建立ca16病毒感染動物模型的方法和試劑盒的製作方法

2023-05-25 04:59:26 2

專利名稱：建立ca16病毒感染動物模型的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及病毒學和免疫學技術領域，具體是涉及用於建立CA16病毒感染動物模型的病毒株、方法以及試劑盒等。
背景技術：
柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)屬於小核糖核酸(RibonucleicAcid, RNA)病毒科(Picornaviridae)，腸道病毒屬(Enterovirus)，是多種人類疾病的致病病原，致病譜廣，可引起呼吸道感染、結膜炎、發熱性皮疹、皰疹性咽峽炎、心肌炎、心肌病及無菌性腦膜炎、腦炎和急性弛緩性麻痺等疾病，CV不同於其他腸道病毒，自1948年Dalldorf首次在紐約成功分離時，即發現該病毒對新生小鼠具有很高的敏感性，根據病毒對乳鼠的致病力將其劃分成A、B兩組，共30個血清型。CA16是人類最早發現的柯薩奇病毒A組病毒成員之一，為20面立體對稱球形顆粒，直徑約23 30nm，無包膜和突起，由衣殼和核酸組成。核酸為單股正鏈RNA，全長約7410 個核苷酸，包含1個開放讀碼框架(Open Reading Frame, 0RF)，可分為PI、P2、P3三個區， 其中P2、P3區編碼非結構蛋白；Pl區編碼病毒的結構蛋白VPl VP4，該4個結構蛋白組成一個亞單位，60個亞單位組成病毒衣殼。CA16可引起5歲以下嬰幼兒手足口部皰疹，是除腸道病毒71型(EV71)以外的另一個導致手足口病(Hand，Foot and Mouth Diszease,HFMD)的主要病原體。與EV71相比， CA16引起的HFMD多數症狀較輕，不需特殊幹預可自行痊癒，但在各地的流行中也不斷出現少數CA16引發重症腦炎甚至引發死亡的報導。近幾年亞洲地區HFMD發病和死亡人數的快速增長，經流行病調查顯示多數流行呈EV71和CA16共同流行或交替流行的態勢。由於EV71 是引起重症HFMD的主要病原體，EV71疫苗和治療藥物的研究在國家多方面的重點支持下得到了快速的發展，而CA16疫苗和治療藥物的研究相對滯後，急需更多關注，以配合EV71 防治工作共同構築有效的HFMD防控體系。理想的病毒性疾病動物模型是研究病毒在體內的入侵、複製、傳導、致病、轉歸等機理以及評價疫苗預防效果和藥物療效等的重要工具，雖然50年代就已明確CA16可引起新生乳鼠出現全身性肌炎而導致死亡，但至今尚無CA16動物模型成功建立和應用的報導， 成功的動物模型已成為直接影響疫苗保護效果評價和藥物篩選的主要瓶頸。

發明內容
本發明成功篩選了適於建立CA16動物感染模型的病毒株，建立了穩定、有效的 CA16感染乳鼠動物模型，為CA16防治疫苗和藥物的研發奠定了基礎。具體地，本發明以21例2008年北京地區HFMD患兒的臨床樣本為研究對象，經 vero細胞連續傳代獲得可穩定複製的病毒株一株，命名為VR18。對VR18採用終末稀釋法進行2次噬斑純化獲得純化病毒VR18-8ac。經WHO分發的腸道病毒組合血清檢測，該病毒只能被CA16血清中和證實為CA16病毒，經全基因序列檢測，VR18的基因全長為7410nt，構建VPl區進化樹顯示VR18為CA16病毒Cl亞型，VR18-8ac的基因全長測序結果如序列表中SEQ ID N0:1所示。經挑選50個克隆，分別進行VPl區PCR擴增後基因序列檢測，證實全部克隆均為VR18病毒。經外源因子檢測，證實該病毒株無其他外源因子汙染。經生物學特性分析，該病毒株病毒滴度為6. 1751gCCID50/ml，在VERO細胞上可形成明顯噬斑，噬斑滴度為 5. 9841gPFU/ml。本發明從臨床樣本中成功分離純化了用於建立CA16病毒感染動物模型的CA16C1 亞型病毒株VR18。其中經vero細胞連續傳代獲得的病毒株VR18，第四代VR18，經連續2 代噬斑純化的VR18和經1代鼠腦純化的VR18均於保藏日期在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京)進行了生物保藏，分別為柯薩奇病毒A組16型 (Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18，保藏號CGMCC No. 4851 ；柯薩奇病毒A組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_4，保藏號CGMCC No. 4852 ；柯薩奇病毒 A 組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_8ac，保藏號CGMCC No. 4853 ；柯薩奇病毒A組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18-J，保藏號CGMCC No. 4854。 並且申請人已經提供了上述生物材料的保藏證明和存活證明。除了上述進行生物保藏的VR18病毒株，由VR18病毒株連續傳代，同時能夠用於建立CA16病毒感染動物模型的病毒株，也是本發明保護的範圍。一般來說，本發明涉及能夠用於建立CA16病毒感染動物模型，並且基因序列與SEQ ID NO 1具有90%以上，95%以上， 98%以上和99%以上同源性的CA16病毒株。本發明也涉及基因序列為由SEQ ID N0:1進行一個或幾個核苷酸取代，並能用於建立CA16病毒感染動物模型的CA16病毒株。本發明成功建立了一種CA16病毒感染動物模型的製備方法，其步驟包括使用上述CA16病毒株感染乳鼠。本發明還涉及上述CA16病毒株在建立CA16病毒感染動物模型中的用途。另外，本發明也涉及一種用於建立CA16病毒感染動物模型的試劑盒，所述試劑盒含有上述CA16病毒株。在CA16動物模型的建立中，分別使用了不同代次和不同純化方法的V18病毒株，包括 VR18 (CGMCC No. 4851)，V18-4 (CGMCC No. 4852)，經連續 2 代噬斑純化的 VR18-8ac (CGMCC No. 4853)和經1代鼠腦純化的VR18-J (CGMCC No. 4854)。結果顯示不同代次的VR18和不同純化方式獲得的VR18 (細胞培養噬斑純化、鼠腦分離純化)均可使模型動物出現不同程度的發病及死亡。根據病毒毒力和病毒純度，優選VRlS-Sac病毒株建立CA16 動物感染模型。本發明分別採用顱內、腹腔、口服方式感染1日齡以內新生ICR乳鼠。結果顯示3 種感染方式均不同程度使模型動物發病和死亡，其中顱內和腹腔方式均可在感染後短期內導致100%的死亡率。由於對於1日齡乳鼠顱內接種較腹腔接種更易操作，因此優選顱內接種方式構建CA16感染模型。本發明使用病毒株分別接種新生1、3、5、7、14日齡的ICR小鼠。結果表明新生1_5 日齡的ICR小鼠全部出現發病和死亡，發病和死亡時間隨小鼠日齡的增長而延長；而對7日齡小鼠隨可使其100%發病，但部分小鼠發病後逐漸恢復，病死率為67% ；14-21日齡小鼠則不出現發病和死亡。因此感染乳鼠的日齡可以是1-7日，優選為1日齡。本發明分別對VR18-8ac從1 :16_1 :524288進行8倍系列稀釋後進行毒力研究，結果表明該模型臨床症狀鮮明、重現性良好，同時表現出明顯的劑量依賴性、動物日齡依賴性。本發明建立的CA16動物模型，所用攻擊病毒背景清晰、無外源因子汙染、攻毒後實驗動物臨床症狀清晰、典型，重複性好、同時具有良好的劑量依賴性。通過應用研究顯示， 主動免疫CA16滅活病毒和被動免疫高效價CA16中和抗體均可保護實驗動物免受致死量病毒攻擊，可用於今後CA16疫苗或藥物的免疫保護或療效研究。


圖1不同代次、不同純化方式CA16的乳鼠敏感性比較圖2IOOOLD5tl劑量CA16病毒感染乳鼠的發病和死亡情況圖3100LD5(1劑量CA16病毒感染乳鼠的發病及死亡情況圖4CA16中和抗體保護試驗圖5CA16滅活病毒免疫保護試驗生物材料保藏菌種名稱柯薩奇病毒A 組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18， 保藏號CGMCC No. 4851 ；保藏日期2011年5月11日，保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號)；菌種名稱柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_4， 保藏號CGMCC No. 4852 ；保藏日期2011年5月11日，保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號)；菌種名稱柯薩奇病毒A 組 16 型(Coxsackievirus A Group 16type)，株 VR18-8ac，保藏號CGMCC No. 4853 ；保藏日期2011年5月11日，保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號)；菌種名稱柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株VR18_J， 保藏號CGMCC No. 4854，保藏日期2011年5月11日，保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號)；。
具體實施例方式實施例1CA16病毒的選擇根據文獻報導，CA病毒通過顱內感染方式可使1日齡以內的新生乳鼠出現全身性肌炎而死亡，因此本研究選用1日齡ICR乳鼠作為模型動物，分別對相同劑量的不同代次的VR18(VR18、VR18-4)、經連續2代噬斑純化VR18 (VR18_8ac)和經1代鼠腦純化 VR18 (VR18-J)進行顱內感染研究，結果VR18-4、VR18-8ac、VR18-J均使模型動物在感染後 4d出現後肢麻痺，感染後5d全部死亡。而VRl8感染動物症狀相對較輕，在感染後4d陸續開始出現後肢麻痺，至感染後14d除2隻動物發病後逐漸恢復外其餘6隻全部死亡，死亡率為75% (見圖1)。結果顯示不同代次VR18和不同純化方式獲得的VR18(細胞培養噬斑純化、鼠腦分離純化)均可使模型動物出現不同程度的發病及死亡。根據病毒毒力和病毒純度，優選VRlS-Sac採用顱內方式感染1日齡以內新生ICR乳鼠建立CA16動物模型。實施例2感染方式的選擇
用相同劑量VRlS-Sac病毒株分別採用顱內、腹腔、口服方式感染1日齡以內新生 ICR乳鼠。結果三種感染方式的動物死亡率分別為100^^100^^67% ；開始發病時間分別為4d、4d和5d ；全部死亡時間分別為5d、4d、12d (見表1)。顯示3種感染方式均不同程度可使模型動物發病和死亡，其中顱內和腹腔方式均可在感染後短期內導致100%的死亡率。 由於對於1日齡乳鼠顱內接種較腹腔接種更易操作，因此優選顱內接種構建CA16感染模型。表1不同感染方式的比較
權利要求
1.一種可以穩定複製和傳代的CA16病毒株VR18。
2.根據權利要求1所述的病毒株VR18，其特徵在於其基因序列如SEQIDNO :1所示，或者其基因序列與SEQ ID NO :1具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性，又或者其基因序列是由SEQ IDNO 1經過一個或幾個核苷酸取代獲得的。
3.根據權利要求1所述的病毒株VR18，其特徵在於其選自生物材料保藏編號分別為 CGMCC No. 4851，CGMCC No. 4852，CGMCC No. 4853 和 CGMCC No. 4854 的病毒株的組。
4.一種CA16病毒感染動物模型的製備方法，其特徵在於所述製備方法的步驟包括使用權利要求1-3任一項所述的CA16病毒株感染乳鼠。
5.根據權利要求4中所述的方法，其特徵在於所述的乳鼠是ICR乳鼠。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於乳鼠的日齡是1-7日。
7.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述感染的方式是顱內、腹腔或口服方式感染，感染的劑量是1 OOLD5tl-IOOOLD5tl。
8.權利要求1-3任一項所述的病毒株在製備CA16病毒感染動物模型中的用途。
9.一種用於建立CA16病毒感染動物模型的試劑盒，其特徵在於包含權利要求1-3任一項所述的CA16病毒株。
10.根據權利要求1-3任一項所述的CA16病毒株在製備建立CA16病毒感染動物模型的試劑盒中的用途
11.使用權利要求4-所述的方法製備的動物模型在CA16病毒感染疫苗開發中的用途
全文摘要
本發明成功篩選了適於建立CA16動物感染模型的病毒株VR18，並利用VR18病毒株感染乳鼠建立了CA16病毒感染的動物模型，同時本發明也涉及建立CA16動物感染模型的方法，所用的試劑盒，以及病毒株VR18在建立CA16動物感染模型中的用途等。本發明為CA16疫苗的研發提供了寶貴的實驗資料。
文檔編號C12R1/93GK102286432SQ20111016203
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月16日 優先權日2011年6月16日
發明者李鳳翔, 梁爭論, 毛群穎, 王一平, 王軍志, 貌盼勇 申請人:中國食品藥品檢定研究院