靶向特異性補體系統抑制劑、其製備方法及應用的製作方法

2023-05-21 04:44:01 1

靶向特異性補體系統抑制劑、其製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬生物製藥領域，具體涉及靶向特異性補體系統抑制劑,還包括靶向特異性補體抑制劑的設計、製備和臨床應用。本發明通過能與補體成分C3激活後形成的片段C3b和/或iC3b結合而產生靶向作用的CRIg，與具有補體抑制效果的另一組分例如H因子（factor H）直接相連或利用柔性肽段（Gly4Ser）3等方式間接相連，通過基因工程等方法製備一種融合蛋白，最終達到靶向性抑制補體激活的效果。該類型藥物可應用於多種與補體異常激活有關的人類疾病的治療和預防。
【專利說明】靶向特異性補體系統抑制劑、其製備方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物技術和製藥領域，具體涉及靶向特異性補體抑制劑的設計、製備 和臨床應用。

【背景技術】
[0002] 補體系統是固有免疫的主要組成部分，也是獲得性免疫的重要調節者，發揮著 重要的免疫監視作用，不僅可以清楚入侵的病原菌微生物和宿主細胞碎片，還可以協調 整個免疫和炎症過程（Ricklin D et al.，Nat Immunol2010;ll:785-797;Morgan BP et al.，Immunology letters2005;97:171-179)。補體可通過經典途徑、替補途徑及凝集素途 徑激活，其發揮生理功能主要通過激活後形成的產物進行，包括C3b/iC3b沉積於被攻擊細 胞膜表面，招募單核細胞等免疫效應細胞通過吞噬作用而清除靶細胞；C3a/C4a/C5a等過 敏毒素引起局部炎症；以及補體膜攻擊複合物（Membrane Attack Complex, MAC,即C5b_9n) 在靶細胞膜表面形成孔洞而最終裂解靶細胞。在此過程中，為了防止補體激活後對正常宿 主細胞的"誤傷"效應，機體在進化過程中形成了 10餘種調控蛋白，包括存在於血液循環中 的 Cl-INH (Clinhibitor，Cl 抑制蛋白）、C4BP (C4binding protein，C4 結合蛋白）、factor I (I因子)、factor Η (Η因子)、S_protein (S蛋白)和Clusterin (簇集蛋白）;以及表達與 細胞膜表面的補體膜調控蛋白〇)35/0?1、0)46/]\0\0)55/1^?和0)59(211〇11，乂.，6〖31.，1116 0ncologist2008; 13:954-966)，以及近期發現的另一種補體膜調控蛋白CRIg (Helmy KY et al·，Cell. 2006; 124:915-927;Wiesmann C et al·，Nature, 2006, 444:217-220)，在補 體酶級聯反應的不同階段抑制補體的激活，使得補體系統在激活和抑制之間維持一種精妙 的平衡，機體處於健康狀況。但是，這種平衡一旦被打破，人體的很多疾病的發生、發展和 治療均與此密切相關，例如大量研究表明，補體系統的過度激活不同程度不同階段參與其 他疾病的發生與發展，例如自身溶血性貧血、自身免疫性血小板減少、再生障礙性貧血、系 統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、動脈粥樣硬化、帕金森氏病、阿爾茨海默病 (老年性痴呆)、哮喘、過敏、銀屑病、重症肌無力、多發性硬化、克隆氏腸病等。因此，以補體 系統為治療祀點的藥物研發，包括補體系統抑制劑重新受到重視（Ricklin D et al.，Nat Immunol2010; 11:785-797),研發補體系統抑制劑，尤其是靶向性抑制劑具有巨大的社會和 經濟價值。
[0003] 研發補體系統抑制劑在領域內經過了數十年的探索，包括與C3結合的蛋白質 Compastatin (Georgopoulos LJ，et al.，Mol Immunol, 2009;46:2911-7)以及抗 C5 的重 組單抗Eculizumab (依庫珠，Soliris，由亞力兄製藥公司Alexion Pharmaceuticals生產） (Rother RP et al·，Nat Biotechnol, 2007; 25:1256-1264),但仍然存在一些明顯的不足。 Compastatin已經進入臨床前期試驗，但是由於抑制所有部位C3的功能而存在潛在的導 致感染的風險。另外，儘管依庫珠已經成功用於治療治療陣發性睡眠性(夜間）血紅蛋白尿 (Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria, PNH)，但智慧財產權為國外擁有，價格異常昂貴， 使用一年的價格是409, 500美元，2009年，Soliris銷售額為2. 95億美元，2010年銷售額 5. 41億美元。PNH是一種後天獲得性溶血性疾病，主要由於PIG-A基因的突變導致⑶55 和0)59這兩種正常通過糖基磷肌醯肌醇（〖15^〇85^1卩11〇8卩1^1^(171;[1108；[1:01，6?1)錨定於紅 細胞膜上的補體膜調控蛋白不再錨定於PNH患者的血細胞膜上，所以PNH患者的血細胞對 補體的攻擊異常敏感，極易產生白細胞下降導致的感染、紅細胞破裂造成的溶血，以及血小 板被激活，最終導致反覆感染、溶血、血栓形成、腎功能衰竭、骨髓衰竭和肺動脈壓升高等， 疾病進行性加重，在依庫珠單抗出現之前基本無藥可治，從而嚴重威脅患者的生命（Parker C et al·，Blood, 2005; 106:3699-3709)。依庫珠的作用機理是與C5結合後，在補體級聯反 應的末期抑制補體的激活，從而阻止MAC在血細胞膜上的沉積和對血細胞尤其是對紅細胞 的裂解，臨床上對PNH患者的治療收到了較好的療效，顯著減少血栓形成，66%的患者在治 療一年內不需再輸血（Kelly RJ et al.，Blood，2011;117:6786-6792)。然而，理論上應用 依庫珠單抗後PNH患者的病情仍然無法得到完全緩解，因為補體級聯反應的C3水平仍然存 在激活，產生C3b/iC3b並沉積與血細胞表面，使這些血細胞被單核細胞吞噬，最終造成血 管外溶血（Risitano AM et al·，Blood, 2009; 113:4094-4100)，這也是依庫珠單抗治療並 不十分滿意的原因。因此，在補體激活更早期的C3水平，而不是像依庫珠單抗的末期C5水 平，阻止補體的激活，將有效同時阻止MAC介導的血管內和C3b/iC3b介導的血管外溶血，從 而產生更好的療效。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種靶向特異性補體抑制劑。
[0005] 本發明的另一個目的是提供上述靶向特異性補體抑制劑在製備抑制補體激活藥 劑中的應用。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明經過數以千記的實驗和反覆的測試，發現CRIg可 以用於作為本發明靶向特異性補體抑制劑的基礎。
[0007] CRIg最早發現表達於巨噬細胞膜表面的一種C3b/iC3b受體，結合後可吞噬病 原體或其他顆粒（Helmy KY et al.，Cell. 2006; 124:915-927)。進一步結構生物學研究 還發現CRIg可通過特異性識別C3b並抑制C3轉換酶的激活，從而在補體級聯反應的早 期即產生抑制效應一一這種抑制作用為針對補體的替補激活途徑，但其抑制效果低於經 典的補體替補途徑抑制劑factor Η ;同時，CRIg的功能位點位於胞外區（Wiesmann C et al.，Nature, 2006, 444:217-220)。查閱發現至今未有CRIg用於補體抑制的應用報導，更未 有利用其與C3b/iC3b結合的特性研發靶向性補體抑制劑的報導。
[0008] 本發明利用CRIg這兩種獨特的特性，克隆其胞外功能區基因並與其他補體調控 蛋白融合表達，製備成一種通過CRIg與C3b/iC3b特異性結合的靶向作用，把重組聯接的 補體調控蛋白運送至局部補體激活部位，從而達到抑制補體激活，預防或治療疾病的目的。 CRIg的胞外功能部位的基因序列見序列表的SEQ ID N09,胺基酸序列見序列表SEQ ID N010。另外，與CRIg相連的其他部分包括所有能抑制補體激活的成分，例如補體調控蛋白 Cl-INH、C4BP、factor I、factor H、S-protein、Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF 和CD59、甚至CRIg本身等的全長或部分序列，其中相連的方式包括直接相連，以及通過其 他物理、化學和生物等手段通過其他分子間接相連。
[0009] 本發明以CRIg功能性胞外區與fH功能區直接或通過柔性連接肽（SerlGly4) 3間 接相連為例，描述該重組蛋白CRIg-fH及CRIg-L-fH的靶向補體抑制效果。
[0010] 本發明提供了一種蛋白質，它編碼具有抑制補體激活功能的蛋白，並且包含CRIg 和補體抑制劑的序列。
[0011] CRIg與不同的補體抑制劑，包括存在於血液循環中的Cl-INH (Clinhibitor，C1 抑制蛋白）、C4BP (C4binding protein，C4 結合蛋白）、factor I (I 因子）、factor Η (Η 因 子)、S-protein (S蛋白）和Clusterin (簇集蛋白）；以及表達與細胞膜表面的補體膜調控 蛋白⑶35/CR1、⑶46/MCP、⑶55/DAF和⑶59甚至CRIg本身，以及其他具有補體抑制功能的 物質進行連接。
[0012] CRIg與其他補體抑制劑的連接方式，包括：
[0013] (1) CRIg與其他補體抑制劑直接相連，兩者之間沒有任何其他連接物。
[0014] (2) CRIg與其他補體抑制劑通過生物方法連接。
[0015] (3) CRIg與其他補體抑制劑通過化學方法連接。
[0016] 例如，該蛋白質由CRIg和factor Η組成。
[0017] 在本發明的一個實施例中，該蛋白質由CRIg胞外區、factor Η以及兩者間的連接 物組成。
[0018] 所述的補體抑制功能區可以是 factor H、Cl-INH、C4BP、factor I、S-protein、 Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59 或者 CRIg 的功能片段或全長。
[0019] 在本發明的另一個實施例中，該蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID N02或者SEQ ID N04所示。
[0020] 本發明提供了編碼上述蛋白質的核酸。
[0021] 較好的，其核苷酸編碼序列如SEQ ID N01或者SEQ ID N03所示。
[0022] 本發明還提供了一種含上述核酸的載體。以CRIg-fH和CRIg- (Gly4Ser) 3 - fH 為例，該載體含有核酸的鹼基序列如SEQ ID N01或者SEQ ID N03所示。
[0023] 本發明還提供了一種含上述核酸的細胞。
[0024] 本發明的蛋白質可以利用基因工程技術，連接CRIg蛋白質和factor Η蛋白質；
[0025] 所述的CRIg蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID Ν06所示；
[0026] 所述的factor Η蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID N08所示。
[0027] 也可以按照蛋白質的序列依次連接胺基酸殘基。
[0028] 本發明的核酸也可以利用基因工程技術，連接CRIg蛋白質和factor Η蛋白質的 編碼序列；或者按照核酸的序列依次連接鹼基。
[0029] 本發明提供了靶向特異性補體系統抑制劑，即上述蛋白質在製備抑制補體激活的 藥物中的應用。也可以用於製備保護細胞免受補體攻擊並提高紅細胞壓積的藥物。
[0030] 本發明提供了上述蛋白質在製備保護陣發性夜間血紅蛋白尿患者血細胞的藥物 中的應用，也可用於製備其他疾病中使遭受補體攻擊的細胞免受補體攻擊的藥物或者藥 劑。
[0031] 另一方面，本發明提供了一種藥物，所述藥物的活性成分為上述蛋白質，即含有 CRIg和factor Η的功能域。
[0032] 例如，該藥物是抑制補體激活的藥物。
[0033] 又如，該藥物產生含有胺基酸序列如SEQ ID Ν02或者SEQ ID Ν04所示的蛋白質。
[0034] 上述藥物的給藥方式包括：
[0035] (1)直接給藥。
[0036] (2)通過能攜帶或表達該藥物的載體系統給藥。
[0037] 本發明通過能與補體成分C3激活後形成的片段C3b和/或iC3b結合而產生靶向 作用的CRIg，與具有補體抑制效果的另一組分例如Η因子（factor H)直接或利用柔性肽段 (Gly4Ser) 3等方式相連，通過基因工程的方法製備一種融合蛋白，最終達到靶向性抑制補 體激活的效果。該類型藥物可應用於多種與補體異常激活有關的人類疾病的治療和預防。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1為CRIg-fH和CRIg-L-fH的表達與純化。
[0039] 圖2為CRIg-L-fH與C3活化和降解產物C3b、iC3b、C3c、C3d相互作用的動力學 分析和結合力測定。
[0040] 圖3為CRIg-fH與C3活化和降解產物C3b、iC3b、C3c、C3d相互作用的動力學分 析和結合力測定。
[0041] 圖4為CRIg-L-fH對補體替補途徑誘導的七例PNH患者紅細胞的溶血起保護作 用。
[0042] 圖5為CRIg-L-fH對補體經典途徑誘導的七例PNH患者紅細胞的溶血起保護作 用。
[0043] 圖6為CRIg-L-fH對Thy-ΙΝ大鼠腎炎引發的血清尿素氮升高病理症狀的緩解作 用。
[0044] 圖7為CRIg-L-fH對Thy-ΙΝ大鼠腎炎引發的血清肌酐升高病理症狀的緩解作用。
[0045] 圖8為CRIg-L-fH對Thy-ΙΝ大鼠腎炎引發的尿液總蛋白滲漏病理症狀的緩解作 用。
[0046] 圖9為CRIg-L-fH對Thy-ΙΝ大鼠腎炎引發的血尿病理症狀的緩解作用。
[0047] 圖10為免疫螢光檢測各組大鼠腎臟冰凍切片的IgG、C3片段、MAC和CRIg-L-fH 的沉積。
[0048] 其中，*Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· 001 ;n=4。

【具體實施方式】
[0049] 實施例1
[0050] CRIg-fH及CRIg-L-fH蛋白表達載體的構建、真核表達和純化
[0051] 1.儀器與材料：
[0052] Mastercycler pro-Eppendorf PCR 儀（德國 Eppendorf 公司），DK-8D 型電熱恆溫 水槽(上海精宏實驗設備有限公司），IQ350凝膠成像系統(美國GE Healthcare公司），C02 細胞培養箱(美國Thermo Scientific公司），FR-980A生物電泳圖像分析系統(復日科技公 司）、BioRAD Mini protein Tera system (美國 BioRAD 公司）、NanoVue RNA/DNA 濃度 / 純 度檢測儀(德國IKA公司）
[0053] 2.實驗方法：
[0054] 2. 1基因克隆和載體構建
[0055] Trizol法（invitrogen)提取人淋巴瘤U937細胞的總RNA，反轉錄為cDNA(promega reverse transcription kit)，PCR 擴增 CRIg 基因的胞外結構域（G19_K137);Trizol 法 提取人肝癌細胞系Η印3B細胞的總RNA，反轉錄後PCR擴增factorH基因的SCR1-5結構域 (E19-K323)。
[0056] 設計同時包含CRIg胞外結構域和factor H SCR1-5結構域以及linker序列 (L，（SeriGlyJs) (TCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGAGGTGGGTCCGGTGGCGGCGGA)的引物，應用重疊 PCR (Overlapping PCR)的方法將CRIg胞外結構域基因和factorH SCR1-5基因連接起來， 插入到pHLsec真核表達載體中，雙向測序鑑定插入序列，載體命名為pHLsec-CRIg-fH和 pHLsec-CRIg-L-fH。
[0057] CRIg 核酸序列（SEQ ID N05)
[0058] ATGGGGATCTTACTGGGCCTGCTACTCCTGGGGCACCTAACAGTGGACACTTATGGCCGTCCCATCCTG GAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCCTGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTA CACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCACCATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAG ACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGGTTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTG AGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGT GAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAACTCTCTGTCTCCAAGCCCACAGTGACAACTGGCAGCGGTTATG GCTTCACGGTGCCCCAGGGAATGAGGATTAGCCTTCAATGCCAGGCTCGGGGTTCTCCTCCCATCAGTTATATTTGG TATAAGCAACAGACTAATAACCAGGAACCCATCAAAGTAGCAACCCTAAGTACCTTACTCTTCAAGCCTGCGGTGAT AGCCGACTCAGGCTCCTATTTCTGCACTGCCAAGGGCCAGGTTGGCTCTGAGCAGCACAGCGACATTGTGAAGTTTG TGGTCAAAGACTCCTCAAAGCTACTCAAGACCAAGACTGAGGCACCTACAACCATGACATACCCCTTGAAAGCAACA TCTACAGTGAAGCAGTCCTGGGACTGGACCACTGACATGGATGGCTACCTTGGAGAGACCAGTGCTGGGCCAGGAAA GAGCCTGCCTGTCTTTGCCATCATCCTCATCATCTCCTTGTGCTGTATGGTGGTTTTTACCATGGCCTATATCATGC TCTGTCGGAAGACATCCCAACAAGAGCATGTCTACGAAGCAGCCAGGGCACATGCCAGAGAGGCCAACGACTCTGGA GAAACCATGAGGGTGGCCATCTTCGCAAGTGGCTGCTCCAGTGATGAGCCAACTTCCCAGAATCTGGGCAACAACTA CTCTGATGAGCCCTGCATAGGACAGGAGTACCAGATCATCGCCCAGATCAATGGCAACTACGCCCGCCTGCTGGACA CAGTTCCTCTGGATTATGAGTTTCTGGCCACTGAGGGCAAAAGTGTCTGTTAA
[0059] CRIg 蛋白序列（SEQ ID N〇6)
[0060] MGILLGLLLLGHLTVDTYGRPILEVPESVTGPffKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKffLVQRGSDPVTIFL RDSS⑶HIQQAKYQGRLHVSHKVP⑶VSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVT TGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHS DIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPVFAIILIISLCCMVVFT MAYIMLCRKTSQQEHVYEAARAHAREANDSGETMRVAIFASGCSSDEPTSQNLGNNYSDEPCIGQEYQIIAQINGNY ARLLDTVPLDYEFLATEGKSVC
[0061] Factor H 核酸序列（SEQ ID N07)
[0062] ATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAA CTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTAT CTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTA ATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGA GGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTA CCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCAC CAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTA TGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACC AAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGG AGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCT GGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTT AAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATA CAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAA CATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTG TGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAG TACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAG GGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAA TGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTA TTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGAT GGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATAT CCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCC ATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCC ATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAA AGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACT TTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGG AATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAAT GAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCT GTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAA TTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCC CCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACA AGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATA AATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAA TTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAA TTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGT TCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAA ATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTT CTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGAC AGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATG CTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCC ATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAAT GGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGA ATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTAT CAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCA ATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAG TATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGT AGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAA CATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGG GATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCA AAAAGATAG
[0063] FactorH 蛋白序列（SEQ ID N〇8)
[0064] MRLLAKIICLMLffAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSffSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKG EWVALNPLRKCQKRPCGHP⑶TPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKC LPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIE⑶EEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQ KIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTCDEITYQCRNGFYP ATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQD GWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSID IENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDT LDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNS VQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCI VEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILE EHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLC QENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCY MGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLP SFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSG ERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGN KRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLE YPTCAKR
[0065] CRIg胞外結構域
[0066] 核酸序列（357bps) (SEQ ID N09)
[0067] ggccgtcccatcctggaagtgccagagagtgtaacaggaccttggaaaggggatgtgaatcttccctgc acctatgaccccctgcaaggctacacccaagtcttggtgaagtggctggtacaacgtggctcagaccctgtcaccat ctttctacgtgactcttctggagaccatatccagcaggcaaagtaccagggccgcctgcatgtgagccacaaggttc caggagatgtatccctccaattgagcaccctggagatggatgaccggagccactacacgtgtgaagtcacctggcag actcctgatggcaaccaagtcgtgagagataagattactgagctccgtgtccagaaa
[0068] 蛋白序列（ll9aa) (SEQ ID N010)
[0069] GRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSS⑶HIQQAKYQGRLH VSHKVP⑶VSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQK
[0070] FactorH SCR1-5 結構域
[0071] 核酸序列（9l5bp) (SEQ ID N011)
[0072] gaagattgcaatgaacttcctccaagaagaaatacagaaattctgacaggttcctggtctgaccaaaca tatccagaaggcacccaggctatctataaatgccgccctggatatagatctcttggaaatgtaataatggtatgcag gaagggagaatgggttgctcttaatccattaaggaaatgtcagaaaaggccctgtggacatcctggagatactcctt ttggtacttttacccttacaggaggaaatgtgtttgaatatggtgtaaaagctgtgtatacatgtaatgaggggtat caattgctaggtgagattaattaccgtgaatgtgacacagatggatggaccaatgatattcctatatgtgaagttgt gaagtgtttaccagtgacagcaccagagaatggaaaaattgtcagtagtgcaatggaaccagatcgggaataccatt ttggacaagcagtacggtttgtatgtaactcaggctacaagattgaaggagatgaagaaatgcattgttcagacgat ggtttttggagtaaagagaaaccaaagtgtgtggaaatttcatgcaaatccccagatgttataaatggatctcctat atctcagaagattatttataaggagaatgaacgatttcaatataaatgtaacatgggttatgaatacagtgaaagag gagatgctgtatgcactgaatctggatggcgtccgttgccttcatgtgaagaaaaatcatgtgataatccttatatt ccaaatggtgactactcacctttaaggattaaacacagaactggagatgaaatcacgtaccagtgtagaaatggttt ttatcctgcaacccggggaaatacagcaaaatgcacaagtactggctggatacctgctccgagatgtaccttgaaa
[0073] 蛋白序列（305aa) (SEQ ID N012)
[0074] EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCG HP⑶TPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAM EPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIE⑶EEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKC NMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTST GWIPAPRCTLK
[0075] 1. 1真核蛋白表達系統的建立
[0076] 取對數生長期的293FT細胞，以每皿1. 2X107的細胞密度均勻鋪在直徑15cm的 細胞培養皿中，PEI法分別轉染pHLsec-CRIg-fH和pHLsec-CRIg-L-Fh大抽質粒，在37°C， 5%C02培養箱中培養6小時後更換293表達培養基（invitrogen)，繼續培養三天後收取細胞 上清，離心去除細胞及細胞碎片。
[0077] 1. 2蛋白親和純化、透析和蔗糖濃縮
[0078] 應用Ni2+柱親和純化的方法，將細胞上清中CRIg-fH和CRIg-L-fH純化洗脫至洗 脫緩衝液中，轉移至透析管中（Novagen)，透析法將緩衝液更換為PBS，蔗糖法吸水濃縮後 再用PBS透析。
[0079] 2.實驗結果：
[0080] 通過上述方法應用真核系統誘導表達和純化得到CRIg-fH和CRIg-L-fH兩種融合 蛋白，PAGE電泳檢測為單一條帶（圖1)，濃縮後濃度可達到1?2mg/ml。
[0081] 所涉及相關序列如下：
[0082] CRIg-fH 核酸序列（SEQ ID N01)
[0083] ATGGGCCGTCCCATCCTGGAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCC TGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTACACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCAC CATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAGACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGG TTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTGAGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGG CAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGTGAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAAGAAGATTGCAATGAACT TCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCT ATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAAT CCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGG AAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACC GTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCA GAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATG TAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAA AGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAG AATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGG ATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAA GGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACA GCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAATAA
[0084] CRIg-fH 蛋白序列（SEQ ID N02)
[0085] MGRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSS⑶HIQQAKYQGRL HVSHKVP⑶VSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPE GTQAIYKCRPGYRSLGNVMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHP⑶TPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLL GEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIE⑶EEMHCSDDGFW SKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNG DYSPLRIKHRTCDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKStop
[0086] CRIg-L-fH 核酸序列（SEQ ID N03)
[0087] ATGGGCCGTCCCATCCTGGAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCC TGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTACACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCAC CATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAGACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGG TTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTGAGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGG CAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGTGAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAATCTGGTGGCGGTGGCTC CGGCGGAGGTGGGTCCGGTGGCGGCGGAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAG GTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGA AATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGG ACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGT ATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGAT ATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGA ACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAG AAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGAT GTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGG TTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAAT CATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACG TACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGC TCCGAGATGTACCTTGAAATAA
[0088] CRIg-L-fH 蛋白序列（SEQ ID N04)
[0089] MGRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSS⑶HIQQAKYQGRL HVSHKVP⑶VSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKSGGGGSGGGGSGGGGEDCNELPPRRN TEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHP⑶TPFGTFTLTGGNVFEY GVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYK IE⑶EEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLP SCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTCDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKStop
[0090] 實施例2CRIg-fH及CRIg-L-fH與C3活化和降解片段相互作用的動力學分析和親 和力測定
[0091] 1.儀器與材料：
[0092] Biacore T200 (GE Healthcare)、Series S Sensor Chip NTA、CRIg-L-fH 蛋白溶 液、C3 活化和降解的蛋白組分（C3b、iC3b、C3c、C3d, Complement Technology)、HBS_N 溶液 (GE Healthcare)
[0093] 2.實驗方法
[0094] 表達純化的CRIg-L-fH用HBS-N running buffer稀釋為0. 2ug/ml作為配體偶聯 在NTA晶片上，C3fragments以一系列濃度梯度稀釋(如圖所示）作為流動的分析物，應用 Biacore T200儀器測定動力學曲線並經過Biacore T200Software v2. 02分析。親和常數、 解離常數和平衡解離常數如表1所示。
[0095] 表 1
[0096]

【權利要求】
1. 一種蛋白質，其特徵在於，該蛋白質具有靶向抑制補體激活的功能，並且該蛋白質的 胺基酸序列 (a) 含有CRIg胞外功能區和補體抑制功能區； 或者 (b) 由CRIg胞外功能區、補體抑制功能區以及兩者間的連接物組成； 上述補體抑制功能區是 factor H、Cl-INH、C4BP、factor I、S-protein、Clusterin、 CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59 或者 CRIg 的功能片段或全長。
2. 如權利要求1所述的蛋白質，其特徵在於，該蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID N02或 者SEQ ID N04所示。
3. -種核酸，其特徵在於，該核酸序列編碼權利要求1所述的蛋白質。
4. 如權利要求3所述的核酸，其特徵在於，該核酸的鹼基序列如SEQ ID N01或者SEQ ID N03所示。
5. -種載體，其特徵在於，含有權利要求3所述的核酸。
6. 權利要求1所述的蛋白質的製備方法，其特徵在於，利用基因工程技術，連接CRIg胞 外區、補體抑制功能區的蛋白質多肽； 所述的CRIg胞外區蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID N010所示； 所述的補體抑制功能區是 factor H、Cl-INH、C4BP、factor I、S-protein、Clusterin、 CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59 或者 CRIg 的功能片段或全長。
7. 權利要求1所述的蛋白質在製備靶向抑制補體激活的藥物中的用途。
8. 權利要求1所述的蛋白質在製備保護陣發性夜間血紅蛋白尿患者血細胞或其他疾 病中遭受補體攻擊的細胞免受補體攻擊的藥物中的用途。
9. 一種藥物，其特徵在於，所述藥物的活性成分為權利要求1所述的蛋白質。
10. 如權利要求9所述的藥物，其特徵在於，該藥物是針劑。
【文檔編號】A61K38/17GK104231085SQ201410114646
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】胡維國, 喬倩, 張鑫 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫院