半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠及其製備方法

2023-04-29 07:42:11

專利名稱：半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種智能型高分子材料技術，具體為一種具有溫度敏感型N-異丙基丙烯醯胺(N-isopropylacrylamide，NIPAAm)與半乳糖基單體(GAC)共聚水凝膠及其製備方法技術，屬於功能高分子材料領域。

背景技術：
組織工程領域以各種方法應用活細胞與生物材料和生長因子相結合來研製取代物以修復、保持或維持組織和器官的功能。工程化組織常將種子細胞(培養細胞或幹細胞)種植在能夠提供力學和化學信號的生物活性降解支架上引導細胞分化與組裝成三維組織。
組織工程常採用水凝膠(即含有親水性基團的聚合物網絡)作為細胞釋放載體。水凝膠的結構類似於體內的大分子組成物，生物相容性良好。它們的親水表面有低的表面自由能，導致了很少的蛋白質貼附到表面。而且，凝膠柔軟和橡膠化的性質最小化了與周圍組織的排斥。疏水鏈能促進細胞的貼附。
組織工程用水凝膠首先要考慮其生物相容性，特別是炎症反應，因此，大多數研究主要集中在天然的聚合物水凝膠上。
生命在其本質上與聚合物相關，活細胞的最重要組成物(蛋白質、糖和核酸)均是生物大分子，它們均能非線性的響應外界刺激。此類響應性源於高度協同的相互作用。迄今為止人們對蛋白質和核酸的功能知之較多，可是對多糖的功能認識較少。多糖如糖胺聚糖組成物(肝素、透明質酸)等均已用作組織工程支架、免疫隔離膜材、細胞培養載體及藥物與基因釋放載體。有研究表明，含有糖基的合成高分子具有較好的細胞親和性，有利於細胞吸附。
Rowly等Lopina ST，Wu G et al.生物材料，1996；17559-69(Lopina ST，Wu G et al.Biomaterials，1996；17559-69.)報導含有RGD(細胞黏附蛋白)的細胞貼附配位體改性的藻酸鹽提高了成肌細胞和差異顯形的表達。同時也報導了半乳糖部分被肝細胞表面的B型肝炎受體(ASGP-R)識別並且提高肝細胞的貼附。
楊軍等Jun Yang，Mitsuaki G et al.生物材料，23(2002)471-479.(JunYang，Mitsuaki G et al.Biomaterials 23(2002)471-479.)用半乳糖改性的藻酸鹽作為ASGP-R的配體促進了肝細胞的貼附和肝細胞與藻酸鹽間作用，然後在三維的培養中提高了膠囊化肝細胞的肝功能。
Taek Wong Chung等張燦，丁婭.中國藥科大學學報，2003，34(5)387-390.利用帶有半乳糖基的乳糖酸共價連接到殼聚糖用來檢測肝細胞的特徵。製備了三維的由藻酸鈣(ALG)和半乳糖基殼聚糖(GC)組成的多孔海綿體支架以提供肝細胞的識別信號並且提高ALG海綿體的機械性能。
利用半乳糖基偶聯到大分子中，進而製備成各種海綿體，多孔支架等多有實現，但未見有半乳糖基水凝膠的合成報導。
天然的聚合物水凝膠有其局限性，如不具有智能性等，這就促使人們對天然聚合物水凝膠進行改性。聚異丙基丙烯醯胺(PNIPAAm)凝膠是典型的溫敏智能材料，聚異丙基丙烯醯胺(PNIPAAm)在水中的低臨界溶解溫度(LCST)接近32℃，在此溫度下會產生相轉變。PNIPAAm溫敏凝膠的研究很多集中在藥物釋放、酶的固定化以及生物分離等方面。張先正等張先正，卓仁禧。高等學校化學學報，2000，211309-1311使用丙烯醯胺(AAm)與NIPAAm共聚合成了具有快速溫度敏感的水凝膠，並對其在開關閥和人工肌肉等方面的應用進行了展望。Okano等Teruo Okano，NorikoYamada，MinakoOkuhara et al.生物材料，16(1995)297-303(Teruo Okano，NorikoYamada，MinakoOkuhara et al.Biomaterials 16(1995)297-303)利用聚異丙基丙烯醯胺(PNIPAAm)進行細胞培養研究，但是，單獨使用PNIPAAm時，其生物相容性不高。
從以上分析可以看出，PNIPAAm雖具有溫度敏感性，但在親水性和生物相容性方面顯示不足。基於半乳糖化的PNIPAAm凝膠不但具有溫度響應性，而且糖化聚合物對於細胞具有親和性，能夠提高細胞貼附的特點，此外，半乳糖成分對於肝細胞具有良好的靶向作用。


發明內容
本發明擬解決的技術問題是，設計一種新型的智能高分子水凝膠，該智能水凝膠既具有較好的溫度敏感性，同時還具有良好的生物相容性、較高的親水性和細胞親和性。該凝膠通過調節溫度可發生親疏水性的變化，用於組織工程、細胞培養，能夠實現細胞的自然脫附，避免胰蛋白酶消化法對細胞造成的功能損傷。
本發明提供一種半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠，該水凝膠為N-異丙基丙烯醯胺與改性半乳糖基單體的共聚物，其質量百分比如下N-異丙基丙烯醯胺與半乳糖基單體(GAC)的比例為1∶0.2～1。N-異丙基丙烯醯胺提供材料的溫度敏感性，改性半乳糖的加入使材料具有更好的生物相容性、較高的親水性和細胞親和性。
本發明的半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠的製備方法包括如下步驟 (1)合成半乳糖端氨基的中間體L-NH2將乳糖酸(LA)和乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶於二甲基亞碸(DMSO)中，使其質量比為4-6∶1，混合溶液濃度為0.5-1g/ml，在溫度為70-80℃時反應2-4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然後將產物L-NH2真空乾燥。
(2)合成帶有雙鍵的半乳糖基中間單體GAC將半乳糖端氨基的中間體L-NH和丙烯酸(AAc)分別溶於二甲基亞碸(DMSO)中，使其質量比為4-6∶1，溶液混合濃度為0.2-0.5g/ml，加入總濃度為0.05-0.15wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)，在室溫下漩渦攪拌20-30h，用氯仿沉析，真空乾燥除去未反應物。
(3)製備poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠按質量比GAC∶NIPAAm＝0.2～1∶1分別稱取GAC和單體NIPAAm；兩者溶解於去離子水中製成混合溶液，混合液濃度控制在0.05～0.2g/ml；向混合溶液中加入濃度為1-2wt％的MBAA作為交聯劑，充分溶解後通氮氣10-30分鐘，再加入重量為0.02-0.04wt％的APS和0.05-0.15wt％的TEMED作為引發體系，繼續通入氮氣10分鐘以上，將混合物注入玻璃模具中，室溫聚合24～48h，得poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。將所得共聚水凝膠用去離子水浸泡至少一周，使其在水中達到平衡，即得目標高分子水凝膠。
有益效果與現有技術相比，本發明提出的半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠具有更好的綜合性能由於其分子結構中帶有兩個對其性能有關鍵影響的官能團半乳糖基，和具有溫度響應性的聚異丙基丙烯醯胺大分子鏈，因此，此水凝膠具有很好的溫度響應性和良好的生物相容性，同時具有較好的溶脹性能和較高的力學性能，文獻曾報導單體濃度為15wt％的均聚N-異丙基丙烯醯胺水凝膠在25℃時的溶脹比(溶脹比是指某一溫度下達到穩定溶脹狀態時水凝膠與其真空乾燥至恆重的凝膠的質量比)約為參見文獻「N-異丙基丙烯醯胺/N-乙烯基吡咯烷酮水凝膠的研究」，劉鬱揚，範曉東，邵穎慧，功能高分子學報，2000，13380-385。而本發明的水凝膠在同樣的外界條件下，溶脹比可達20-25，同時該產品還具有很好的完整性，不易破碎，表現出較理想的力學性能。另外，半乳糖基的引入，使其對肝細胞具有很好的識別作用。由於其良好綜合特性，本發明半乳糖基溫度敏感型水凝膠在需要高強度和/或生物相容性的組織工程支架材料、細胞培養基質材料等方面可以得到廣泛應用。
本發明的半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠，由於其分子結構中一端偶聯有官能團半乳糖環狀基團，該基團能夠對肝細胞中的去唾液酸糖蛋白受體特異性識別，同時接枝上了異丙基丙烯醯胺單體，導致了該凝膠具有一定的親水/疏水的自調節功能，因此，賦予了此水凝膠很好的溫度響應性，另外，半乳糖基的引入，使其對肝細胞具有很好的靶向作用，具有很好的生物相容性，可用於細胞培養中，可以實現細胞的自然脫附，避免了胰蛋白酶消化法造成的細胞功能損傷。這樣本發明適用於組織工程中各種基質材料的製備，可以被設計成對特定細胞反應的材料。
本發明從合成L-NH2中間體出發，選擇乳糖酸作為引入半乳糖基配體是因為乳糖酸成本合理，毒性低，生物相容性良好，此外將丙烯酸作為引入反應活性雙鍵的單體是因為，丙烯酸成本低廉，性質穩定，屬於常規藥品，反應殘餘物容易去除。
本發明製備方法工藝簡單，且均具有良好的可控性，在常壓狀態下就可以進行；所用的試劑均為常規試劑，不需要特殊設備，成本低廉，適於推廣應用。
本發明製備的水凝膠在空間微結構上，呈空間立體網絡結構，大分子鏈互相交聯組成網狀架構，而流體水被包含其中，不能自由流動，因而表現出一定的彈性，並且能夠保持一定的形狀。

具體實施例方式 對本發明進一步的敘述如下 本發明設計的一種半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠的製備方法，主要包括三個步驟 以下給出本發明的具體實施例，但本發明不受實施例的限制 實施例1 (1)將12g乳糖酸(LA)和3g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶於30ml二甲基亞碸(DMSO)中，在溫度為70℃時反應約2h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，析出的產物真空乾燥。
(2)將半乳糖端氨基的中間體L-NH2和丙烯酸(AAc)分別溶於20ml二甲基亞碸(DMSO)中，L-NH2與丙烯酸(AAc)質量比為4∶1，溶液混合濃度為0.2g/ml，加入總濃度為0.1wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)；在室溫下漩渦攪拌20h，用氯仿沉析，真空乾燥得產物GAC。
(3)按質量比GAC∶NIPAAm＝0.2∶1分別稱取GAC和單體NIPAAm，兩者溶解於去離子水中製成0.05g/ml混合溶液，加入1wt％MBAA作交聯劑，充分溶解後通氮氣10分鐘，再加入重量為0.02wt％APS和0.05wt％TEMED作為引發體系，繼續通入氮氣10分鐘，將混合物注入玻璃模具中，室溫聚合24h，得poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。將所得共聚水凝膠用去離子水浸泡一周，使其在水中達到平衡，即得目標高分子水凝膠。
實施例2 (1)將12g乳糖酸(LA)和2g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶於20ml二甲基亞碸(DMSO)中，在溫度為70℃時反應約2h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，析出的產物真空乾燥。
(2)將半乳糖端氨基的中間體L-NH2和丙烯酸(AAc)分別溶於20ml二甲基亞碸(DMSO)中，L-NH2與丙烯酸(AAc)質量比為6∶1，溶液混合濃度為0.5g/ml，加入總濃度為0.05wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)；在室溫下漩渦攪拌30h，用氯仿沉析，真空乾燥得產物GAC。
(3)按質量比GAC∶NIPAAm＝0.5∶1分別稱取GAC和單體NIPAAm，兩者溶解於去離子水中製成0.1g/ml混合溶液，加入2wt％MBAA作交聯劑，充分溶解後通氮氣20分鐘，再加入重量為0.04wt％APS和0.1wt％TEMED作為引發體系，繼續通入氮氣12分鐘，將混合物注入玻璃模具中，室溫聚合30h，得poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。將所得共聚水凝膠用去離子水浸泡一周，使其在水中達到平衡，即得目標高分子水凝膠。
實施例3 (1)將12g乳糖酸(LA)和3g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶於15ml二甲基亞碸(DMSO)中，在溫度為80℃時反應約4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，析出的產物真空乾燥。
(2)將半乳糖端氨基的中間體L-NH2和丙烯酸(AAc)分別溶於20ml二甲基亞碸(DMSO)中，L-NH2與丙烯酸(AAc)質量比為6∶1，溶液混合濃度為0.3g/ml，加入總濃度為0.15wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)；在室溫下漩渦攪拌25h，用氯仿沉析，真空乾燥得產物GAC。
(3)按質量比GAC∶NIPAAm＝0.8∶1分別稱取GAC和單體NIPAAm，兩者溶解於去離子水中製成0.2g/ml混合溶液，加入2wt％MBAA作交聯劑，充分溶解後通氮氣30分鐘，再加入重量為0.04wt％APS和0.15wt％TEMED作為引發體系，繼續通入氮氣12分鐘，將混合物注入玻璃模具中，室溫聚合48h，得poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。將所得共聚水凝膠用去離子水浸泡一周，使其在水中達到平衡，即得目標高分子水凝膠。
實施例4 (1)將12g乳糖酸(LA)和3g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶於25ml二甲基亞碸(DMSO)中，在溫度為75℃時反應約4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，析出的產物真空乾燥。
(2)將半乳糖端氨基的中間體L-NH2和丙烯酸(AAc)分別溶於20ml二甲基亞碸(DMSO)中，L-NH2與丙烯酸(AAc)質量比為5∶1，溶液混合濃度為0.4g/ml，加入總濃度為0.15wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)；在室溫下漩渦攪拌25h，用氯仿沉析，真空乾燥得產物GAC。
(3)按質量比GAC∶NIPAAm＝0.9∶1分別稱取GAC和單體NIPAAm，兩者溶解於去離子水中製成0.2g/ml混合溶液，加入2wt％MBAA作交聯劑，充分溶解後通氮氣30分鐘，再加入重量為0.04wt％APS和0.15wt％TEMED作為引發體系，繼續通入氮氣12分鐘，將混合物注入玻璃模具中，室溫聚合48h，得poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。將所得共聚水凝膠用去離子水浸泡一周，使其在水中達到平衡，即得目標高分子水凝膠。
實施例5 (1)將12g乳糖酸(LA)和3g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶於25ml二甲基亞碸(DMSO)中，在溫度為75℃時反應約4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，析出的產物真空乾燥。
(2)將半乳糖端氨基的中間體L-NH2和丙烯酸(AAc)分別溶於20ml二甲基亞碸(DMSO)中，L-NH2與丙烯酸(AAc)質量比為5∶1，溶液混合濃度為0.4g/ml，加入總濃度為0.15wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)；在室溫下漩渦攪拌25h，用氯仿沉析，真空乾燥得產物GAC。
(3)按質量比GAC∶NIPAAm＝1∶1分別稱取GAC和單體NIPAAm，兩者溶解於去離子水中製成0.2g/ml混合溶液，加入2wt％MBAA作交聯劑，充分溶解後通氮氣30分鐘，再加入重量為0.04wt％APS和0.15wt％TEMED作為引發體系，繼續通入氮氣12分鐘，將混合物注入玻璃模具中，室溫聚合48h，得poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。將所得共聚水凝膠用去離子水浸泡一周，使其在水中達到平衡，即得目標高分子水凝膠。
實施例6 (1)將12g乳糖酸(LA)和3g乙二胺(NH2CH2CH2NH2)分別溶於25ml二甲基亞碸(DMSO)中，在溫度為75℃時反應約4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，析出的產物真空乾燥。
(2)將半乳糖端氨基的中間體L-NH2和丙烯酸(AAc)分別溶於20ml二甲基亞碸(DMSO)中，L-NH2與丙烯酸(AAc)質量比為5∶1，溶液混合濃度為0.4g/ml，加入總濃度為0.15wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)；在室溫下漩渦攪拌25h，用氯仿沉析，真空乾燥得產物GAC。
(3)按質量比GAC∶NIPAAm＝0.6∶1分別稱取GAC和單體NIPAAm，兩者溶解於去離子水中製成0.2g/ml混合溶液，加入2wt％MBAA作交聯劑，充分溶解後通氮氣30分鐘，再加入重量為0.04wt％APS和0.15wt％TEMED作為引發體系，繼續通入氮氣12分鐘，將混合物注入玻璃模具中，室溫聚合48h，得poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。將所得共聚水凝膠用去離子水浸泡一周，使其在水中達到平衡，即得目標高分子水凝膠。
權利要求
1.一種半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠，包括N-異丙基丙烯醯胺，其特徵在於該水凝膠為N-異丙基丙烯醯胺與改性半乳糖基單體的共聚物，N-異丙基丙烯醯胺與半乳糖基單體的質量百分比為1∶0.2～1；其製備方法包括(1)合成半乳糖端氨基的中間體L-NH2；(2)合成帶有雙鍵的半乳糖基單體；(3)製備poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。
2.根據權利要求1所述的半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠，其特徵在於N-異丙基丙烯醯胺與半乳糖基單體(GAC)的質量百分比1∶0.2、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.8、1∶0.9或1∶1。
3.一種如權利要求1所述的半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠製備方法，包括如下步驟(1)合成半乳糖端氨基的中間體L-NH2乳糖酸和乙二胺溶於二甲基亞碸中，混合溶液濃度為0.5-1g/ml，70-80℃時反應2-4h，混合物溶液傾入氯仿沉析，真空乾燥得中間體L-NH2；(2)合成半乳糖基單體半乳糖端氨基的中間體和丙烯酸溶於二甲基亞碸，溶液混合濃度為0.2-0.5g/ml，加入總濃度為0.05-0.15wt％的1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)，攪拌20-30h，氯仿沉析，真空乾燥除去未反應物；(3)製備共聚水凝膠質量比0.2～1∶1的GAC和N-異丙基丙烯醯胺溶於水製成混合溶液，混合液濃度0.05～0.2g/ml；加入濃度為1-2wt％的MBAA，通氮氣10-30分鐘，加入0.02-0.04wt％的APS和0.05-0.15wt％的TEMED，通氮氣，將混合物注入玻璃模具中，聚合24～48h，得共聚水凝膠，共聚水凝膠去離子水浸泡至少一周，得半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠。
4.根據權利要求3所述半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠製備方法，其特徵在於N-異丙基丙烯醯胺與半乳糖基單體的質量百分比為1∶0.2、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.8、1∶0.9或1∶1。
5.根據權利要求3所述的半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠製備方法，其特徵在於所述步驟(1)中乳糖酸和乙二胺質量比為4-6∶1。
6.根據權利要求3所述的半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠製備方法，其特徵在於所述步驟(2)中半乳糖端氨基的中間體和丙烯酸質量比為4-6∶1。
全文摘要
本發明公開一種半乳糖基溫度敏感型高分子水凝膠及其製備方法。該水凝膠為Poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠，其製備方法包括三個步驟(1)合成半乳糖端氨基的中間體L-NH2；(2)合成半乳糖基帶有雙鍵的中間單體GAC；(3)利用NIPAAm和中間單體GAC製備Poly(NIPAAm-co-GAC)共聚水凝膠。該水凝膠具有很好的溫度響應性和生物相容性，對其肝細胞具有很好的識別作用，適用於組織工程中基質材料，用於細胞培養可促進細胞的黏附和生長，並可利用其溫度敏感性使細胞自動脫附。
文檔編號C08F220/54GK101293943SQ20081005360
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月23日 優先權日2008年6月23日
發明者莉 陳, 飛 肖, 邢蕊峰 申請人:天津工業大學