一種麥芽極限糊精酶的純化方法
2023-04-29 18:56:41 2
專利名稱：一種麥芽極限糊精酶的純化方法
技術領域：
本發明涉及食品生物技術領域中麥芽極限糊精酶的精製，具體涉及一種麥芽極限糊精酶的純化方法。
背景技術：
極限糊精酶(支鏈澱粉6-葡萄糖水解酶)，又稱α -糊精6-葡聚糖水解酶或普魯蘭酶(普魯蘭6-葡聚糖水解酶)，屬於澱粉水解酶。它能夠專一地催化普魯蘭、支鏈澱粉、 α-極限糊精、極限糊精等分支點中的α-1，6糖甙鍵。其主要作用在於水解α-澱粉酶和β-澱粉酶所不能水解的α-1，6糖甙鍵，從而加快澱粉降解速度，改變終產物組成，提高澱粉的水解率。極限糊精酶作為獨特降解α -1，6糖甙鍵的酶類，通過改良澱粉等產品，在食品、 醫藥、日化、紡織等行業中起著重要的作用，具有很大的商業用途。目前，市場上的極限糊精酶產品多來自於微生物酶製劑，大大限制了其在食品領域的應用。而無毒的植物來源酶則可用於食品工業領域，具有廣闊的應用前景。長期以來，因麥芽中極限糊精酶活性較低且熱穩定性較差，一直未受到重視。隨著技術的改進，對極限糊精酶的認識越來越深入，在工業生產中的重要作用日益突顯，對酶純度的要求越來越高，市場上迫切需要高純度的安全的極限糊精酶產品。
發明內容
本發明的目的在於提供一種麥芽極限糊精酶的純化方法。該方法可得到具有優良性質、高純度的產品，該基料可廣泛應用於一般食品、化工用品、醫藥領域中，具有巨大的經濟效益和社會效益。本發明的目的通過如下技術方案實現。一種麥芽極限糊精酶的純化方法，包括如下步驟和工藝條件
第一步硫酸銨分步沉澱在麥芽極限糊精酶粗提液I中添加飽和度為25 35%的硫酸銨進行一次鹽析後，在由離心機離心取得的上清液中補加硫酸銨至飽和度為75、5%進行二次鹽析，得到麥芽極限糊精酶粗提液II ；
第二步陰離子交換層析陰離子交換樹脂床體積為9(Tl00mL，用ρΗ值7.0的 15^20mmol/L Tris-HCl緩衝液平衡，然後將5. (Γ5. 5g的麥芽極限糊精酶粗提液II溶解於 2(T25mL蒸餾水中，上樣，以含有(Tlmol/L NaCl的緩衝液梯度洗脫，流速為2 4mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液I ； 第三步凝膠過濾層析凝膠過濾色譜柱床體積約為5(T60mL，用20mmol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液平衡，將第三步收集的含有極限糊精酶部分的溶液I 0. 12(T0. 125g溶於r5mL 蒸餾水中，上樣，控制流速為廣2mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液II ；
第四步將第四步所得的含有極限糊精酶部分的溶液II冷凍乾燥，即得到純化的極限糊精酶。本發明是利用具有陰離子交換作用的DEAE-瓊脂糖凝膠FF色譜和具有分子篩作用的葡聚糖凝膠柱色譜兩種柱複合純化。所述二次鹽析時間為5h 24h。所述的麥芽極限糊精酶粗提液II經過陰離子交換層析柱分離後，根據洗脫曲線， 僅收集產生蛋白吸收峰且含有極限糊精酶的洗脫組分進入下一步純化。本發明的原理
本發明利用DEAE-瓊脂糖凝膠FF色譜和葡聚糖凝膠柱色譜柱複合純化，效果顯著，得到的產品純度高。其中DEAE-瓊脂糖凝膠FF色譜陰離子交換色譜是以離子交換劑為固定相，洗脫液為流動相的層析系統。陰離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用，這些過程都是可逆的。離子交換層析依據離子交換劑對各種離子化合物的不同結合力而將各種無機離子、有機離子或生物大分子物質分開。特別是該介質為天然多糖化合物，具有極好的親水性及大網架結構，與生物活性大分子有很好的相容性，具有高離子交換容量、 無非特異性吸附、快流速操作等特點，廣泛用於蛋白質、核酸、多肽及多糖等的生物大分子實驗室規模製備和生物製藥、生物工程的大工業化製備。凝膠過濾層析又稱為排阻層析或分子篩層析，其是利用帶孔凝膠珠作基質，按分子大小進行分離的技術。小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當分離組分通過凝膠過濾層析柱時，組分中物質就按不同分子量篩分開了。本發明具有如下優點和有益效果
(1)本發明採用DEAE-瓊脂糖凝膠FF色譜和葡聚糖凝膠柱色譜柱聯合法將極限糊精酶產品快速純化，提出了採用一種製備極限糊精酶精製產品的有效方法，在食品工業領域具有廣泛的應用前景；
(2)利用陰離子交換層析和凝膠色譜作為主要手段，避免了加入其他化學試劑，而且柱填料可再生，此方法重現性好；
(3)採用本發明純化的麥芽極限糊精酶的分子量、純化倍數較之普通麥芽極限糊精酶都高。
具體實施例方式為了更好地理解本發明，下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明要求保護的範圍並不局限於實施例表示的範圍。實施例1
第一步極限糊精酶的提取向麥芽粉中添加含有20mmol/L L-半胱氨酸鹽酸鹽的pH 值為5. 5的0. lmol/L的醋酸-醋酸鈉緩衝溶液，使得料液比為1 5g/mL,置於轉速為IOOr/ min的水浴恆溫振蕩器中，在溫度35°C條件下，提取20h後，在轉速為4000r/min的離心機內離心iaiiin後，分離得到麥芽極限糊精酶粗提液I。第二步硫酸銨分步沉澱在麥芽極限糊精酶粗提液I中添加飽和度為30%的硫酸銨進行一次鹽析，在由離心機離心得到的上清液中補加硫酸銨至飽和度為75%，二次鹽析證後，離心得到麥芽極限糊精粗酶液II ；第三步離子交換層析陰離子交換樹脂床體積為IOOmL,用pH值7. O的15mmol/L Tris-HCl緩衝液平衡，然後將5. 3g的麥芽極限糊精粗酶液II溶解於25mL蒸餾水中，上樣， 以上述緩衝液和含有0. 6mol/L NaCl的緩衝液梯度洗脫，流速為4mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液I ；
第四步凝膠過濾層析凝膠過濾色譜柱床體積約為50mL，用20mmol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液平衡，將第三步分離得到的含有極限糊精酶部分的溶液I 0. 123g溶於5mL蒸餾水中，上樣，控制流速為2mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液II ；
第五步將第四步所得的含有極限糊精酶部分的溶液II冷凍乾燥，即得到極限糊精酶產品0. (^8g，經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測顯示單一條帶，分子量約97Kda，純化倍數為 29. 15。實施例2:
第一步極限糊精酶的提取向麥芽粉中添加含有22mmol/L L-半胱氨酸鹽酸鹽的pH 值為5. 4的0. lmol/L的醋酸-醋酸鈉緩衝溶液，使得料液比為1 5. 37 g/mL,置於轉速為 100r/min的水浴恆溫振蕩器中，在溫度37. 5°C條件下，提取17. 5h後，在轉速為3000r/min 的離心機內離心15min，分離得到麥芽極限糊精酶粗提液I。第二步硫酸銨分步沉澱在麥芽極限糊精酶粗提液I中添加飽和度為35%的硫酸銨進行一次鹽析，在由離心機離心得到的上清液中補加硫酸銨至飽和度為80%，二次鹽析 10h，離心得到麥芽極限糊精酶粗酶液II ；
第三步離子交換層析陰離子交換樹脂床體積為90mL，用pH值7. 0的20mmol/L Tris-HCl緩衝液平衡，然後將5. 5g的芽極限糊精酶粗酶液II溶解於25mL蒸餾水中，上樣， 以上述緩衝液和含有1. 0mol/L NaCl的緩衝液梯度洗脫，流速為2mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液I ；
第四步凝膠過濾層析凝膠過濾色譜柱床體積約為60mL，用20mmol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液平衡，將第三步分離得到的收集含有極限糊精酶部分的溶液I 0. 125g溶於4mL蒸餾水中，上樣，控制流速為2mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定， 收集含有極限糊精酶部分的溶液II ；
第五步將第四步所得的含有極限糊精酶部分的溶液II冷凍乾燥，即得到極限糊精酶產品0. 031g，經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測顯示單一條帶，分子量約97Kda，純化倍數為 29. 01。實施例3:
第一步硫酸銨分步沉澱在購買的麥芽極限糊精酶粗提液I中添加飽和度為35%的硫酸銨進行一次鹽析，在由離心機離心得到的上清液中補加硫酸銨至飽和度為85%，二次鹽析1 後，得到麥芽極限糊精酶粗提液II ；
第二步離子交換層析陰離子交換樹脂床體積為lOOmL，用pH值7. 0的20mmol/L Tris-HCl緩衝液平衡，然後將5. Og麥芽極限糊精酶粗提液II溶解於20mL蒸餾水中，上樣， 以上述緩衝液和含有0 mol/L NaCl的緩衝液(即清水)梯度洗脫，流速為3mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液I ；
第三步凝膠過濾層析凝膠過濾色譜柱床體積約為55mL，用20mmol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液平衡，將第三步分離得到的含有極限糊精酶部分的溶液I 0. 120g溶於4.5mL蒸餾水中，上樣，控制流速為lmL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液II ；
第四步將第四步所得含有極限糊精酶部分的溶液II冷凍乾燥，即得到極限糊精酶產品0. 025g，經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測顯示單一條帶，分子量約97Kda，純化倍數為 30.22。 實施例4:
第一步硫酸銨分步沉澱在購買的麥芽極限糊精酶粗提液I中添加飽和度為25%的硫酸銨進行一次鹽析後，在離心機內離心後在上清液中補加硫酸銨至飽和度為75%，鹽析 24h後，得到麥芽極限糊精酶粗提液II ；
第二步離子交換層析陰離子交換樹脂床體積為90mL，用pH值7. 0的20mmol/L Tris-HCl緩衝液平衡，然後將5. 2g的麥芽極限糊精酶粗提液II溶解於20mL蒸餾水中，上樣，以上述緩衝液和含有0. 35mol/L NaCl的緩衝液梯度洗脫，流速為3mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液I ；
第三步凝膠過濾層析凝膠過濾色譜柱床體積約為55mL，用20mmol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液平衡，將第三步分離得到的含有極限糊精酶部分的溶液I 0. 122g溶於5mL蒸餾水中，上樣，控制流速為lmL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液II ；
第四步將第四步所得的含有極限糊精酶部分的溶液II冷凍乾燥，即得到極限糊精酶產品0. 027g，經聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測顯示單一條帶，分子量約97Kda，純化倍數為 28. 14。
權利要求
1.一種麥芽極限糊精酶的純化方法，其特徵在於包括如下步驟第一步硫酸銨分步沉澱在麥芽極限糊精酶粗提液I中添加飽和度為25 35%的硫酸銨進行一次鹽析後，在由離心機離心取得的上清液中補加硫酸銨至飽和度為75、5%進行二次鹽析，得到麥芽極限糊精酶粗提液II ；第二步陰離子交換層析陰離子交換樹脂床體積為9(Tl00mL，用pH值7.0的 15^20mmol/L Tris-HCl緩衝液平衡，然後將5. (Γ5. 5g的麥芽極限糊精酶粗提液II溶解於 2(T25mL蒸餾水中，上樣，以上述緩衝液和含有0.5 1.0mol/L NaCl的緩衝液梯度洗脫，流速為2 4mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液I ；第三步凝膠過濾層析凝膠過濾色譜柱床體積約為5(T60mL，用20mmol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液平衡，將第三步收集的含有極限糊精酶部分的溶液I 0. 12(T0. 125g溶於r5mL 蒸餾水中，上樣，控制流速為廣2mL/min，收集產生蛋白吸收峰處對應的洗脫組分，進行酶活測定，收集含有極限糊精酶部分的溶液II ；第四步將第四步所得的含有極限糊精酶部分的溶液II冷凍乾燥，即得到純化的極限糊精酶。
2.根據權利要求1所述的麥芽極限糊精酶的純化方法，其特徵在於利用具有陰離子交換作用的DEAE-瓊脂糖凝膠FF色譜和具有分子篩作用的葡聚糖凝膠柱色譜兩種柱複合純化。
3.根據權利要求1所述的麥芽極限糊精酶的純化方法，二次鹽析時間為^T24h。
4.根據權利要求1所述的麥芽極限糊精酶的純化方法，其特徵在於所述的麥芽極限糊精酶粗提液II經過陰離子交換層析柱分離後，根據洗脫曲線，僅收集產生蛋白吸收峰且含有極限糊精酶的洗脫組分進入下一步純化。
全文摘要
本發明公開了一種麥芽極限糊精酶的純化方法。該方法包括1)硫酸銨分步沉澱在酶粗提液Ⅰ中添加飽和度為25~35%的硫酸銨去除雜蛋白，然後在上清液中補加硫酸銨至飽和度為75~85%，鹽析得到粗酶液Ⅱ；2)離子交換層析填料預處理並裝柱後，用pH值7.0的15~20mmol/LTris-HCl緩衝液平衡，上樣，再以含有0～1mol/LNaCl緩衝液梯度洗脫；3)凝膠過濾層析將離子交換層析柱分離得到的樣品經過凝膠過濾色譜柱進一步純化後，進行冷凍乾燥得到純化較高的極限糊精酶產品。該方法工藝簡便、安全、成本低，產品純度高，純化效果佳，是一種純化極限糊精酶的有效、可靠的方法。
文檔編號C12N9/24GK102268416SQ201110223640
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月5日 優先權日2011年8月5日
發明者馮倩倩, 胡飛 申請人:華南理工大學