Nipah病毒疫苗的製作方法

2023-05-20 03:23:26

專利名稱：：Nipah病毒疫苗的製作方法
技術領域：
：本發明涉及針對Nipah病毒的重組疫苗以及此類疫苗的施用。
背景技術：
：Nipah病毒是副粘病毒(屍arayz7j^o"'r/dae)科的成員並且與Hendra病毒(以前稱為馬麻滲病毒)有關。Nipah病毒最初在1999年從馬來西亞和新加坡的成年男性中爆發的腦炎和呼吸系統疾病的檢查樣品中分離(參見，例如，Chua等人，Lancet.1999Oct9;354(9186):1257-9和Paton等人，Lancet.1999Oct9;354(9186):1253-6)。關於Nipah病毒的宿主仍未知，但懷疑狐蝠(狐蝠(/^ero/^)屬的蝙蝠)是天然宿主。因為生態條件中的變化，狐蝠越來越多地與人和家養動物接觸。因此，因此，可以想像狐蝠中的病毒可能感染家養動物和人，這可以導致更毒、可能致命的疾病。Nipah病毒在馬來西亞和新加坡的豬中引起相對溫和的疾病，並且病毒經由與受感染的豬的緊密接觸傳播給人、貓和狗o人中的Nipah病毒感染已伴隨特徵為發熱和嗜睡的腦炎和更嚴重的中樞神經系統疾病例如昏迷、癲癇發作和不能維持呼吸(參見，例如Lee等人，AnnNeurol.1999Sep;46(3):428-32)。Nipah病毒病從3-14天的發熱和頭痛開始，隨後為嗜睡和特徵為精神錯亂的定向障礙。這些特徵和症狀可以在24-48小時內發展為昏迷。某些患者在其感染的早期具有呼吸系統疾病。關於Nipah病毒性腦炎的嚴重神經病已由某些後遺症標記，例如持久性驚厥和人格改變。在1998-1999年Nipah病毒病爆發期間，入院的約40%具有嚴重神經病的患者死於該病(參見，例如，Lam和Chua,ClinInfectDis.2002May1;34S卿l2:S48-51)。因此，動物健康的目標是通過預防動物和/或人之間的疾病傳播來改善人的健康。Nipah病毒感染可以通過避免已知受感染的動物並當其必須與潛在受感染的動物接觸時使用合適的個人防護設備裝置來預防。藥物利巴韋林已顯示在體外有效對抗Nipah病毒，然而，受控制的藥物調查仍未進行並且臨床有效性仍不確定。如果將開發預防或治療Nipah病毒感染的有效程序，那麼必須限定在誘導保護性應答中重要的病毒抗原，並且設計有效的免疫預防治療。Nipah病毒的附著(G)和融合(F)糖蛋白已牽涉為病毒抗原(參見，例如，Bossart等人，JVirol.2002Nov;76(22):11186-98和Guilla薦等人，JVirol.2004Jan;78(2):834-40)。Nipah病毒糖蛋白(G和F)當作為重組痘苗病毒表達時已在倉鼠中誘導保護不受Nipah病毒的致命性攻擊的免疫應答(參見，例如，Guillaume等人，JVirol.2004Jan;78(2):834-40)。然而，觀察到在主動和被動免疫接種中，針對Nipah病毒的抗體應答是強烈刺激的，提示免疫接種的功效與載體複製能力相關。因此，本領域需要有效且可靠的Nipah病毒疫苗，其中異源蛋白具有有限或無生產性複製的表達。本申請中任何文件的引用或鑑別並非承認此類文件可用作本發明的現有技術。發明概述本發明部分基於有效的重組疫苗的開發，所述重組疫苗使用編碼Nipah病毒糖蛋白的減毒的金絲雀痘或減毒的雞痘病毒(fowlpox)載體針對Nipah病毒免疫豬，因此可以具有有限或無生產性複製(productivereplication)的異源蛋白表達。本發明可以包含包括多核苷酸的禽痘病毒表達栽體，所述多核苷酸編碼Nipah病毒糖蛋白。在一個實施方案中，Nipah病毒糖蛋白可以是附著(G)蛋白。有利地，多核苷酸可以包含SEQIDNO:1的核苷酸8943-核苷酸10751的核苷酸鹼基序列，或多核苷酸編碼SEQIDNO:8的肽。在另一實施方案中，Nipah病毒糖蛋白可以是融合(F)蛋白。有利地，多核苷酸可以包含SEQIDNO:l的核苷酸6654-核苷酸8294的核苷酸鹼基序列，或多核苷酸編碼SEQIDNO:7的肽。在再一實施方案中，Nipah病毒糖蛋白可以是附著(G)蛋白和融合(F)蛋白。有利地，多核苷酸可以包含SEQIDNO:l的核苷酸6654-核苷酸8294的核苷酸鹼基序列和核苷酸8943-核苷酸10751的核苷酸鹼基序列，或多核苷酸編碼SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的肽。禽痘病毒表達載體可以是減毒的禽痘病毒表達載體。在一個實施方案中，禽痘病毒表達載體可以是金絲雀痘病毒載體。有利地，金絲雀痘病毒載體可以是ALVAC。在另一實施方案中，禽痘病毒表達載體可以是雞痘病毒(fowlpox)載體。有利地，雞痘病毒(fowlpox)栽體可以是TROVAC。本發明包括用於遞送和表達Nipah病毒糖蛋白的製劑，其中所述製劑可以包含上文所述的任何一種載體和藥學或獸醫學可接受的運載體(carrier)、媒介物或賦形劑。在一個實施方案中，運載體、媒介物或賦形劑可以促進載體的轉染和/或改善其保存。本發明還包括將Nipah病毒糖蛋白遞送至動物的方法，其包含給動物施用上文段落的製劑。有利地，動物是豬。本發明還包括在動物中誘發免疫應答的方法，其可以包含以有效誘發免疫應答的量施用可以包含上文所述的任何一種載體的組合物。本發明還涉及在動物中誘發免疫應答的方法，其可以包含施用可以包含細胞的組合物，其中所述細胞可以包含有效誘發免疫應答的量的上文所述的任何一種載體。有利地，動物是豬。本發明進一步包括在動物中誘導免疫或保護性應答的方法，其可以包含以有效誘發免疫應答的量施用可以包含上文所述的任何一種載體的組合物。本發明進一步涉及在動物中誘導免疫或保護性應答的方法，其可以包含以有效誘發免疫應答的量施用可以包含細胞的組合物，其中所述細胞可以包含上文所述的任何一種載體。有利地，動物是豬。本發明還提供了用於執行上文所述的任何方法的試劑盒，其包含上文所述的任何組合物，以及任選地用於執行方法的說明書。應當注意在本公開內容中以及特別在權利要求和/或段落中，術語例如"包含"可以具有在美國專利法中對其認定的含義；例如它們可以意指"包括"；並且術語如"基本上由……組成"具有在美國專利法中歸於其的含義，例如它們涵蓋未明確敘述的元件，但排除在現有技術中發現或影響本發明的基本或新型特徵的元件。這些以及其他實施方案在下文詳細描述中/>開，或由於下文詳細描述而變得顯而易見並由下文詳細描述所涵蓋。附圖簡述作為例子給出，但不希望將本發明單獨限制於描述的具體實施方案的下列詳細描述，與附圖結合可以最好地理解，其中圖l舉例說明了Nipah病毒核苷酸(圖1A)和胺基酸(圖1B)序列。參見，例如GenBank登記號NC-002728，Chua等人，Science.2000May26;288(5470):1432-5;Harcourt等人，Virology.2001Aug15;287(1):192-201;Chan等人，JGenVirol.2001Sep;82(Pt9):2151-5和Chua等人，MicrobesInfect.2002Feb;4(2):145-51，其公開內容整體引入作為參考。圖2舉例說明了質粒pSL-6802-l-4的構建。圖2A是Nipah病毒編碼區的圖。圖2B舉例說明了用於擴增NipahG基因的PCR寡核苷酸。圖2C舉例說明了pSL-6802-1-4的構建。圖2D是左臂和右臂以及翻譯Nipah病毒G基因的表達盒的核苷酸序列。圖3舉例說明了質粒pSL-6802-2-5的構建。圖3A舉例說明了用於擴增NipahG基因的PCR寡核苷酸。圖3B舉例說明了pSL-6802-2-5的構建。圖3C是左臂和右臂以及翻譯Nipah病毒G基因的表達盒的核苷酸序列。圖4舉例說明了質粒pSL-6839-l的構建。圖4A是Nipah病毒和疫苗抗原的圖。圖4B舉例說明了用於擴增尼帕F基因的PCR寡核苷酸。圖4C舉例說明了pSL-6839-l的構建。圖4D是左臂和右臂以及翻譯Nipah病毒F基因的表達盒的核苷酸序列。圖5舉例說明了質粒pSL-6851-29的構建。圖5A舉例說明了用於擴增NipahF基因的PCR寡核苷酸。圖5B是pSL-6851-29的質粒示意圖。圖5C是左臂和右臂以及翻譯Nipah病毒F基因的表達盒的核苷酸序列。圖6舉例說明了NipahG蛋白質印跡。泳道1是ALVAC上清液，泳道2是vCP2199上清液(ALVACNipahG)，泳道3是vCP2199上清液(ALVACNipahG)，泳道4是雞痘病毒(fowlpox)上清液，泳道5是vFP220Q上清液(雞痘病毒(fowlpox)NipahG)，泳道6是vFP2200上清液(雞痘病毒(fowlpox)NipahG)，泳道7是標記(177.6、113.9、81.2、60.7、47.4、36.1、25.3、19.0、14.7、6.1kDa)，泳道8是ALVAC沉澱，泳道9是vCP2199沉澱，泳道10是vCP2199沉澱，泳道11是雞痘病毒(fowlpox)沉澱，泳道12是vFP22QQ沉澱，並且泳道13是vFP22QQ沉澱。圖7舉例說明了NipahF免疫印跡。圖7A使用豚鼠抗血清進^f亍印跡。圖7B使用豬抗血清進行印跡。凝膠弁l是NipahF重組體(只是沉澱)。泳道1是空白，泳道2是雞痘病毒(fowlpox),泳道3是vFP2207，泳道4是vFP2207，泳道5是空白，泳道6是ALVAC，泳道7是cvCP2208，泳道8是標記170、130、100、72、55、40、33、24kDa，並且泳道9和IO是空白。凝膠並2是NipahF重組體(只是上清液)。泳道1是空白，泳道2是雞痘病毒(fowlpox)，泳道3是vFP2207,泳道4是vFP2207，泳道5是標記170、130、100、72、55、40、33、24kDa，泳道6是空白，泳道7是ALVAC，泳道8是空白，泳道9是vCP2208，並且泳道10是空白。發明詳述本發明部分基於針對Nipah病毒的有效的重組疫苗的開發。因此，本發明部分包括針對Nipah病毒的重組疫苗。在本發明的一個實施方案中，Nipah病毒基因在表達載體內編碼。在一個有利的實施方案中，Nipah病毒基因編碼糖蛋白。在一個特別有利的實施方案中，Nipah病毒基因編碼附著(G)糖蛋白。在另一特別有利的實施方案中，Nipah病毒基因編碼融合(F)糖蛋白。在一個有利的實施方案中，表達栽體是病毒載體。在一個特別有利的實施方案中，病毒載體是禽痘病毒載體。在一個更有利的實施方案中，禽痘病毒載體是金絲雀痘病毒栽體或雞痘病毒(fowlpox)栽體。更有利地，禽痘病毒載體是減毒的禽痘病毒載體。在一個特別有利的實施方案中，減毒的禽痘病毒載體是減毒的金絲雀痘病毒或減毒的雞痘病毒(fowlpox)載體。有利地，減毒的金絲雀痘病毒載體是ALVAC並且減毒的雞痘病毒(fowlpox)載體是TROVAC。在另一實施方案中，Nipah病毒蛋白質是具有已知蛋白質序列的任何Nipah病毒蛋白質或其片段。在一個有利的實施方案中，Nipah病毒蛋白質是糖蛋白。在一個特別有利的實施方案中，Nipah病毒蛋白質是附著(G)糖蛋白，有利地具有SEQIDNO:8的序列。在另一特別有利的實施方案中，Nipah病毒蛋白質是融合(F)糖蛋白，有利地具有SEQIDNO:7的序列。在本發明的一個特別有利的實施方案中，重組構建體是命名為vCP2199的表達NipahG的ALVAC構建體，命名為vCP2208的表達NipahF的ALVAC構建體，命名為vFP2200的表達NipahG的TROVAC構建體，和命名為vFP2207的表達NipahF的TROVAC構建體。在本發明的另一實施方案中，Nipah病毒蛋白質包括但不限於，核殼蛋白(有利地SEQIDNO:2)，磷蛋白(有利地SEQIDNO:3)，V蛋白(有利地SEQIDNO:4)，C蛋白(有利地SEQIDNO:5)，基質蛋白(有利地SEQIDNO:6),或聚合酶(有利地SEQIDNO:9)。術語"蛋白質"、"肽"、"多肽"和"多肽片段"在本文中可互換地用於指任何長度的胺基酸殘基聚合物。聚合物可以是線性或分支的，它可以包含修飾的胺基酸或胺基酸類似物，並且它可以由除胺基酸以外的化學部分間插。該術語還包括已天然或通過幹預修飾的胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操作或修飾，例如與標記或生物活性組分綴合。在另一實施方案中，Nipah病毒基因是具有已知核苷酸序列的任何Nipah病毒基因。在一個有利的實施方案中，Nipah病毒基因編碼糖蛋白。在一個特別有利的實施方案中，Nipah病毒基因編碼附著(G)糖蛋白，有利地SEQIDNO:1的核苷酸8943-10751。在另一特別有利的實施方案中，Nipah病毒基因編碼融合(F)糖蛋白，有利地SEQIDNO:1的核苷酸6654-8294。在本發明的另一實施方案中，Nipah病毒基因可以編碼核殼蛋白(有利地SEQIDNO:1的核苷酸113-1711),磷蛋白(有利地SEQIDNO:1的核苷酸2406-4535)，V蛋白(有利地SEQIDNO:1的核普酸2406-3775)，C蛋白(有利地SEQIDNO:1的核苷酸2428-2928)，基質蛋白(有利地SEQIDNO:1的核苷酸5108-6166)，或聚合酶(有利地SEQIDNO:1的核苷酸11259-18213)。"多核苷酸，，是任何長度的核苷酸聚合形式，其含有任何組合的脫氧核糖核普酸、核糖核苷酸、以及類似物。多核苷酸可以具有三維結構，並且可以執行任何已知或未知的功能。術語"多核苷酸"包括雙鏈、單鏈和三螺旋分子。除非另有說明或要求，本文描述的本發明的多核苷酸的任何實施方案包括雙鏈形式以及2個互補形式中的每一個，其已知或預期形成DNA、RNA或雜交分子的雙鏈形式。下列是多核苷酸的非限制性例子基因或基因片段、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以包含修飾的多核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物、uracyl、其他糖或連接基團例如氟代核糖和硫醇鹽、以及核苷酸分支。核苷酸序列可以在聚合後進一步修飾，例如通過與標記組分綴合。這個定義中包括的其他修飾類型是帽、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸，以及引入用於將多核苷酸附著至蛋白質、金屬離子、標記組分、其他多核苷酸或固體載體的手段。"分離的"多核苷酸或多肽是基本上不含在它的天然環境與其結合的材料的多核苷酸或多肽。基本上不含指至少50%、有利地至少70%、更有利地至少80%、並再更有利地至少90%不含這些材料。本發明進一步包含Nipah病毒多核苷酸，有利地Nipah病毒糖蛋白多核苷酸的互補鏈。互補鏈可以是聚合的且具有任何長度，並且可以含有任何組合的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、以及類似物。雜交反應可以在不同"嚴謹性"條件下進行。增加雜交反應的嚴謹性的條件是眾所周知的。參見例如"MolecularCloning:ALaboratoryManual"，第二版(Sambrook等人，1989)。有關條件的例子包括(按照嚴謹性增加的順序)25°C、37°C、50。C和68。C的孵育溫度；10xSSC、6xSSC、1xSSC、0.1xSSC的緩沖液濃度(其中SSC是0.15MNaCl和15raM檸檬酸鹽緩沖液)以及使用其他緩沖系統的其等價物；0%、25%、50%和75%的曱醯胺濃度；5分鐘-24小時的孵育時間；1、2或更多個洗滌步驟；1、2或15分鐘的洗滌孵育時間；以及6xSSC、1xSSC、0.1xSSC的洗塗溶液，或去離子水。本發明進一步包括編碼Nipah病毒多肽的功能性等價變體和衍生物，以及可能增強、減少或不顯著影響由此編碼的多肽的特性的其功能性等價片段的多核苷酸。這些功能性等價變體、衍生物和片段顯示保留Nipah病毒多肽，有利地Nipah病毒糖蛋白的活性的能力。例如，不改變編碼的胺基酸序列的DNA序列中的變化，以及導致胺基酸殘基的保守置換、一個或少數胺基酸刪除或添加、以及由胺基酸類似物置換胺基酸殘基的那些改變是不顯著影響編碼的多肽的特性的那些改變。保守胺基酸置換是甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/穀氨酸；絲氨酸/蘇氨酸/曱硫氨酸；賴氨酸/精氨酸；以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。為了本發明的目的，序列同一性或同源性通過在比對時比較序列來確定，所述比對能最大化重疊和同一性而最小化序列缺口。特別地，序列同一性可以使用許多數學算法中的任何一種來測定。用於比較2個序列的數學算法的一個非限制性例子是Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990;87:2264-2268的算法,由Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993;90:5873-5877進行修飾。用於序列比較的數學算法的另一例子是Myers和Miller,CABIOS1988;4:11-17的算法。此類算法併入作為GCG序列比對軟體包的一部分的ALIGN程序(版本2.G)內。當使用ALIGN程序用於比較胺基酸序列時，可以使用PAM120加權殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。用於鑑別局部序列相似性和比對區域的另一有用算法是如Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988;85:2444-2448中描述的FASTA算法。有利地用於根據本發明使用的是WU-BLAST(WashingtonUniversityBLAST)版本2.0軟體。用於幾種UNIX平臺的WU-BLAST版本2.0執行程序可以從ftp:〃blast.wustl.edu/blast/executables下載。這種考呈序基於WU-BLAST版本1.4，其基於7^眾域NCBI-BLAST版本1.4(AUschul和Gish，1996，Localalignmentstatistics,Doolittleed.，MethodsinEnzymology266:460-480;Altschul等人，JournalofMolecularBiology1990;215:403-410;Gish和States,1993;NatureGenetics3:266-272;Karlin和Altschul,1993;Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877;所有這些引入本文作為參考)。一般而言，胺基酸序列的比較通過比對已知結構的多肽的胺基酸序列與未知結構的多肽的胺基酸序列來完成。隨後比較序列中的胺基酸並歸類同源的胺基酸組。這種方法檢測多肽的保守區並考慮胺基酸插入和刪除。胺基酸序列之間的同源性可以通過使用商購可得的算法來測定(同樣參見上文同源性的描述)。除本文另外提及的那些以外，也可提及的是由美國國家生物技術信息中心提供的程序BLAST、缺口BLAST、BLASTN、BLASTP和PSI-BLAST。這些程序在本領域中廣泛用於這個目的並且可以比對2個胺基酸序列的同源性區域。在成套的所有搜索程序中，缺口比對例行程序是資料庫搜索自身的部分。必要時可以關閉缺口。長度為1的缺口的預設罰分(Q)對於蛋白質和BLASTP是(^9，並且對於BLASTN是Q-IO，但可以變為任何整數。用於延伸缺口的預設每殘基罰分(R)對於蛋白質和BLASTP是R-2，並且對於BLASTN是R40，但可以變為任何整數。為了比對序列可以使用關於Q和R的值的任何組合，所述比對能最大化重疊和同一性而最小化序列缺口。默認的胺基酸比較矩陣是BLOSUM62，但可以使用其他胺基酸比較矩陣例如PAM。可替代地或另外地，術語"同源性"或"同一性"，例如就核苷酸或胺基酸序列而言，可以指2個序列之間的同源性的定量度量。序列同源性百分比可以計算為(Nre/-N力'屍)*100/Nre/%其中N^屍是比對時2個序列中不相同的殘基的總數目，並且其中N^屍是其中一個序列的殘基數目。因此，DNA序列AGTCAGTC將與序列AATCAATC具有75%的序列同一性(Nre屍-8;N^產2)。可替代地或另外地，"同源性，，或"同一性，，就序列而言可以指具有相同核苷酸或胺基酸的位置的數目除以2個序列中較短序列的核苷酸或胺基酸數目，其中2個序列的比對可以依據Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman，ProcNatlAcadSciUSA1983;80:726，引入本文作為參考)測定，例如，使用20個核苷酸的窗口大小、4個核苷酸的字長、以及缺口罰分4，並且序列數據的計算機輔助分析和解釋(包括比對)可以4吏用商購可得程序(例如IntelligeneticsSuite,IntelligeneticsInc.CA)方^f更地進行。當RM序列被說成與DM序列相似，或具有序列同一性或同源性程度時，DNA序列中的胸苷(T)視為等同於RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本發明範圍內並且可以通過將DNA序列中的胸苷(T)視為等同於RNA序列中的尿嘧啶(U)由DNA序列獲得。並且無需過度實驗，技術人員可以參考許多其他程序或參考文獻用於測定序列同源性。本發明進一步包括在載體分子或表達載體中含有的Nipah病毒蛋白質，有利地為Nipah病毒糖蛋白，並在必要時與增強子和/或啟動子元件可操作地連接。在一個有利的實施方案中，啟動子是細胞巨化病毒(CMV)啟動子。在另一實施方案中，增強子和/或啟動子包括各種細胞或組織特異性啟動子、各種病毒啟動子和增強子以及對於每種動物種類同基因特異的各種Nipah病毒DAN序列。"載體"指包含準備體外或體內遞送至靶細胞的異源多核苷酸的重組DNA或RNA質粒或病毒。異源多核苷酸可以包含用於治療用途的目的序列，並且可以任選地是表達盒的形式。如本文使用的，栽體無需能夠在最終靶細胞或受試者中複製。該術語包括用於翻譯多核苷酸編碼序列的克隆載體。還包括的是病毒載體。術語"重組體"指基因組cDNA、半合成或合成起源的多核普酸，其在自然界中不存在或以在自然界中未發現的方式與另一種多核苷酸連接。"異源，，指來源於對於與之比較的其餘實體遺傳上不同的實體。例如，多核苷酸可以由基因改造技術置於來源於不同來源的質粒或載體內，並且是異源多核苷酸。從其天然編碼序列中取出且可操作地連接至除該天然序列以外的編碼序列的啟動子是異源啟動子。本發明的多核苷酸可以包含另外的序列，例如在相同轉錄單位內的另外編碼序列，控制元件例如啟動子、增強子、核糖體結合位點、多腺苷酸化位點、轉錄終止子，在相同或不同啟動子控制下的另外轉錄單位，允許克隆、表達、同源重組和宿主細胞轉化的序列，並且任何此類構建體可以是需要的以提供本發明的實施方案。用於表達Nipah病毒蛋白質，有利地Nipah病毒糖蛋白的元件有利地存在於本發明的載體中。以最低限度的方式，這包含下列元件、基本上由其組成、或由其組成起始密碼子(ATG)、終止密碼子和啟動子，和任選地還有用於某些載體例如質粒和某些病毒載體例如除痘病毒以外的病毒載體的多腺苷酸化序列，以及用於痘病毒的轉錄終止子。當多核苷酸有利地在載體中編碼多蛋白片段，例如Nipah病毒蛋白質時，ATG置於閱讀框的5'並且終止子置於3'。可以存在用於控制表達的其他元件，例如增強子序列、穩定序列和允許蛋白質分泌的信號序列。用於製備和/或施用用於在體內或體外表達本發明基因的基因產物的載體或重組體或質粒的方法可以是^f壬何所需方法，例如由下列文件中公開的，或下列文件引用的文件中公開的方法或類似於其的方法美國專利號4，603，1124，745,0515，744，1405，990，0915，591，6395，580，8596，464，9846，368，6036,217,8836，090，3934，769，3315，744，1415，174，9935，589，4666，130，0666，451，7706，348，1966，207，1666，074，6494，769，3304，945，0505，756，5，505:5，677，6,004:6,391，6，306，6，207:6，045,1039411787773144001658034,394，4485，494，807;，762，938;，338，683591，439130，066387，376228，846159,477033，670450和64，722，8485，514，3755，766，5995，494，8075，552，1436,497,8836,376,4736，221，3626，153，1996,485,729312,683;19866，103，526;6,224,882;6,312,682;6,348年10月16日提交的美國專利申請序列號920,197;WO90/01543;W091/11525;W094/16716;W096/39491;W098/33510;EP265785;EP0370573;Andreansky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11313-11318;Ballay等人，EMBOJ.1993;4:3861-65;Feigner等人，J.Biol.Chem.1994;269:2550-2561;Frolov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11371-11377;Graham,Tibtech1990;8:85-87;Grunhaus等人，Sem.Virol.1992;3:237-52;Ju等人，Diabetologia1998;41:736-739;Kitson等人，J.Virol.1991;65:3068-3075;McClements等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11414-11420;Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11341-11348;Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11349-11353;Pennock等人，Mol.Cell.Biol.1984;4:399-406;Richardson(Ed)，MethodsinMolecularBiology1995;39,"BaculovirusExpressionProtocols,，，HumanaPressInc.;Smith等人，(1983)Mol.Cell.Biol.1983;3:2156-2165;Robertson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11334-11340;Robinson等人，Sem.Immunol.1997;9:271;和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11307-11312。因此，本發明的載體可以是任何合適的重組病毒或病毒栽體，例如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、雞痘病毒(fowlpox)、浣熊痘病毒、豬痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、皰滲病毒、杆狀病毒、逆轉錄病毒等(如在引入本文作為參考的文件中)；或者載體可以是質粒。本文引用和引入本文作為參考的文件，除了提供在本發明實踐中有用的栽體的例子外，還可以提供通過本發明組合物中，或包括在其中的一種或多種載體表達的非Nipah病毒蛋白質或其片段的來源，例如非Nipah病毒蛋白質或其片段，細胞因子等。一種或多種細胞因子可以是免疫原性或疫苗組合物中的蛋白質形式，或可以在宿主中與一種或多種免疫原或其表位共表達。優先考慮通過與表達一種或多種免疫原或其表位的同一載體，或通過分開的載體共表達一種或多種細胞因子。細胞因子可以選自白介素18(IL-18)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、MIP-la(巨噬細胞炎症蛋白la;MarshallE.等人，Br.J.Cancer,1997，75(12)，1715-1720)、GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)。優選地，使用待接種疫苗物種的細胞因子；即，有利地，細胞因子匹配靶或宿主物種，並且例如提到，豬GM-CSF(S.Inumaru等人，Immunol.CellBiol.1995，73(5)，474-476)、犬GM-CSF(WO00/77043的實施例8)、貓GM-CSF(WO00/77043的實施例9)。WO00/77210提供了對應馬GM-CSF的核苷酸序列和胺基酸序列，GM-CSF的體外生產以及允許馬GM-CSF體內表達的載體(例如，質粒和病毒栽體)的構建。本發明還涉及包含載體例如表達栽體的製劑，例如治療組合物。製劑可以在藥學或獸醫學可接受的運載體、賦形劑或媒介物中包含一種或多種載體、基本上由其組成、或由其組成，所述載體例如表達載體，例如體內表達載體，其包含一種或多種Nipah病毒多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成(且有利地表達)，並且有利地，載體含有和表達多核苷酸，其包含編碼Nipah病毒蛋白質(有利地Nipah病毒糖蛋白)的編碼區、基本上由其組成、或由其組成。因此，根據本發明的一個實施方案，製劑中的一種或多種其他載體包含多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，所述多核苷酸編碼、並且在合適的環境下載體表達Nipah病毒糖蛋白的一種或多種其他蛋白質，或其片段。根據另一實施方案，製劑中的一種或多種載體包含多核苷酸、或基本上由其組成、或由其組成，所述多核苷酸編碼Nipah病毒蛋白質、有利地Nipah病毒糖蛋白的一種或多種蛋白質或其片段。本發明的製劑有利地包含至少2種載體、基本上由其組成、或由其組成，所述載體包含來自不同Nipah病毒分離林的多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，並且有利地還表達所述多核苷酸、有利地在體內在適當的條件或合適的條件下或在合適的宿主細胞內，所述多核苷酸編碼相同蛋白質和/或不同蛋白質、但有利地編碼相同蛋白質。關於含有一種或多種載體的製劑(所述載體含有多核苷酸、基本上由其組成、或由其組成，所述多核苷酸編碼，並且有利地表達、有利地在體內，Nipah病毒蛋白質、有利地Nipah病毒糖蛋白、或其表位)，有利的是表達產物來自2種、3種或更多種Nipah病毒分離林，有利地毒林。本發明還涉及栽體混合物，其含有編碼不同Nipah病毒糖蛋白的序列、基本上由其組成、或由其組成，並表達其。在一個有利的實施方案中，栽體是含有Nipah病毒基因、有利地Nipah病毒糖蛋白基因的病毒栽體，有利地禽痘病毒載體。在一個特別有利的實施方案中，禽痘病毒栽體是金絲雀痘病毒載體，有利地，減毒的金絲雀痘病毒載體例如ALVAC。減毒的金絲雀痘病毒在美國專利號5,756,103(ALVAC)和WO01/05934中描述。在另一特別有利的實施方案中，禽痘病毒載體是雞痘病毒(fowlpox)栽體，有利地減毒的雞痘病毒(fowlpox)栽體例如TR0VAC。同樣參考美國專利號5,766,599，其涉及減毒的雞痘病毒(fowlpox)林TR0VAC。在一個具體實施方案中，病毒載體是痘病毒，例如痘苗病毒或減毒的痘苗病毒(例如，MVA,安卡拉疫苗林在雞胚成纖維細胞上傳代超過570代後獲得的修改的安卡拉林；參見Stickl和Hochstein-Mintzel，Munch.Med.Wschr.，1971，113，1149-1153;Sutter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1992，89，10847-10851;可作為ATCCVR-1508獲得；或NYVAC,參見美國專利號5，494，807，例如美國專利號5，494，807的實施例1-6以及下列等等，所述專利討論NYVAC的構建，以及具有從哥本哈根株痘苗病毒基因組刪除另外的ORF的NYVAC變異林，以及插入這種重組體的位點內的異源編碼核酸分子，還有匹配啟動子的使用；還參見WO96/40241)，禽痘病毒或減毒的禽痘病毒(例如，金絲雀痘、雞痘(fowlpox)、鳩痘(dovepox)、鴒痘、鵪鵓痘、ALVAC或T,AC;還參見美國專利號5,505,941，5,494,807),豬痘，浣熊痘，駱駝痘，或粘液瘤病病毒。根據本發明的另一實施方案，痘病毒載體是金絲雀痘病毒或雞痘病毒(fowlpox)栽體，有利地減毒的金絲雀痘病毒或雞痘病毒(fowlpox)。在這點上，金絲雀痘在登記號VR-111下可從ATCC獲得。減毒的金絲雀痘病毒在美國專利號5，756,103(ALVAC)和WO01/05934中描述。眾多雞痘病毒(fowlpox)疫苗接種林也是可獲得的，例如由MERIAL銷售的DIFTOSECCT林，以及由INTERVET銷售的NOBILISVARIOLE疫苗；並且還參考美國專利號5,766,599，其涉及減毒的雞痘病毒(fowlpox)林TR0VAC。關於生產其重組體以及如何施用其重組體的方法的信息，技術人員可以參考本文引用的文件以及W090/12882，例如關於痘苗病毒可以提及的是美國專利號4，769，330、4，722，848、4，603，112、5，110，587、5，494，807和5，762，938以及其他；關於雞痘(fowlpox),可以提及的是美國專利號5，174，993、5，505，941和US-5，766，599以及其他；關於金絲雀痘，可以提及的是美國專利號5,756,103以及其他；關於豬痘可以提及的是美國專利號5，382，425以及其他；並且關於浣熊痘，可以提及的是WO00/03030以及其他。當表達載體是痘苗病毒時，關於待表達的一種或多種多核苷酸的一個或多個插入位點有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位點，血凝素(HA)基因或插入位點，編碼A型包涵體(ATI)的區域；還參見本文引用的文件，特別是涉及痘苗病毒的那些。在金絲雀痘的情況下，有利地一個或多個插入位點是ORF(s)C3、C5和/或C6;還參見本文引用的文件，特別是涉及金絲雀痘病毒的那些。在雞痘(fowlpox)的情況下，有利地一個或多個插入位點是ORFsF7和/或F8;還參見本文引用的文件，特別是涉及雞痘病毒(fowlpox)的那些。關於MVA病毒的一個或多個插入位點有利地如各種出版物中的，包括CarrollM.W.等人，Vaccine,1997，15(4)，387-394;StittelaarK.J.等人，J.Virol.，2000,74(9)，4236-4243;SutterG.等人，1994，Vaccine,12(11)，1032-1040;並且在這點上還應當注意完整的MVA基因組在AntoineG.，Virology,1998，244，365-396中描述，這使得技術人員能夠使用其他插入位點或其他啟動子。有利地，待表達的多核苷酸插入在特定痘病毒啟動子的控制下，例如痘苗啟動子7.5kDa(Cochran等人,J.Virology,1985，54，30-35),痘苗啟動子I3L(Riviere等人，J.Virology,1992，66，3424-3434)，痘苗啟動子HA(Shida，Virology,1986，150，451-457)，牛痘啟動子ATI(Funahashi等人，J.Gen.Virol.，1988，69，35-47),痘苗啟動子H6(TaylorJ.等人，Vaccine,1988，6，504-508;GuoP.等人，J.Virol.，1989，63,4189-4198;PerkusM.等人，J.Virol.，1989，63，3829-3836)，以及其他。有利地，關於哺乳動物的疫苗接種，表達載體是金絲雀痘或雞痘病毒(fowlpox)。以這種方式，可以表達具有有限或無生產性複製的異源蛋白質。根據本發明的一個實施方案，表達載體是病毒載體，特別是體內表達栽體。在一個有利的實施方案中，表達栽體是腺病毒栽體，例如人腺病毒(HAB)或犬腺病毒(CAV)。有利地，腺病毒是人Ad5栽體、El-刪除和/或斷裂的腺病毒、E3-刪除和/或斷裂的腺病毒、或El-和E3-刪除和/或斷裂的腺病毒。任選地，E4可以從上文描述的任何一種腺病毒中刪除和/或斷裂。例如，Yarosh等人和Lutze-Wallace等人中描述的人Ad5載體可以用於根據本發明的方法表達Nipah病毒糖蛋白基因(參見,例如，Yarosh等人，Vaccine.1996Sep;14(13):1257-64和Lutze-Wallace等人，Biologicals.1995Dec;23(4):271-7)。在一個實施方案中，病毒載體是人腺病毒，特別是通過病毒基因組E1區中的刪除使得不能複製的血清型5腺病毒。刪除的腺病毒在表達E1的293細胞或PER細胞，特別是PER.C6中繁殖(F.Falloux等人HumanGeneTherapy1998,9，1909-1917)。人腺病毒可以在E3區中刪除，並且也在El區中刪除(參見，例如J.Shriver等人，Nature,2002,415，331-335,F.Graham等人MethodsinMolecularBiology第7巻GeneTransferandExpressionProtocolsEditedbyE.Murray,TheHumanPressInc，1991，第109—128頁；Y.Ilan等人Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，2587-2592;S.Tripathy等人Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91，11557-11561;B.TapnellAdv.DrugDeliv.Rev.1993，12,185-199;X.Danthinne等人GeneThrapy2000,7,1707-1714;LBerknerBioTechniques1988，6，616-629;LBerkner等人Nucl.AcidRes.1983，11，6003-6020;C.Chavier等人J.Virol.1996，70，4805-4810)。El和/或E3區部分或完全刪除後，插入位點最後可以是E1和/或E3基因座。有利地，當表達載體是腺病毒時，待表達的多核苷酸插入在真核細胞中起作用的啟動子的控制下，例如強啟動子，優選細胞巨化病毒立即早期基因啟動子(CMV-IE啟動子)。CMV-IE啟動子有利地是鼠類或人來源。也可以使用延伸因子lot的啟動子。在一個具體實施方案中，可以使用由缺氧調節的啟動子，例如在K.Boast等人HumanGeneTherapy1999，13，2197-2208中描述的啟動子HRE。還可以使用肌肉特異性啟動子(X.Li等人Nat.Biotechnol.1999，17，241-245)。強啟動子在本文中還在關於質粒載體時進行了討論。多聚(A)序列和終止序列可以插入待表達的多核苷酸的下遊，例如牛生長激素基因或兔P珠蛋白基因多腺苷酸化信號。在另一實施方案中，病毒載體是犬腺病毒，特別是CAV-2(參見，例如L.Fischer等人，Vaccine,2002，20,3485-3497;美國專利號5,529,780;美國專利號5，688，920;PCT申請號WO95/14102)。對於CAV，插入位點可以在E3區中和/或位於E4區和右ITR區之間的區域中(參見美國專利號6,090,393;美國專利號6,156,567)。在一個實施方案中，插入片段在啟動子的控制下，例如細胞巨化病毒立即早期基因啟動子(CMV-IE啟動子)或已對於人腺病毒載體描述的啟動子。多聚(A)序列和終止序列可以插入待表達的多核苷酸的下遊，例如牛生長激素基因或兔P珠蛋白基因多腺苷酸化信號。在另一具體實施方案中，病毒載體是皰滲病毒例如犬皰滲病毒(CHV)或貓皰滲病毒(FHV)。對於CHV，插入位點可以特別在胸苷激酶基因、0RF3、或UL430RF中(參見美國專利號6，159，477)。在一個實施方案中，待表達的多核苷酸插入在真核細胞中起作用的啟動子的控制下，有利地為CMV-IE啟動子(鼠類或人)。在一個具體實施方案中，可以4吏用由缺氧調節的啟動子，例如在K.Boast等人HumanGeneTherapy1999，13，2197-2208中描述的啟動子HRE。多聚(A)序列和終止序列可以插入待表達的多核苷酸的下遊，例如牛生長激素基因或兔P珠蛋白基因多腺苷酸化信號。根據本發明的一個再進一步的實施方案，表達栽體是質粒載體或DNA質粒栽體，特別是體內表達載體。在一個具體的非限制性例子中，pVR1020或1012質粒(VICALInc.;LukeC.等人，JournalofInfectiousDiseases,1997，175,91-97;HartikkaJ.等人，HumanGeneTherapy,1996，7，1205-1217)可以用作插入多核苷酸序列的載體。pVR1020質粒來源於pVR1012且含有人tPA信號序列。術語質粒涵蓋任何DM轉錄單位，其包含根據本發明的多核苷酸以及對於其在所需宿主或靶的一種或多種細胞中的體內表達所需的元件；並且，在這點上，應當注意超螺旋或非超螺旋的環狀質粒，以及線性形式的質粒預期在本發明的範圍內。每種質粒包含或含有編碼Nipah病毒蛋白質，有利地Nipah病毒糖蛋白、變體、類似物或片段的多核苷酸，或基本上由其組成，所述多核苷酸可操作地連接至啟動子或在啟動子的控制下或依賴於啟動子。一般而言，採用在真核細胞中起作用的強啟動子是有利的。優選的強啟動子是人或鼠類來源的立即早期細胞巨化病毒啟動子(CMV-IE)，或任選具有另一種來源例如大鼠或豚鼠。CMV-IE啟動子可以包含實際啟動子部分，其可以與增強子部分結合或不結合。可以參考EP-A-260148、EP-A-323597、美國專利號5，168，062、5,385，839和4，968，615，以及PCT申請號WO87/03905。CMV-IE啟動子有利地是人CMV-IE(BoshartM.等人，Cell,1985，41，521-530)或鼠類CMV-IE。更一般而言，啟動子為病毒或細胞來源。可以在本發明實踐中有效使用的除CMV-IE以外的強病毒啟動子是SV40病毒的早期/晚期啟動子，或勞斯肉瘤病毒的LTR啟動子。可以在本發明實踐中有效使用的強細胞啟動子是細胞骨架基因的啟動子，例如，結蛋白啟動子(KwissaM.等人，Vaccine,2000,18，2337-2344)，或肌動蛋白啟動子(MiyazakiJ.等人，Gene，1989，79，269-277)。這些啟動子的功能性亞片段，即維持足夠啟動活性的這些啟動子的部分包括在本發明內，例如根據PCT申請號WO98/00166或美國專利號6,156,567的截短的CMV-IE啟動子可以在本發明實踐中使用。因此在本發明實踐中的啟動子包括全長啟動子的衍生物和亞片段，其維持足夠的啟動活性並因此起啟動子的作用，優選啟動活性基本上類似於衍生物或亞片段所來源的實際或全長啟動子的那種，例如類似於美國專利號6，156，567截短的CMV-IE啟動子的活性，或全長CMV-IE啟動子的活性。因此，本發明實踐中的CMV-IE啟動子可以包含全長啟動子的啟動子部分和/或全長啟動子的增強子部分，以及衍生物和亞片段，或基本上由其組成，或由其組成。有利地，質粒包含其他表達控制元件，或基本上由其組成。摻入一種或多種穩定序列是特別有利的，例如一種或多種內含子序列，優選hCMV-IE的第1個內含子(PCT申請號WO89/01036)、兔p珠蛋白基因的內含子II(vanOoyen等人，Science,1979，206,337-344)。關於質粒和除痘病毒以外的病毒載體的多腺苷酸化信號(多聚A)，可以使用牛生長激素(bGH)基因的多聚(A)信號(參見美國專利號5,122,458)，或兔P珠蛋白基因的多聚(A)信號，或SV40病毒的多聚(A)信號。根據本發明的另一實施方案，表達栽體是用於在合適的細胞系統中體外表達蛋白質的表達載體。蛋白質生產可以通過下列發生經由質粒轉染哺乳動物細胞，通過病毒載體在哺乳動物細胞或禽類細胞上複製或不含生產性複製的表達，或通過在昆蟲細胞(例如，Sf9草地貪夜蛾細胞，ATCCCRL1711;還參見美國專利號6,228,846,6,103，526)上的杆狀病毒複製(參見，例如，美國專利號4,745,051;VialardJ.等人，J.Virol.，199064(1)，37-50;VerneA.,Virology,1988,167，56-71),例如苜蓿銀紋夜蛾(J由^r一aca//7"oi7/ca)核型多角體病毒AcNPV。可以使用的哺乳動物細胞有利地是倉鼠細胞(例如CH0或BHK-21)或猴細胞(例如COS或VER0)。表達的蛋白質可以在分泌後或不在分泌後(如果沒有分泌，那麼一般發生或進行細胞裂解)在培養上清液中或從培養上清液中收穫，任選通過濃縮方法例如超濾進行濃縮和/或通過純化方法例如親和、離子交換或凝膠過濾型色語方法進行純化。本領域技術人員應當理解用於培養宿主細胞的條件根據具體基因而變，並且有時候需要例行實驗以測定取決於宿主細胞的用於培養Nipah病毒蛋白質，有利地Nipah病毒糖蛋白的最佳條件。"宿主細胞"指已遺傳改變、或能夠通過施用外源多核苷酸例如重組質粒或載體遺傳改變的原核或真核細胞。當提及遺傳改變的細胞時，該術語指最初改變的細胞及其後代。包含所需序列的多核苷酸可以插入合適的克隆或表達載體內，並且載體隨後可以引入合適的宿主細胞用於複製和擴增。多核苷酸可以通過本領域已知的任何方法引入宿主細胞。含有目的多核苷酸的載體可以通過許多合適方法中的任何一種引入宿主細胞，包括直接攝取，內吞作用，轉染，f交配，電穿孔，使用氯化4丐、氯化銣、磷酸4丐、DEAE-葡聚糖、或其他物質的轉染；微粒轟擊；脂轉染；以及感染(其中栽體是有傳染性的，例如，逆轉錄病毒載體)。引入載體或多核苷酸的選擇通常將取決於宿主細胞的特徵。在一個有利的實施方案中，本發明提供了用於在靶細胞中遞送和表達Nipah病毒蛋白質，有利地Nipah病毒糖蛋白的治療有效量的製劑的施用。治療有效量的確定對於本領域普通技術人員是例行實驗。在一個實施方案中，製劑包含表達載體和藥學或獸醫學可接受的運載體、媒介物或賦形劑，所述表達栽體包含表達Nipah病毒蛋白質，有利地Nipah病毒糖蛋白的多核苷酸。在一個有利的實施方案中，藥學或獸醫學可接受的運栽體、媒介物或賦形劑促進載體或蛋白質的轉染和/或改善其保存。藥學或獸醫學可接受的運載體、或媒介物或賦形劑是本領域技術人員眾所周知的。例如，藥學或獸醫學可接受的運載體、或媒介物或賦形劑可以是0.9%NaCl(例如鹽水)溶液或磷酸鹽緩沖液。可以用於本發明方法的其他藥學或獸醫學可接受的運載體、或媒介物或賦形劑包括，但不限於，多聚-(L-穀氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。藥學或獸醫學可接受的運載體、或媒介物或賦形劑可以是促進載體施用(或由本發明的載體體外表達的蛋白質)的任何化合物或化合物組合；有利地，運載體、或媒介物或賦形劑可以促進栽體(或蛋白質)的轉染和/或改善其保存。劑量和劑量體積在本文的一般描述中討論並且還可以通過技術人員由本公開內容結合本領域的知識，無需任何過度實驗而測定。含有有利地但不是唯一適合於質粒的季銨鹽的陽離子脂質有利地是具有下式的那些R:p0—CH廠CH-CH廠N—R廠XORCH，其中l是含有12-18個碳原子的飽和或未飽和的直鏈脂肪族基團，R2是含有2或3個碳原子的另一種脂肪族基團，並且X是氨基或羥基，例如DMRIE。在另一實施方案中，陽離子脂質可以與中性脂質例如DOPE結合。在這些陽離子脂質中，優先考慮DMRIE(N-(2-羥乙基)-N，N-二曱基-2，3-二(十四烷氧基)-l-丙烷銨；WO96/34109)，有利地與中性脂質，有利地為D0PE(二油醯-磷脂醯-乙醇胺；BehrJ.P.,1994，BioconjugateChemistry,5，382-389)結合，以形成DMRIE-D0PE。有利地，質粒與佐劑的混合物臨時且有利地與製劑施用同時或在製劑施用之前不久形成；例如，有利地在施用之前或以前不久，形成質粒-佐劑混合物，以便在施用以前給出足夠的時間用於使混合物形成複合物，例如在施用以前約10-約60分鐘，例如在施用以前約30分鐘。當存在D0PE時，DMRIE:D0PE摩爾比有利地是約95:約5-約5:約95，更有利地約1:約l，例如l:1。DMRIE或DMRIE-D0PE佐劑質粒重量比可以是約50:約1-約1:約10，例如約10:約l-約l:約5,並且有利地約1:約1-約1:約2，例如1:1-1:2。在一個具體實施方案中，藥物組合物在體內直接施用，並且編碼產物通過載體在宿主中表達。編碼Nipah病毒蛋白質，有利地Nipah病毒糖蛋白的栽體的體內遞送方法(參見，例如美國專利號6，423，693;專利出版物EP1052286，EP1205551，美國專利出版物20040057941，WO9905300和Draghia-Akli等人，MolTher.2002Dec;6(6):830-6，其公開內容整體引入作為參考)可以修改以遞送本發明的Nipah病毒蛋白質，有利地Nipah病毒糖蛋白。本發明所述編碼Nipah病毒蛋白質，有利地Nipah病毒糖蛋白的載體的體內遞成。有利地，根據本發明的藥物和/或治療組合物和/或製劑包含有效量的如本文討論的一種或多種表達載體和/或多肽、或基本上由其組成、或由其組成，以誘發治療應答；並且，有效量可以根據本公開內容包括引入本文的文件，以及本領域的知識，無需過度實驗而測定。根據本發明的免疫原性組合物和疫苗可以包含一種或多種佐劑，或基本上由其組成。用於在本發明實踐中使用的特別合適的佐劑是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，馬來酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS),例如含有一個或多個非甲基化CpG單位的寡脫氧核糖核苷酸序列(KlinmanD.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，1996，93，2879-2883;W098/16247),(3)水包油乳劑，例如由M.Powell,M.Newman,PlenumPress1995出版的"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"第147頁上描述的SPT乳劑，以及相同作品第183頁上描述的乳劑MF59，(4)含有季銨鹽的陽離子脂質，(5)細胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁或(7)本申請中引用並引入作為參考的任何文件中討論的其他佐劑，或U)其任何組合或混合物。特別適合於病毒載體的水包油乳劑(3)可以基於-輕液體石蠟油(歐洲藥典型)，-類異戊二烯油例如角鯊烷、角鯊烯，-由烯烴例如異丁烯或癸烯寡聚化產生的油，-含有直鏈烷基的酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或-分支脂肪醇或酸的酯，特別是異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳劑。乳化劑可以是非離子型表面活性劑，例涉o:-在一方面失水山梨醇、甘露醇(例如甘露醇酐油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇的酯，以及另一方面油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥硬脂酸的酯，所述酯任選是乙氧基化的，-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如Pluronic,例如L121。在(l)型佐劑聚合物中，優先考慮交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸，特別是由糖或多元醇的聚烯基醚交聯的聚合物。這些化合物已知為卡波姆(Pharmeuropa，第8巻，no.2，June1996)。本領域技術人員還可以參考美國專利號2,909,462，其提供了由含有至少3個羥基、優選不超過8個此類基團的多羥基化合物交聯的此類丙烯酸聚合物，至少3個輕基的氫原子被含有至少2個碳原子的未飽和的脂肪族基團取代。優選的基團是含有2-4個碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基和其他烯式未飽和的基團。未飽和的基團還可以含有其他取代基，例如曱基。在名稱Carbopol(BFGoodrich,Ohio,USA)下出售的產品是特別合適的。它們通過烯丙基蔗糖或通過烯丙基季戊四醇交聯。在它們中，可以提及卡波姆974P、934P和971P。關於馬來酸酐-烯基衍生物共聚物，優先考慮EMA(Monsanto)，這是直鏈或交聯的乙烯基-馬來酸酐共聚物，並且它們例如通過二乙烯醚交聯。還可以參考J.Fields等人，Nature186:778-780，June4,1960。關於結構，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA優選通過具有下式的基本單位形成formulaseeoriginaldocumentpage27其中-ld和R2,其可以是相同或不同的，表示H或CH3-x=0或1，優選x=1一y-l或2，同時x+y-2。對於EMA,x=0和y=2並且對於卡波姆x=y=1。這些聚合物可溶於水或生理鹽溶液(20g/1NaCl)，並且pH可以通過例如蘇打(NaOH)調整至7.3-7.4，以提供其中表達載體可以摻入的佐劑溶液。最終疫苗組合物中的聚合物濃度可以是0.01-1.5%w/v，有利地0.05-1%w/v，並優選0,1-0.4%w/v。本領域技術人員根據本公開內容和本領域的知識可以確定用於每次免疫接種或疫苗接種方案和物種的有效質粒劑量。在一個有利的實施方案中，根據本發明的藥物和/或治療組合物和/或製劑通過注射施用，例如但不限於，肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)注射。關於此類治療組合物，根據本文的公開內容和本領域的知識，無需任何過度實驗，技術人員就可以確定用於每個注射方案的施用次數、施用途徑和劑量。在一個有利的實施方案中，重組疫苗可以以每次劑量，例如每2ml劑量約至少103pfu的量施用於豬或感染或轉染到細胞內；更優選約104pfu-約101。pfu,例如約105pfu-約109pfu，例如約106pfu-約108pfn。在一個特別有利的實施方案中，劑量為每次劑量約108pfu。方法包括給動物至少施用一次有效量的根據本發明的治療組合物。動物可以是雄性、雌性、妊娠雌性和新生兒。這種施用可以特別通過肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)注射或經由鼻內或口部施用完成。在一個有利的實施方案中，根據本發明的治療組合物可以通過注射器或無4十器械(如，例如Pigjet、Biojector或Vitajet(Bioject，Oregon,USA))施用。施用質粒的另一種方法是使用電穿孔，參見，例如S.Tollefsen等人，Vaccine,2002，20，3370-3378;S.Tollefsen等人，Scand.J.Immunol.,2003，57，229-238;S.Babiuk等人，Vaccine,2002,20，3399-3408;PCT申請號WO99/01158。本發明涉及用於在動物中針對Nipah病毒感染進行疫苗接種的藥物組合物的用途。本發明涉及用於在動物中針對Hendra病毒感染進行疫苗接種的藥物組合物的用途。在一個具體實施方案中，根據本發明包含NipahF和NipahG的藥物組合物用於在動物中針對由Nipah或Hendra病毒引起的感染進行疫苗接種。在一個有利的實施方案中，動物是豬。在其他有利的實施方案中，動物是貓、狗、馬或人。本發明還提供了用於預防Nipah病毒在第一種動物和第二種動物之間傳播的方法，其包含使用本文描述的任何方法在第一種動物中免疫或誘發免疫應答以預防疾病傳播給第二種動物。本發明還提供了用於預防Hendra病毒從受感染的動物傳播給另一種動物的方法，其包含使用本文描述的任何方法在第一種動物中免疫或誘發免疫應答以預防疾病傳播給第二種動物。在一個具體實施方案中，根據本發明包含NipahF和NipahG的藥物組合物用於4十對由Nipah或Hendra病毒引起的感染疫苗接種所述第一種動物。在一個有利的實施方案中，其中第一種動物是豬。第二種動物是貓、狗、或馬，有利地人。本發明還提供了用於執行上文所述的任何方法的試劑盒，其包含上文所述的任何組合物，以及任選地用於執行方法的說明書。本發明現在將經由下列非限制性實施例進一步描述。實施例實施例1:構建體質粒pSL-6802-1-4的構建。pSL-6802-1-4包含C5基因座的側翼序列、H6痘苗啟動子和GNipah病毒基因以產生VCP2199。Nipah病毒從人CSF中分離。NipahG基因進行PCR擴增並插入質粒pTMl內，產生pTMlNipahG。目的是構建pC5H6pNipahG供體質粒用於產生表達NipahG的重組ALVAC金絲雀痘病毒。質粒名稱是pC5H6pNipahG，pSL-6802-1-4。質粒主鏈是pCXL-148-2,包含H6痘苗啟動子的pC5H6p，對應插入片段的C5基因座的左和右臂。質粒pCXL-148-2通過在C5右臂中從T到C的單鹼基突變由質粒pNVQH6C5LSP-18獲得。質粒pNVQH6C5LSP-18在S.Loosmore等人US2005/0031641中描述。NipahG基因使用pTMlNipahG作為模板以及引物11470.SL和11471.SL進行PCR擴增(圖2B)。將~1.8kbPCR片段克隆到pCR2.1內，產生克隆pSL-6771-l-l(pCR2.1H6pNipahG),這通過序列分析進行確i人(圖2C)。將來自pSL-6771-l-l的~1.8kbNruI-XhoIH6pNipahG片段克隆到pCXL-148-2(pC5H6p)內，產生pSL-6802-l-4(pC5H6pNipahG)，這通過序列分析進行確認(圖2C和2D)。質粒pSL-6802-2-5的構建。pSL-6802-2-5包含F8基因座的側翼序列、H6痘苗啟動子和GNipah病毒基因以產生VFP2200。Nipah病毒從人CSF中分離。NipahG基因進行PCR擴增並插入質粒pTMl內，產生pTMlNipahG。目的是構建pF8H6pNipahG供體質粒用於產生表達NipahG的重組雞痘病毒(fowlpox)。質粒名稱是pF8H6pNipahG，pSL-6802-2-5。質粒主鏈是pSL-6427-2-1，包含H6痘苗啟動子的pF8H6p，插入片段的F8基因座的左和右臂。質粒pSL-6427-2-l通過在F8左臂中從C到T的單鹼基突變由質粒pSL-5440-5-l獲得。質粒pSL-5440-5-l在S.Loosmore等人US2005/0031641中描述。NipahG基因使用pTMlNipahG作為模板以及引物11470.SL和11471.SL進行PCR擴增(圖3A)。將~1.8kbPCR片段克隆到pCR2.1內，產生克隆pSL-6771-l-l(pCR2.1H6pNipahG)，這通過序列分析進行確認(圖3B)。將來自pSL-6771-l-l的~1.8kbNruI-XhoIH6pNipahG片段克隆到pSL-6427-2-l(pF8H6p)內，產生pSL-6802-2-5(pF8H6pNipahG)，這通過序列分析進行確認(圖3B和3C)。質粒pSL-6839-1的構建。pSL-6839-1包含F8基因座的側翼序列、H6痘苗啟動子和FNipah病毒基因以產生VFP2207。Nipah病毒從人CSF中分離。NipahF基因進行PCR擴增並插入質粒pTMl內，產生pTMlNipahF。目的是構建pF8H6pNipahF供體質粒用於產生表達NipahF的重組雞痘病毒(fowlpox)。質粒名稱:pF8H6pNipahF，pSL-6839-l。質粒主鏈是pSL-6427-2-l，包含H6痘苗啟動子的pF8H6p，插入片段的F8基因座的左和右臂。NipahF中的內部T5NT序列通過定點誘變去除。編碼H6啟動子的3，末端和NipahF基因的5，末端的片段使用引物11457.SL和11458.SL進行PCR擴增。在擴增的片段中，去除T5NT序列並引入ApaI位點用於克隆目的(圖4B)。將片段克隆到pCR2.1內，產生pSL-6797-3-l(pCR2.1H6p5，-NipahF，無T5NT)，這通過序列分析進行確認(圖4C)。3，-NipahF片段使用引物11456.SL和11459.SL進行PCR擴增。在擴增的片段中，去除T5NT序列並引入ApaI位點用於克隆目的(圖4B)。將片段克隆到pCR2.1內，產生pSL-6797-4-1(pCR2.13，-NipahF，無T5NT)，這通過序列分析進4亍確i^(圖4C)。將來自pSL-6797-3-l的~0.7kbNruI-BamHIH6p5，-NipahF片段插入pSL-6427-2-l(pF8H6p)內，產生pSL-6830-1(pF8H6p5，-NipahF)。將來自pSL-6797-4-1的~1.OkbApaI-BamHI3，-NipahF片段插入pSL-6830-l的ApaI和BamHI之間，產生pSL-6839-1(pF8H6pNipahF)，這通過序列分析進行確認(圖4C和4D)。質粒pSL-6851-29的構建。pSL-6851-29包含C5基因座的側翼序列、H6痘苗啟動子和FNipah病毒基因以產生VCP2208。Nipah病毒從人CSF中分離。NipahF基因進行PCR擴增並插入質粒pTMl內，產生pTMlNipahF。目的是構建pC5H6pNipahF供體質粒用於產生表達NipahF的重組ALVAC金絲雀痘病毒。質粒名稱是pSL-6851-29，pC5H6pNipahF。質粒主鏈是pCXL-148-2，包含H6痘苗啟動子的pC5H6p,插入片段的C5基因座的左和右臂。NipahF中的內部T5NT序列通過定點誘變去除。編碼H6啟動子的3，末端和NipahF基因的5，末端的片段使用引物11457.SL和11458.SL進行PCR擴增。在擴增的片段中，去除T5NT序列並引入ApaI位點用於克隆目的(圖5A)。將片段克隆到pCR2.1內，產生pSL-6797-3-1(pCR2.1H6p5，-NipahF，無T5NT)，這通過序列分析進行確認(圖5B)。3，-NipahF片段使用引物11456.SL和11459.SL進行PCR擴增。在擴增的片段中，去除T5NT序列並引入ApaI位點用於克隆目的(圖5A)。將片段克隆到pCR2.1內，產生pSL-6797-4-1(pCR2.13，-NipahF，無T5NT)，這通過序列分析進行確認(圖5B)。將來自pSL-6797-3-1的~0.7kbNruI-BamHIH6p5，-NipahF片段插入pSL-6427-2-l(pF8H6p)內，產生pSL-6830-l(pF8H6p5，-NipahF)。將來自pSL-6797-4-l的~1.OkbApaI-BamHI3，-NipahF片段插入pSL-6830-l的ApaI和BamHI之間，產生pSL-6839-1(pF8H6pNipahF),這通過序列分析進行確認。將來自pSL-6839-l的1.7kbNruI-XmaIH6pNipahF片段插入pCXL-148-2(pC5H6p)內，以產生pSL-6851-29(pC5H6pNipahF),這通過序列分析進行確認(圖5B和5C)。表達NipahF的重組雞痘病毒(fowlpox)vFP2207的構建。基因是NipahF。供體質粒是pSL-6839-1。插入位點是雞痘病毒(fowlpox)的F8基因座。啟動子是痘苗病毒H6啟動子。用於體外重組的細胞是在10%FBS和DMEM中生長的原代雞胚成纖維細胞(1°CEF)。體外重組通過用NotI-線性化供體質粒pSL-6839-l(20ug)轉染1°CEF細胞來進行。轉染的細胞隨後用雞痘病毒(fowlpox)作為拯救病毒在MOI為10時感染。48小時後，收穫轉染-感染的細胞，超聲處理並用於重組病毒篩選。重組空斑基於空斑轉印雜交方法使用NipahF特異性探針進行篩選，所述探針用辣根過氧化物酶標記。連續4輪空斑純化後，產生命名為vCP2207的重組體並通過對於插入片段為100。/。陽性和對於F80RF為100%陰性的雜交來確認。表達NipahG的重組金絲雀痘病毒vCP2199的構建。基因是NipahG。供體質粒是pSL-6802-1-4。插入位點是C5。啟動子是H6啟動子。用於體外重組的細胞是在10%FBS和DMEM中生長的原代雞胚成纖維細胞(1。CEF)。體外重組通過用NotI-線性化供體質粒pSL-6802-l-4(15ug)轉染1°CEF細胞來進行。轉染的細胞隨後用ALVAC作為拯救病毒在MOI為10時感染。24小時後，收穫轉染-感染的細胞，超聲處理並用於重組病毒篩選。重組空斑基於空斑轉印雜交方法使用NipahG特異性探針進行篩選，所述探針用辣根過氧化物酶標記。連續5輪空斑純化後，產生命名為vCP2199的重組體並通過對於NipahG插入片段為100。/。陽性和對於C5ORF為100%陰性的雜交來確認。表達NipahG的重組雞痘病毒(fowlpox)vCP2200的構建。基因是NipahG。供體質粒是pSL-6802-2-5。插入位點是F8。啟動子是H6啟動子。用於體外重組的細胞是在10%FBS和DMEM中生長的原代雞胚成纖維細胞(1。CEF)。體外重組通過用NotI-線性化供體質粒pSL-6802-2-5(15ug)轉染1°CEF細胞來進行。轉染的細胞隨後用雞痘病毒(fowlpox)作為拯救病毒在MOI為8時感染。48小時後，收穫轉染-感染的細胞，超聲處理並用於重組病毒篩選。重組空斑基於空斑轉印雜交方法4吏用NipahG特異性探針進行篩選，所述探針用辣根過氧化物酶標記。連續4輪空斑純化後，產生命名為vFP2200的重組體。它們通過對於NipahG插入片段為100。/。陽性和對於F8ORF為100%陰性的雜交來確認。表達NipahF的重組金絲雀痘病毒vCP2208的構建。基因是NipahF。供體質粒是pSL6851.29(pC5H6pNipahF)。插入位點是C5。啟動子是痘苗H6啟動子。用於體外重組的細胞是在10%FBS和DMEM中生長的原代雞胚成纖維細胞(1°CEF)。體外重組通過用NotI-線性化供體質粒pSL6851.29(10ug)轉染1°CEF細胞來進行。轉染的細胞隨後用ALVAC作為拯救病毒在MOI為10時感染。24小時後，收穫轉染-感染的細胞，超聲處理並用於重組病毒篩選。重組空斑基於空斑轉印雜交方法使用NipahF特異性探針進行篩選，所述探針用辣根過氧化物酶標記。連續4輪空斑純化後，產生命名為vCP2208的重組體並通過對於NipahF插入片段為100%陽性和對於C5ORF為100%陰性的雜交來確認。實施例2:表達雞痘病毒(fowlpox)NipahGvFP2200的蛋白質印跡(圖6)。原代CEF細胞用vCP2199(ALVACC5H6pNipahG)和vFP2200(雞痘病毒(fowlpox)F8H6pNipahG)在MOI為10時感染，並於37T孵育24小時。隨後收穫細胞和培養物上清液。樣品蛋白質在10%SDS-PAGE凝膠上分離、轉移至Immobilon尼龍膜。使用豚鼠抗血清和化學發光系統。NipahG在vCP2199和vFP2200的細胞沉澱中表達。它不在上清液中出現。ALVACNipahFvCP2208的蛋白質印跡(圖7A和7B)。原代CEF細胞用vCP2208(ALVACC5H6pNipahF)在MOI為10時感染，並孵育24小時。收穫上清液並澄清。收穫細胞並懸浮於水中以裂解。裂解物和上清液通過10%SDS-PAGE分離。將蛋白質轉移至尼龍膜並用Western封閉緩沖液封閉。使用豚鼠抗血清和化學發光顯色系統顯示來自vCP2208(ALVACC5H6pNipahF)的F蛋白質的表達。使用豬抗血清和辣根過氧化物酶系統同樣顯示來自vCP2208的F蛋白質的表達，但強度較低。ALVACNipahGvCP2199的蛋白質印跡(圖6)。原代CEF細胞用vCP2199(ALVACC5H6pNipahG)和vFP2200(雞痘病毒(fowlpox)F8H6pNipahG)在MOI為10時感染，並於37。C孵育24小時。隨後收穫細胞和培養物上清液。樣品蛋白質在10WSDS-PAGE凝膠上分離、轉移至Immobilon尼龍膜。使用豚鼠抗血清和化學發光系統。NipahG在vCP2199和vFP2200的細胞沉澱中表達。它不在上清液中出現。雞痘病毒(fowlpox)NipahFvFP2207的蛋白質印跡(圖7A和7B)。原代CEF細胞用vFP2207(雞痘病毒(fowlpox)F8H6pNipahF)在MOI為10時感染，並孵育24小時。收穫上清液並澄清。收穫細胞並懸浮於水中以裂解。裂解物和上清液通過10。/。SDS-PAGE分離。將蛋白質轉移至尼龍膜並用Western封閉緩沖液封閉。使用豚鼠抗血清和化學發光顯色系統顯示來自vFP2207(雞痘病毒(fowlpox)F8H6pNipahF)的F蛋白質的表達。使用豬抗血清和辣根過氧化物酶系統同樣顯示來自vFP2207的F蛋白質的表達，但強度較低。實施例3:血清學和保護16頭豬隨機分為4個組。F組的動物用表達Nipah病毒F蛋白質的108pfu/劑量的VCP2208免疫。G組的動物用表達Nipah病毒G蛋白質的108pfu/劑量的VCP2199免疫。G+F組的動物用含有分別表達Nipah病毒G和F蛋白質的108pfu/劑量的VCP2199和108pfu/劑量的VCP2208的混合物免疫。攻擊組的動物是未接種疫苗的對照動物。豬在第0天和第14天時通過肌內途徑注射。豬在第28天時通過鼻內接種2.5xl05pfu的Nipah病毒進行攻擊。攻擊後7天，通過RT-PCR或各種器官和鼻拭子中的病毒分離鑑別病毒的存在。在第一次注射後的第0天、第7天、第14天、第21天、第28天、第29天、第30天、第31天、第32天、第34天和第35天收集血液樣品，並通過IgG間接ELISA或血清中和測定法測量抗體滴度。中和抗體在微量滴定空斑減少中和測定法(mPRNT)中如先前所述(H.Weingartl等人，Can.J.Vet.Rrs.2003，67，128—132),4吏用VeroV-76細胞和1%羧甲基纖維素覆蓋進行測定。空斑減少90%的孔視為對於Nipah病毒中和抗體存在陽性。ELISA和中和滴度(NT)的數據呈現於表1中。組合的NipahF/G在攻擊前誘導最高的中和滴度，其次是G疫苗。F疫苗誘導較低的中和抗體。病毒空斑測定法:病毒空斑須'J定'法在12孑L板(Costar，Corning,NY)中使用匯合單層的Vero76或PT-K75進行。病毒接種物(400p1/孔)在細胞上於33。C,5%(:02孵育1小時，隨後替換為2ml2。/。的羧甲基纖維素、鈉鹽、培養基粘度/DMEM(SigmaChemical,St.Louis，M0)/2。/。FBS覆蓋，並於33。C，5%0)2孵育。5天後細胞用4%甲醛固定並用0.5%結晶紫/80。/。曱醇/PBS染色。根據V.Guillaume等人J.Virol.Method.2004，120，229-237,使用SmartCycler(Cepheid)、Quantitech試劑盒(Qiagen)、以及位於N基因內的引物和探針(AppliedBiosystemsInternational)只對血清/血漿和PMBC樣品進行實時RT-PCR。正向引物GCACTTGATGTGATTAGA(SEQIDNO:29)和反向引物GGCAGTGTCGGGAGCTGTAA(SEQIDNO:30)位於N基因內，產生395bp的擴增子。實時RT-PCR使用克隆到pSHAME2a質粒內的Nipah病毒N基因用在100pl樣品中300個拷貝/反應的靈敏度進行標準化。在35個循環時變成陽性的樣品視為陰性。Nipah病毒在豬#33(1個空斑)、#35(1個空斑)和#36的三叉神經節中以非常低的滴度分離。在對照動物中，Nipah病毒可以從許多組織中以高達10e3pfu/ml分離豬#39在鼻甲、氣管、嗅球、三叉神經節、細支氣管淋巴結和頜下淋巴結(LN)中陽性；豬#40在鼻曱、氣管、嗅球、腦膜、三叉神經節、細支氣管LN、頜下LN和腦中陽性。RT-PCR結果在表2和3中提供。數字是閾值循環數。在用F/G疫苗免疫的豬的免疫豬血漿、血清或PBMC中沒有檢測到RNA。這些結果顯示使用表達Nipah病毒F或G蛋白質的重組體的明確保護，以及使用Nipah病毒F+G蛋白質組合的完整保護。實施例4:交叉中和18頭豬隨機分為4個組。F組的4隻動物用表達Nipah病毒F蛋白質的108pfu/劑量的vCP2208免疫。G組的4隻動物用表達Nipah病毒G蛋白質的108pfu/劑量的vCP2199免疫。G+F組的4隻動物用含有分別表達Nipah病毒G和F蛋白質的108pfu/劑量的vCP2199和10spfu/劑量的vCP2208的混合物免疫。作為未接種疫苗的對照組，6隻動物用Nipah病毒天然感染並攜帶高達感染後28天(dpi)。這個組命名為"長期感染"。F、G和G+F組的豬在第0天和笫14天時通過肌內途徑注射。在疫苗接種後第27天時(dpv或疫苗接種後天數)收集血液樣品，並通過血清中和測定法測量抗體滴度。中和抗體在微量滴定空斑減少中和測定法(mPRNT)中如先前所述(H.Weingartl等人，Can.J.Vet.Rrs.2003，67，128-132)，使用VeroV-76細胞進行測定，所述VeroV-76細胞以1.2xl(T細胞/cm2(40,000細胞/孔)接種在96孔板中並用補充10%FBS的DMEM培養基在5%C0237。C下孵育。100jaL系歹'J2倍稀釋血清(1/10-1/1280)與100jiLHendra或Nipah病毒一起在5%C0237匸下孵育1小時，所述病毒調整至含有1000PFU/100yL。所有稀釋在DMEM中進行。孵育後將100juL上述混合物轉移到V76單層細胞上。含接種物的板在5%C0237。C下孵育1小時。1小時後去除接種物並替換為100yL溶於補充2%FBS的DMEM的2%羧甲基纖維素溶液。板在5%(:0237。C下孵育72小時。對於Nipah病毒的反向滴定產生工作液稀釋度為500PFU/孔的結果，並且對於Hendra病毒625PFU/孔。注意來自用F蛋白質疫苗接種的豬的血清從1/50進行2倍稀釋至1/2400。空斑減少90%的孔視為對於Nipah病毒中和抗體存在或對於Hendra病毒中和抗體存在為陽性。中和滴度的數據呈現於表4中。組合的NipahF/G誘導了用於生產針對Nipah病毒的抗體的協同效應，這在天然感染Nipah病毒的過程中不會產生(參見長期感染組的結果)。G疫苗或F疫苗單獨不誘導針對Nipah病毒的中和抗體，或比F+G疫苗誘導更低的中和抗體。在針對Nipah病毒的抗體滴度水平和針對Nipah病毒的那些之間沒有關聯。表l:ELISA和NT數據(dpv-疫苗接種後天數，dpi-感染後天數)tableseeoriginaldocumentpage37表2:組織中的實時RT-PCR(CSF-腦脊液，LN-淋巴結)tableseeoriginaldocumentpage38表3:實時RT-PCR,咽拭子tableseeoriginaldocumentpage39表4:中和滴度tableseeoriginaldocumentpage40本發明由下列已編號的段落進一步描述:1.一種禽痘病毒表達載體，其包含編碼Nipah病毒糖蛋白的多核苷酸。2.段落1的禽痘病毒表達栽體，其中所述Nipah病毒糖蛋白是附著(G)蛋白。3.段落1的禽痘病毒表達載體，其中所述Nipah病毒糖蛋白是融合(F)蛋白。4.段落1的禽痘病毒表達栽體，其中所述Nipah病毒糖蛋白是附著(G)蛋白和融合(F)蛋白。5.段落2的禽痘病毒表達載體，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸8943-核苷酸10751的核苷酸鹼基序列。6.段落3的禽痘病毒表達栽體，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸6654-核苷酸8294的核苷酸鹼基序列。7.段落4的禽痘病毒表達栽體，其中所述多核苷酸編碼SEQIDNO:8的肽。8.段落2的禽痘病毒表達栽體，其中所述多核苷酸編碼SEQIDNO:7的肽。9.段落3的禽痘病毒表達載體，其中所述多核苷酸編碼SEQIDNO:7的肽和SEQIDNO:8的肽。10.段落5的禽痘病毒表達載體，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸6654-核苷酸10751的核苷酸鹼基序列。11.段落1-10的禽痘病毒表達載體，其中所述禽痘病毒表達栽體是減毒的禽痘病毒表達載體。12.段落l-ll的禽痘病毒表達載體，其中所述禽痘病毒表達載體是金絲雀痘病毒載體。13.段落12的金絲雀痘病毒載體，其中所述金絲雀痘病毒載體是ALVAC。14.段落l-11的禽痘病毒表達栽體，其中所述禽痘病毒表達栽體是雞痘病毒(fowlpox)載體。".段落l4的雞痘病毒(fowlpox)載體，其中所述雞痘病毒(fowlpox)載體是TROVAC。16.—種表達載體，其中所述表達載體是vCP2199。17.—種表達載體，其中所述表達載體是vCP2208。18.—種表達載體，其中所述表達栽體是vFP2200。19.一種表達載體，其中所述表達載體是vVP2207。20.—種用於遞送和表達Mpah病毒糖蛋白的製劑，其中所述製劑包含段落1-19中任何一段的栽體和藥學或獸醫學可接受的運載體、媒介物或賦形劑。21.段落20的製劑，其中所述運載體、媒介物或賦形劑促進所述栽體的轉染和/或改善其保存。22.—種將Nipah病毒糖蛋白遞送至動物的方法，其包含給所述動物施用段落21或22的製劑。23.段落22的方法，其中所述動物是豬。24.—種在動物中誘發免疫應答的方法，其包含以有效量施用包含段落1-19中任何一段的載體的組合物用於誘發免疫應答。25.—種在動物中誘發免疫應答的方法，其包含以有效量施用包含細胞的組合物用於誘發免疫應答，其中所述細胞包含段落1-19中任何一段的載體。26.—種在動物中誘導免疫或保護性應答的方法，其包含以有效量施用包含段落1-19中任何一段的載體的組合物用於誘發免疫應答。27.—種在動物中誘導免疫或保護性應答的方法，其包含以有效量施用包含細胞的組合物用於誘發免疫應答，其中所述細胞包含段落1-19中任何一段的栽體。28.段落24-27中任何一段的方法，其中所述動物是豬。29.—種用於預防Nipah病毒在第一種動物和第二種動物之間傳播的方法，其包含段落24-27中任何一段的方法，其中段落24-27中任何一段的動物是第一種動物。30.段落29的方法，其中所述第一種動物是豬。31.段落29或30的方法，其中所述第二種動物是人。32.段落29或30的方法，其中所述第二種動物是貓或狗。33.—種用於執行段落22-32中任何一段的方法的試劑盒，其包含段落1-19中任何一段的載體或段落20或21中任何一段的製劑，以及用於執行所述方法的說明書。***鑑於因此詳細描述的本發明的有利實施方案，應當理解由上文段落限定的本發明不限於上文說明書中闡述的具體細節，因為無需背離本發明的精神或範圍即可進行其許多顯而易見的變化。權利要求1.一種禽痘病毒表達載體，其包含編碼Nipah病毒糖蛋白的多核苷酸。2.權利要求1的禽痘病毒表達載體，其中所述Nipah病毒糖蛋白是附著(G)蛋白。3.權利要求1的禽痘病毒表達栽體，其中所述Nipah病毒糖蛋白是融合(F)蛋白。4.權利要求1的禽痘病毒表達載體，其中所述Nipah病毒糖蛋白是附著(G)蛋白和融合(F)蛋白。5.權利要求1的禽痘病毒表達載體，其中所述禽痘病毒表達栽體是減毒的禽痘病毒表達載體。6.權利要求1的禽痘病毒表達載體，其中所述禽痘病毒表達栽體是金絲雀痘病毒載體。7.權利要求6的金絲雀痘病毒栽體，其中所述金絲雀痘病毒載體是ALVAC。8.權利要求1的禽痘病毒表達載體，其中所述禽痘病毒表達載體是雞痘病毒(fowlpox)載體。9.權利要求8的雞痘病毒(fowlpox)載體，其中所述雞痘病毒(fowlpox)載體是TROVAC。10.權利要求l的表達栽體，其中所述表達載體是vCP2199。11.權利要求l的表達載體，其中所述表達載體是vCP2208。12.權利要求l的表達載體，其中所述表達載體是vFP2200。13.權利要求l的表達載體，其中所述表達載體是vVP2207。14.一種用於遞送和表達Nipah病毒糖蛋白的製劑，其中所述製劑包含權利要求1的栽體和藥學或獸醫學可接受的運栽體、媒介物或賦形劑。15.權利要求14的製劑，其中所述運栽體、媒介物或賦形劑促進所述載體的轉染和/或改善其保存。全文摘要本發明涉及重組抗Nipah病毒疫苗以及此類疫苗給動物有利地豬的施用。有利地，抗Nipah病毒疫苗可以包含含有Nipah病毒糖蛋白基因的重組禽痘病毒。本發明包括通過施用抗Nipah病毒疫苗給動物有利地豬接種疫苗的方法，所述疫苗包含重組禽痘病毒，所述禽痘病毒可以含有Nipah病毒糖蛋白基因。文檔編號A61K39/155GK101208104SQ200680022718公開日2008年6月25日申請日期2006年4月14日優先權日2005年4月25日發明者J·C·F·奧多納特申請人:梅瑞爾有限公司