靈菌紅素:取發酵液，離心，加入適量酸性丙酮，超聲提取，用旋轉蒸發器旋轉蒸乾得到丙酮粗提物，用石油醚進行脫酯；
[0008]步驟三、利用薄層層析的方法來進行矽膠柱層析前的預實驗，通過改變配比進行多次試驗，得到最好的溶劑配比；
[0009]步驟四、進行柱層析；
[0010]步驟五、進行二次柱層析分離純化。
[0011]進一步，步驟一所述的發酵培養的具體方法為:
[0012]選取實驗室優化的菌種，經斜面活化後接入種子培養基，37°C，180r/min的搖床培養12h ;種子培養基:牛肉膏3.0g/L，蛋白腖10.0g/L，NaC15.0g/L，瓊脂18.0g/L, pH:7.4~
7.6 ；
[0013]隨後發酵培養，250mL三角瓶，裝液量50mL，按5%的接種量接種至發酵培養基中，37°C,180r/min的搖床培養48h ;發酵培養基:甘油20.0g/L，蛋白腖13.0g/L,MgSO4L 2g/L，NaC15.0g/L，搖瓶裝液量 20mL/100mL，接種量 5%V/V，pH:6.5。
[0014]進一步，步驟二所述的提取靈菌紅素的具體方法為:
[0015]取發酵液，1000Ormp下離心IOmin,加入適量pH=3.0的酸性丙酮,25°C下,超聲提取20min，提取三次至菌體無色，隨後用旋轉蒸發器60°C旋轉蒸乾得到丙酮粗提物，回收丙酮還能重複利用，由於之前用丙酮粗提物上柱得到的靈菌紅素乾燥後成油脂狀，無法乾燥，所以用石油醚進行脫酯，重複三次，稱量。
[0016]進一步，步驟三所述的預實驗，在氯仿-乙酸乙酯的溶劑系統上加入甲醇來加大極性，採用氯仿-乙酸乙酯-甲醇的溶劑系統。
[0017]進一步，步驟四所述的柱層析的具體方法如下:
[0018]裝柱:一般柱層析中吸附劑的填充量應佔柱子體積的1/4-1/5，採取溼法上柱，操作如下:
[0019](I)將稱量的矽膠加入燒杯中，倒入選定極性的洗脫劑，使矽膠完全浸入溶液中；
[0020](2)用超聲波清洗機，邊超聲震蕩邊用玻璃棒攪拌，打散矽膠團，趕出氣泡；
[0021](3)預先往矽膠柱中加少量溶劑，然後在攪拌下緩緩將矽膠倒入柱中；
[0022](4)靜置直至矽膠層不再降低，排除多餘溶劑，計算主留體積；
[0023](5)在矽膠上墊一層濾紙，防止加溶劑時將上層矽膠衝起；
[0024](6)測量高徑比；
[0025]加樣:在超聲震蕩下用少量洗`脫劑溶解樣品，用滴管將樣液緩緩沿壁均勻加入到柱體上面,最後用少量溶劑對主壁清洗2-3次；
[0026]洗脫:用找到的最優洗脫劑溶劑洗脫，在洗脫過程中，不能使層面擾動，尤其是開始階段，洗脫速度控制在每分鐘流出為柱體積1/200左右，對於不同顏色的條帶分開接收，接收用的玻璃儀器必須乾淨、乾燥，當用第一種洗脫劑無法洗脫下物質時，用之後確定的加大極性後的展開劑進行洗脫；
[0027]薄層層析檢測:薄層層析檢測，只有唯一斑點的則初步認定為較純組分，根據Rf值大小來確定成分是否相同，成分相同的則將收集液合併後旋轉蒸發進行濃縮，交叉部分單獨收集。
[0028]效果匯總
[0029]本發明的靈菌紅素的提取分離方法，先離心，去掉含靈菌紅素較少的上清液，用酸性丙酮對菌體進行粗提取，選擇常用的矽膠柱層析來進行精分離，採用氯仿-乙酸乙酯溶劑系統和氯仿-乙酸乙酯-甲醇的溶劑系統梯度洗脫，分離得到靈菌紅素及未知物質，分離
純度高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1是本發明實施例提供的靈菌紅素的提取分離方法流程圖。
【具體實施方式】
[0031]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。[0032]圖1示出了本發明的靈菌紅素的提取分離方法流程，如圖所示，本發明是這樣實現的，一種靈菌紅素的提取分離方法包括以下步驟:
[0033]SlOl:選取實驗室優化的菌種，經斜面活化後接入種子培養基，進行發酵培養；
[0034]S102:提取靈菌紅素:取發酵液，離心，加入適量酸性丙酮，超聲提取，用旋轉蒸發器旋轉蒸乾得到丙酮粗提物，用石油醚進行脫酯；
[0035]S103:利用薄層層析的方法來進行矽膠柱層析前的預實驗，通過改變配比進行多次試驗，得到最好的溶劑配比；
[0036]S104:進行柱層析；
[0037]S105:進行二次柱層析分離純化。
[0038]進一步，步驟SlOl所述的發酵培養的具體方法為:
[0039]選取實驗室優化的菌種，經斜面活化後接入種子培養基，37°C，180r/min的搖床培養12h ;種子培養基:牛肉膏3.0g/L，蛋白腖10.0g/L，NaC15.0g/L，瓊脂18.0g/L，pH:7.4~
7.6 ；
[0040]隨後發酵培養，250mL三角瓶，裝液量50mL，按5%的接種量接種至發酵培養基中，37°C,180r/min的搖床培養48h ;發酵培養基:甘油20.0g/L，蛋白腖13.0g/L,MgSO4L 2g/L，NaC15.0g/L，搖瓶裝液量 20mL/100mL，接種量 5%V/V，pH:6.5。
[0041]進一步，步驟S102所述的提取靈菌紅素的具體方法為:
[0042]取發酵液,1000Ormp下離心IOmin,加入適量pH=3.0的酸性丙酮,25°C下,超聲提取20min，提取三次至菌體無色，隨後用旋轉蒸發器60°C旋轉蒸乾得到丙酮粗提物，回收丙酮還能重複利用，由於之前用丙酮粗提物上柱得到的靈菌紅素乾燥後成油脂狀，無法乾燥，所以用石油醚進行脫酯，重複三次，稱量。
[0043]進一步，步驟S103所述的預實驗，在氯仿-乙酸乙酯的溶劑系統上加入甲醇來加大極性，採用氯仿-乙酸乙酯-甲醇的溶劑系統。
[0044]進一步，步驟S104所述的柱層析的具體方法如下:
[0045]裝柱:一般柱層析中吸附劑的填充量應佔柱子體積的1/4-1/5，採取溼法上柱，操作如下:
[0046](I)將稱量的矽膠加入燒杯中，倒入選定極性的洗脫劑，使矽膠完全浸入溶液中；
[0047](2)用超聲波清洗機，邊超聲震蕩邊用玻璃棒攪拌，打散矽膠團，趕出氣泡；
[0048](3)預先往矽膠柱中加少量溶劑，然後在攪拌下緩緩將矽膠倒入柱中；
[0049](4)靜置直至矽膠層不再降低，排除多餘溶劑，計算主留體積；
[0050](5)在矽膠上墊一層濾紙，防止加溶劑時將上層矽膠衝起；
[0051](6)測量高徑比；
[0052]加樣:在超聲震蕩下用少量洗脫劑溶解樣品，用滴管將樣液緩緩沿壁均勻加入到柱體上面,最後用少量溶劑對主壁清洗2-3次；
[0053]洗脫:用找到的最優洗脫劑溶劑洗脫，在洗脫過程中，不能使層面擾動，尤其是開始階段，洗脫速度控制在每分鐘流出為柱體積1/200左右，對於不同顏色的條帶分開接收，接收用的玻璃儀器必須乾淨、乾燥，當用第一種洗脫劑無法洗脫下物質時，用之後確定的加大極性後的展開劑進行洗脫；
[0054]薄層層析檢測 :薄層層析檢測，只有唯一斑點的則初步認定為較純組分，根據Rf值大小來確定成分是否相同，成分相同的則將收集液合併後旋轉蒸發進行濃縮，交叉部分單獨收集。
[0055]下面結合附圖和具體實施例來對本發明做進一步說明。
[0056]發酵液經離心去上清液，丙酮提取，石油醚脫脂，得乾燥的粗提物6.4274g。
[0057]薄層層析結果分析:
[0058]經過多次不同配比溶劑進行的薄層層析，得到適用於靈菌紅素分離的最佳展開劑配比:
[0059]以氯仿:乙酸乙酯=9:1作為展開劑的薄層色譜展開結果，較大的紅色斑點Rf值為0.7，斑點附近沒有其它斑點，分離度很高，故以氯仿:乙酸乙酯=9:1作為下一步柱層析精分離的初始洗脫劑。
[0060]以氯仿:乙酸乙酯:甲醇=6.7:3:0.3為展開劑進行的薄層層析，左邊的點為丙酮粗提物，右側點為較高純度的靈菌紅素的樣點，可見此配比的溶劑系統能分出不同的橙紅色物質，且該物質在此溶劑系統下的Rf值為0.21，與靈菌紅素分離度較大，故作為加大極性後的洗脫劑來對矽膠柱進行洗脫。
[0061]柱層析結果分析:
[0062]量取矽膠320ml，稱量為136g，測得高徑比為55/6，取經石油醚萃取後的粗提物
6.0023g 上柱。
[0063]氯仿:乙酸乙酯=9:1，接近溶劑前沿的為靈菌紅素，從薄層來看第一個點無其它斑點，純度較高，之後幾個樣`點在點樣出有淡淡的顏色，故不合併。
[0064]對第一部分的靈菌紅素旋轉蒸發乾燥，稱重，得成品0.3328g。
[0065]加大極性後洗脫下來的第二部分的薄層層析檢測，第一個樣點為靈菌紅素標準品，第二個樣點為丙酮粗提液樣點，第三個為第二部分合併後的樣點，展開劑為氯仿:乙酸乙酯:甲醇=6.7:3:0.3。洗脫下來的第二部分還有其它物質，純度不高，需要再次上柱分離。
[0066]二次柱層析，對第二部分接收液濃縮乾燥，得乾燥物2g，取0.5700g上柱，由於這次上樣量小，故用小體積的矽膠柱，矽膠體積45ml，高徑比為11/1，先用氯仿:乙酸乙酯=9:I洗脫下拖尾部分的靈菌紅素，然後加大極性進行洗脫。
[0067]未知物質分離結果:
[0068]分離時展開良好，純度應該挺高，對於各個樣點底下還有殘餘未展開的物質，通過觀察矽膠柱層析，發現上層矽膠總有洗脫不下來的物質，所以初步認定為該物質能與矽膠形成不可逆吸附，對於該物質的性質分析還有待研究。
[0069]靈菌紅素純品HPLC檢測結果:
[0070]通過柱層析分離得到的靈菌紅素的HPLC檢測，靈菌紅素的出峰時間為10.963，按照面積歸一法確定靈菌紅素純度達99.22%。
[0071]各步驟產物含靈菌紅素的HPLC檢測結果:
[0072]經HPLC檢測，按照面積歸一法來計算，各產物中靈菌紅素的含量為:
[0073]發酵液=0.029%
[0074]丙酮提取物=2.96%
[0075]經石油醚萃取後的粗提物=6.92%[0076]柱層析分離產物=99.22%
[0077]由上得用酸性丙酮提取，使靈菌紅素的含量提高100倍，而矽膠柱層析又將含量提高30多倍，由此可見這兩部分離提取的操作效率很高。
[0078]磁共振檢測結果:
[0079]分離得到的靈菌紅素的結構和文獻報導的一致，沒有其它雜峰，純度很高。
[0080]靈菌紅素分離一周期，價格總計=621.2元，分離得到純度99%的靈菌紅素0.3328g0
[0081]實驗結果表明通過用酸性丙酮提取，然後用氯仿:乙酸乙酯=9:1的溶劑系統進行矽膠柱層析分離，能得到了純度為99.22%的靈菌紅素，此方法分離效率高，步驟簡單。對於發酵液中其它未知物質的分離，用氯仿:乙酸乙酯:甲醇=6.7:3:0.3的溶劑系統能分離出兩種不同的物質，這兩種物質後於靈菌紅素被洗脫下來，極性相似，對於靈菌紅素分離的優化可能有一定作用。核算一周期的分離成本，得出實驗室中每0.lg，99%純的靈菌紅素分離成本在200元左右。上述雖然結合附圖對本發明的【具體實施方式】進行了描述，但並非對本發明保護範圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性的勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種靈菌紅素的提取分離方法，其特徵在於，所述的靈菌紅素的提取分離方法包括以下步驟: 步驟一、選取實驗室優化的菌種，經斜面活化後接入種子培養基，進行發酵培養； 步驟二、提取靈菌紅素:取發酵液，離心，加入酸性丙酮，超聲提取，用旋轉蒸發器旋轉蒸乾得到丙酮粗提物，用石油醚進行脫酯； 步驟三、利用薄層層析的方法來進行矽膠柱層析前的預實驗，通過改變配比進行多次試驗，得到最好的溶劑配比； 步驟四、進行柱層析； 步驟五、進行二次柱層析分離純化。
2.如權利要求1所述的靈菌紅素的提取分離方法，其特徵在於，步驟一所述的發酵培養的具體方法為: 選取實驗室優化的菌種，經斜面活化後接入種子培養基，37°C，180r/min的搖床培養12h ;種子培養基:牛肉膏 3.0g/L，蛋白腖 10.0g/L, NaC15.0g/L，瓊脂 18.0g/L, pH:7.4 ~7.6 ； 隨後發酵培養，250mL三角瓶，裝液量50mL，按5%的接種量接種至發酵培養基中，37°C，180r/min的搖床培養48h ;發酵培養基:甘油20.0g/L，蛋白腖13.0g/L, MgSO4L 2g/L,NaC15.0g/L，搖瓶裝液量 20mL/100mL，接種量 5%V/V，pH:6.5。
3.如權利要求1所述的靈菌紅素的提取分離方法，其特徵在於，步驟二所述的提取靈菌紅素的具體方法為:` 取發酵液，1000Ormp下離心IOmin,加入適量pH=3.0的酸性丙酮,25 O下，超聲提取20min,提取三次至菌體無色，隨後用旋轉蒸發器60°C旋轉蒸乾得到丙酮粗提物，回收丙酮還能重複利用，由於之前用丙酮粗提物上柱得到的靈菌紅素乾燥後成油脂狀，無法乾燥，所以用石油醚進行脫酯，重複三次，稱量。
4.如權利要求1所述的靈菌紅素的提取分離方法，其特徵在於，步驟三所述的預實驗，在氯仿-乙酸乙酯的溶劑系統上加入甲醇來加大極性，採用氯仿-乙酸乙酯-甲醇的溶劑系統。
5.如權利要求1所述的靈菌紅素的提取分離方法，其特徵在於，步驟四所述的柱層析的具體方法如下: 裝柱:柱層析中吸附劑的填充量應佔柱子體積的1/4-1/5，採取溼法上柱，操作如下: (1)將稱量的矽膠加入燒杯中，倒入選定極性的洗脫劑，使矽膠完全浸入溶液中； (2)用超聲波清洗機，邊超聲震蕩邊用玻璃棒攪拌，打散矽膠團，趕出氣泡； (3)預先往矽膠柱中加少量溶劑，然後在攪拌下緩緩將矽膠倒入柱中； (4)靜置直至矽膠層不再降低，排除多餘溶劑，計算主留體積； (5)在矽膠上墊一層濾紙，防止加溶劑時將上層矽膠衝起； (6)測量高徑比; 加樣:在超聲震蕩下用少量洗脫劑溶解樣品，用滴管將樣液緩緩沿壁均勻加入到柱體上面，最後用溶劑對主壁清洗2次~3次； 洗脫:用找到的最優洗脫劑溶劑洗脫，在洗脫過程中，不能使層面擾動，尤其是開始階段，洗脫速度控制在每分鐘流出為柱體積1/200，對於不同顏色的條帶分開接收，接收用的玻璃儀器必須乾淨、乾燥，當用第一種洗脫劑無法洗脫下物質時，用之後確定的加大極性後的展開劑進行洗脫； 薄層層析檢測:薄層層析檢測，只有斑點的則初步認定為較純組分，根據Rf值大小來確定成分是否相同，成分相同的則將收集液合併後旋轉蒸發進行濃縮，交叉部分單獨收集。
【文檔編號】C07G99/00GK103755619SQ201410010725
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】劉曉俠, 孫詩清, 王玉潔, 尤忠毓 申請人:嘉興學院