一種特異性標記根毛微絲的Marker的製作方法

2023-05-21 08:10:06

一種特異性標記根毛微絲的Marker的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種特異性標記根毛微絲的Marker，屬於生物【技術領域】。本發明的Marker為能夠在根毛中特異性表達的質粒ProE7：mRFP-mTalin，該質粒是以pB7WG2.0為骨架載體，將pB7WG2.0的35S替換為ProE7，GW替換為mRFP-mTalin。其中，ProE7為根毛特異性啟動子，mRFP為紅色螢光蛋白基因，mTalin為能夠特異性標記微絲的Marker基因，ProE7與mRFP-mTalin的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和2所示。本發明的Marker轉入植物中可以觀察植物根毛中微絲的形態分布，微絲被標記為紅色，對於研究植物根毛中微絲的功能有著非常重要的意義。
【專利說明】-種特異性標記根毛微絲的Marker

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種特異性標記根毛微絲的Marker。

【背景技術】
[0002] 隨著生物技術的不斷發展，一些標記細胞特定結構的Marker不斷出現。例如Van Bruaene N等利用特異性標記微管的Marker :MBD觀察到在根毛生長的起始、延伸、成熟的 不同時期的微管變化（Van Bruaene N，Joss G，Van Oostveldt P，Reorganization and in vivo dynamics of microtubules during Arabidopsis root hair development. Plant Physiology，2004，136 (4) :3905_3919.) ;Xin_Ying Zhao 等利用特異性標記微 絲的Marker :mTalin比較了擬南芥的蛋白PRK2過表達與野生型的花粉管中微絲的形 態變化（X. -Y. Zhao，Q. Wang，S. Li，F. -R. Ge，L. -Z. Zhou，S. McCormick，Y. Zhang，The juxtamembrane and carboxy-terminal domains of Arabidopsis PRK2 are critical for ROP-induced growth in pollen tubes, Journal of Experimental Botany,2013,64,18, 5599.)。但是，已報導的特異性標記微絲的Marker只能在花粉管中特異性表達。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的在於提供一種特異性標記根毛微絲的Marker,該Marker對於研究 植物根毛中微絲的功能有著非常重要的意義。
[0004] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0005] -種特異性標記根毛微絲的Marker,為能夠在根毛中特異性表達的質粒ProE7 : mRFPuTalin。ProE7 :mRFP_mTalin 質粒是以 pB7WG2. O(Invitrogen)為骨架載體，將 PB7WG2. 0的35S替換為ProE7，GW替換為mRFP-mTalin。其中，ProE7為根毛特異性啟動子， 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；mRFP為紅色螢光蛋白基因，mTalin為能夠特異性標記微 絲的Marker基因，mRFP-mTalin核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所不。
[0006] 上述特異性標記根毛微絲的Marker的構建方法，包括如下步驟：
[0007] (1)克隆目的基因 mRFP-mTalin :
[0008] 1)以質粒PKU83(公司：Invitrogen，產品：PKU83)為模板，用如下引物（弓丨物la 和引物2a)進行PCR擴增得到目的基因mRFP，
[0009] 引物 la 為：CACCATGGCCTCCTCCGAGGAC，
[0010] 引物 2a 為：GGCGCCGGTGGAGTG。
[0011] 2)以小鼠基因mTalin的CDNA為模板，用如下引物（引物lb和引物2b)進行PCR 擴增得到目的基因mTalin，
[0012] 引物 lb 為：CACTCCACCGGCGCCGGATCCATCCTAGAAGCTGCCAAGTCC，
[0013] 引物 2b 為：TTAGTGCTCGTCTCGAAGCTC。
[0014] 3)以mRFP和mTalin為模板，用如下引物（引物1和引物2)進行PCR(橋式PCR) 擴增得到目的基因mRFP-mTalin，
[0015] 引物 1 為：CACCATGGCCTCCTCCGAGGAC，
[0016] 引物 2 為：TTAGTGCTCGTCTCGAAGCTCT。
[0017] (2)將目的基因mRFP-mTalin通過T0P0反應連入pENTR載體，構建克隆載體 mRFP-mTalin〇
[0018] (3)克隆目的基因Pr〇E7 :以擬南芥根的cNDA為模板，用如下引物（引物3和引物 4)進行PCR擴增得到目的基因ProE7，
[0019] 引物 3 為：ATAAGCTTAGAGAGCGCCCGGITT，
[0020] 引物 4 為：ATACTAGTcTAGCCTCnTTTCTTTAITCTTAGG。
[0021] (4)將目的基因ProE7通過TA連接連入pMD19-T，構建克隆載體ProE7。
[0022] (5)分別將克隆載體ProE7和質粒pB7WG2. 0用限制性內切酶Hindlll和Spel進 行雙酶切，將酶切的Pr〇E7片段和pB7WG2. 0骨架連接構建目的載體Pr〇E7 :GW。
[0023] (6)利用克隆載體mRFP-mTalin和目的載體ProE7 :GW通過LR反應，構建表達載 體ProE7 :mRFP-mTalin，即特異性標記根毛微絲的Marker。
[0024] 上述特異性標記根毛微絲的Marker對於研究植物根毛中微絲的功能有著非常重 要的意義。如將該質粒轉入野生型植物中，通過顯微照相可以觀察根毛中微絲的形態及分 布；將該質粒轉入突變體中，通過顯微照相可以比較突變體與野生型的根毛中微絲的形態 及分布的差異。對轉有該質粒的植物根毛進行藥劑處理，可以研究該藥劑對根毛中微絲的 作用。將該質粒轉入農作物中，然後利用甲基磺酸乙酯（EMS)對其進行誘變，觀察根毛中微 絲形態的變化，尋找控制作物根毛髮育的突變體。
[0025] 本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果：
[0026] 本發明的Marker轉入植物中可以觀察植物根毛中微絲的形態分布，微絲被標記 為紅色，結構鮮明，標記特異，對於研究植物根毛中微絲的功能有著非常重要的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是本發明特異性標記根毛微絲的Marker ProE7 :mRFP-mTalin質粒圖譜。
[0028] 圖2是雷射共聚焦顯微鏡觀察轉Pr〇E7 :mRFP-mTalin擬南芥的根毛。

【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的描述。應理解，下面的實施例僅用 於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本 領域技術人員所熟知的常規手段。
[0030] 實施例1
[0031] 本發明特異性標記根毛微絲的Marker，為能夠在根毛中特異性表達的質粒 ProE7 :mRFP-mTalin(圖 1)。ProE7 :mRFP-mTalin 質粒是以 pB7WG2. 0 為骨架載體，將 PB7WG2. 0的35S替換為ProE7,GW替換為mRFP-mTalin。其中，ProE7為根毛特異性啟動子， 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；mRFP為紅色螢光蛋白基因，mTalin為能夠特異性標記微 絲的Marker基因，mRFP-mTalin核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所不。
[0032] 質粒ProE7 :mRFP-mTalin的構建過程如下：
[0033] (1)克隆目的基因mRFP-mTalin
[0034] 1)以質粒PKU83(公司：Invitrogen，產品：PKU83)為模板，用如下引物（弓丨物la 和引物2a)進行PCR擴增得到目的基因mRFP，
[0035] 引物 1 a 為：CACCATGGCCTCCTCCGAGGAC，
[0036] 引物 2a 為：GGCGCCGGTGGAGTG。
[0037] PCR 反應體系為 25 u L，其中，Phusion polymerases 為 Thermo scientific 產品 (下同）。具體成分如下：
[0038]

【權利要求】
1. 一種特異性標記根毛微絲的Marker,其特徵在於：所述的Marker為能夠在根毛中特 異性表達的質粒ProE7 :mRFP-mTalin ProE7 :mRFP-mTalin是以pB7WG2. 0為骨架載體，將 PB7WG2. 0 的 35S 替換為 ProE7, GW 替換為 mRFP-mTalin。
2. 根據權利要求1所述的特異性標記根毛微絲的Marker,其特徵在於：ProE7的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 1所示；mRFP-mTalin的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 權利要求1所述的特異性標記根毛微絲的Marker的構建方法，其特徵在於：包括如 下步驟： ⑴克隆目的基因 mRFP-mTalin : 1) 以質粒PKU83為模板，用引物la和引物2a進行PCR擴增得到目的基因 mRFP， 引物 la 為：CACCATGGCCTCCTCCGAGGAC， 引物 2a 為：GGCGCCGGTGGAGTG ; 2) 以小鼠基因 mTalin的cDNA為模板，用引物lb和引物2b進行PCR擴增得到目的基 因 mTalin, 引物 lb 為：CACTCCACCGGCGCCGGATCCATCCTAGAAGCTGCCAAGTCC， 引物 2b 為：TTAGTGCTCGTCTCGAAGCTC ; 3) 以mRFP和mTalin為模板，用引物1和引物2進行PCR擴增得到目的基因 mRFP-mTalin, 引物 1 為：CACCATGGCCTCCTCCGAGGAC， 引物 2 為：TTAGTGCTCGTCTCGAAGCTCT ; (2) 將目的基因 mRFP-mTalin通過T0P0反應連入pENTR載體，構建克隆載體 mRFP-mTalin ； (3) 克隆目的基因 Pr〇E7 :以擬南芥根的cNDA為模板，用引物3和引物4進行PCR擴增 得到目的基因 Pr〇E7 ; 引物 3 為：ATAAGCTTAGAGAGCGCCCGGITT， $*4S:atACTAGTcTAGCCTCnTTTCTTTAITCTTAGG; (4) 將目的基因 ProE7通過TA連接連入pMD19-T，構建克隆載體ProE7 ; (5) 分別將克隆載體Pr〇E7和質粒pB7WG2. 0用限制性內切酶Hindlll和Spel進行雙 酶切，將酶切的Pr〇E7片段和pB7WG2. 0骨架連接構建目的載體Pr〇E7 :GW ; (6) 利用克隆載體mRFP-mTalin和目的載體ProE7 :GW通過LR反應，構建表達載體 ProE7 :mRFP-mTalin，即特異性標記根毛微絲的Marker。
4. 權利要求1或2所述的特異性標記根毛微絲的Marker在研究植物根毛中微絲的功 能中的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK104450760SQ201410637409
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】張彥, 李恩, 李廈 申請人:張彥