羥氯喹聯合SB431542在製備治療狼瘡性腎炎的藥物中的應用

2023-05-25 16:47:39 1

羥氯喹聯合sb431542在製備治療狼瘡性腎炎的藥物中的應用
技術領域
1.本發明屬於生物技術領域，具體涉及羥氯喹聯合sb431542在製備治療狼瘡性腎炎的藥物中的應用。


背景技術：

2.狼瘡性腎炎(lupus nephritis，ln)是自身免疫性疾病系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，sle)的最嚴重的器官表現之一。異常的抗原加工和呈遞是幹擾sle免疫反應的重要原因之一，ln的發病特點是持續產生多種針對自身抗原的自身抗體。免疫複合物沉積，炎性細胞聚集，導致腎炎症和損傷。
3.自噬對先天和適應性免疫都有深遠的影響，在系統性紅斑狼瘡的病理生理學中起著重要作用。自噬下調能夠抑制抗原呈遞細胞，使效應t細胞和b細胞的激活減少，導致自身抗體產生減少。另外，一些溶酶體酶(如組織蛋白酶s、l和b等)在狼瘡中的表達和活性發生了改變，溶酶體介導了異常的抗原加工和呈遞。研究發現在mrl/lpr狼瘡鼠的脾臟b細胞中，酸性內溶酶體ph升高了2個單位,可能會影響狼瘡中積累的免疫複合物的消除。從mrl/lpr和nzbwf1狼瘡小鼠及sle患者外周血中提取的t細胞中出現明顯的自噬小體積累,與溶酶體組織蛋白酶功能相關的改變一致。
4.調節自噬的溶酶體抑制劑如巴弗洛黴素a1(bafa1)、蛋白酶抑制劑和氯喹(cq)，在體外實驗中被用以阻止自噬。其中cq及其衍生物羥氯喹(hydroxychloroquine，hcq)降低自噬蛋白的降解，提高溶酶體內的ph。hcq是fda批准的藥物，臨床上抑制自噬進而治療腫瘤。hcq是sle的基礎用藥，存在起效慢、療效弱等問題。hcq具有毒性，特別是對眼睛(角膜和黃斑)和心臟(7)。研究發現其眼毒性與總累積劑量有關。
5.sb431542是苯甲醯胺類的成員，即4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1h-imidazol-2-yl)benzamide(4-(咪唑-2-基)苯甲醯胺在咪唑環的4位和5位分別帶有額外的1,3-苯並二氧戊環-5-基和吡啶-2-基取代基)。它具有ec2.7.10.1(受體蛋白-酪氨酸激酶)抑制劑的作用。它是苯甲醯胺的成員，咪唑的成員，吡啶的成員和苯並二氧雜環戊烯的成員。
[0006]
對現有技術的調查中，未發現hcq聯合sb431542在製備治療抑制狼瘡性腎炎藥物方面的相關報導。


技術實現要素：

[0007]
本發明的目的在於克服傳統技術中存在的上述問題，提供一種羥氯喹聯合sb431542在製備治療狼瘡性腎炎的藥物中的應用，應用羥氯喹(hcq)聯合sb431542後自噬下調，溶酶體酶的活性降低，幹預異常的抗原加工和呈遞，維持狼瘡性腎炎條件下的免疫穩態，從而抑制尿蛋白肌酐比的升高。
[0008]
為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明是通過以下技術方案實現：
[0009]
本發明提供羥氯喹聯合sb431542在製備治療狼瘡性腎炎的藥物中的應用，其中，
[0010]
sb431542為4-(咪唑-2-基)苯甲醯胺在咪唑環的4位和5位分別帶有額外的1,3-苯並二氧戊環-5-基和吡啶-2-基取代基，其分子式如下：
[0011][0012]
羥氯喹是2-[[4-[(7-氯喹啉-4-基)氨基]戊基](乙基)氨基]乙醇，是4-氨基喹啉衍生物，其分子式如下：
[0013][0014]
進一步地，羥氯喹聯合sb431542用於緩解狼瘡性腎炎的尿蛋白肌酐比升高。
[0015]
進一步地，羥氯喹聯合sb431542用於抑制狼瘡性腎炎的自噬作用和溶酶體活性。
[0016]
進一步地，在小鼠實驗中，通過口服羥氯喹及腹腔注射sb431542，抑制狼瘡性腎炎的自噬作用和溶酶體活性，起到緩解腎炎，降低尿蛋白肌酐比的作用。
[0017]
進一步地，在小鼠實驗中，選用雌性nzbwf1小鼠。
[0018]
進一步地，nzbwf1小鼠為紐西蘭黑鼠[nzb]和紐西蘭白鼠[nzw]的f1雜種，nzbwf1小鼠模型在自發性sle研究中被廣泛應用。
[0019]
進一步地，每隻小鼠每日羥氯喹的用藥劑量為120μg，每隻小鼠平均每日sb431542的用藥劑量為32μg。
[0020]
本發明提供一種聯合治療狼瘡性腎炎的藥物組合，該藥物組合包含有效量的羥氯喹和sb431542。
[0021]
本發明的有益效果是：
[0022]
本發明開發hcq聯合sb431542的用途，創造性地將hcq聯合sb431542應用於製備狼瘡性腎炎的藥物，通過下調自噬，降低溶酶體酶的活性，幹預抗原加工和呈遞過程，維持狼瘡性腎炎條件下的免疫穩態。具體的，在自發狼瘡性腎炎的小鼠模型中，發現hcq聯合sb431542可以抑制自噬，降低溶酶體酶的活性，降低小鼠尿蛋白肌酐比的作用。由於hcq聯合sb431542對於自噬和溶酶體的調節作用而降低小鼠尿蛋白肌酐比，hcq聯合sb431542有助於狼瘡性腎炎的研究和治療。
[0023]
當然，實施本發明的任一產品並不一定需要同時達到以上的所有優點。
附圖說明
[0024]
為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例描述所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0025]
圖1為各組模型小鼠尿蛋白肌酐比示意圖；
[0026]
圖2為hcq組vs ctrl組模型小鼠腎臟轉錄組測序的kegg分析結果示意圖；
[0027]
圖3為hcq組vs ctrl組模型小鼠腎臟轉錄組測序的go分析結果示意圖；
[0028]
圖4為hcq聯合sb431542組vs hcq組模型小鼠腎臟轉錄組測序的kegg分析結果示意圖；
[0029]
圖5為hcq聯合sb431542組vs hcq組模型小鼠腎臟轉錄組測序的go分析結果示意圖；
[0030]
圖6為hcq聯合sb431542組vs ctrl組模型小鼠腎臟轉錄組測序的kegg分析結果示意圖；
[0031]
圖7為hcq聯合sb431542組vs ctrl組模型小鼠腎臟轉錄組測序的go分析結果示意圖。
具體實施方式
[0032]
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0033]
sb431542是一種強效的小分子抑制劑，選擇性抑制轉化生長因子β(tgfβ)i型受體活化素受體樣激酶alk5，alk4和alk7。sb431542最初被看作潛在的抗腫瘤藥物，後來發現sb431542誘導幹細胞分化，增加體細胞重編程的效率並且調控自噬。在膀胱癌中，sb431542作為tgfβ/smad信號通路抑制劑抑制自噬，進而抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移。發明人的最近研究發現sb431542可以通過調節b細胞和抑制tlr9/tgfβ1/pdgfb信號通路來緩解ln(13)。因此，本技術中，發明人聯合應用hcq和sb431542靶向治療ln。對現有技術的調查中，未發現hcq聯合sb431542在製備治療抑制狼瘡性腎炎藥物方面的相關報導。
[0034]
nzbwf1小鼠模型(紐西蘭黑鼠[nzb]和紐西蘭白鼠[nzw]的f1雜種)在自發性sle研究中被廣泛應用。nzw和nzb都表現出有限的自身免疫性，但其雜交後的f1代表現出狼瘡性疾病的許多經典標誌，包括淋巴結腫大、脾腫大、血清抗dsdna抗體升高和免疫複合物介導的腎小球腎炎。此外，與sle患者一樣，nzbwf1小鼠存在強烈的性別偏好，雌性小鼠的發病率明顯高於雄性小鼠。為此，本技術中，發明人應用雌性nzbwf1小鼠進行檢測。
[0035]
本發明的具體實施例如下：
[0036]
實施例1
[0037]
本實施例研究hcq聯合sb431542降低模型小鼠尿蛋白肌酐比水平具體實驗方法為：
[0038]
取雌性nzbwf1小鼠32隻，隨機分為4組，每組8隻
[0039]
第1組，記為對照組：正常飼養
[0040]
第2組，記為hcq組：每隻小鼠口服給予4mg/kg/d hcq
[0041]
第3組，記為sb431542組：每隻小鼠腹腔注射200μl(1.5mg/ml)sb431542
[0042]
第4組，記為聯合給藥組：每隻小鼠口服給予4mg/kg/d hcq，並腹腔注射200μl(1.5mg/ml)sb431542。
[0043]
第3組和第4組小鼠第一周腹腔注射三次，200μl(1.5mg/ml)sb431542，隔天注射，停藥三周，此為一個周期。循環4個周期後實驗結束。第2組和第4組小鼠口服給予4mg/kg/d hcq直至實驗結束。實驗期間採尿，用酶比色法測定尿蛋白及肌酐濃度。
[0044]
實驗結果：
[0045]
實驗結果發現，control組小鼠尿蛋白肌酐比從30周齡開始顯著增加，與control組相比，hcq組、sb431542組以及hcq聯合sb431542組小鼠的尿蛋白肌酐比均顯著下降(如圖1所示)。hcq組,sb431542組，或hcq+sb431542組vs control組，*p《0.05，**p《0.01。此外，在38周齡時，與單獨應用hcq相比，hcq聯合sb431542組小鼠的尿蛋白肌酐比顯著下降，同一時間點hcq+sb431542組vs hcq組，
§
p《0.05；與單獨應用sb431542相比，hcq聯合sb431542組小鼠的尿蛋白肌酐比明顯下降，同一時間點hcq+sb431542組vs sb431542組，#p《0.05。
[0046]
實施例2
[0047]
本實施例研究hcq聯合sb431542對模型小鼠腎臟的基因轉錄組水平的影響。
[0048]
具體實驗方法為：
[0049]
實施例1中試驗結束後，取新鮮小鼠腎臟，進行高通量轉錄組測序，並應用go分析及kegg分析比較組間差異。
[0050]
實驗結果：
[0051]
分析轉錄組結果發現，hcq組vs ctrl組，3058個基因具有顯著的差異(下調1501個基因)。應用kegg分析發現，與autophagy相關的ampk信號通路明顯下調(如圖2所示)。generatio表示注釋到kegg數目的差異基因數與差異基因總數的比值。bgratio表示注釋到kegg數目的背景基因數目與背景基因總數的比值。go分析發現autophagy相關途徑顯著下調(如圖3所示)。
[0052]
hcq聯合sb431542組vs hcq組，844個基因具有顯著的差異(下調509個基因)。應用kegg分析發現，與hcq組相比，hcq+sb431542組的phagosome通路和apoptosis通路下調(如圖4所示)。go分析發現phagocytosis，apoptotic的相關途徑顯著下調(如圖5所示)。這表明與單獨應用hcq相比，hcq聯合sb431542具有疊加作用。
[0053]
hcq聯合sb431542組vs control組，有3018個差異表達基因(下調1537個基因)。應用kegg分析發現，與ctrl組相比，hcq+sb431542組autophagy，lysosome通路顯著下調(如圖6所示)。go分析發現，下調基因主要富集在autophagy等生物過程中(如圖7所示)。這些結果表明hcq與sb431542具有協同作用。
[0054]
以上公開的本發明優選實施例只是用於幫助闡述本發明。優選實施例並沒有詳盡敘述所有的細節，也不限制該發明僅為具體實施方式。顯然，根據本說明書的內容，可作很多的修改和變化。本說明書選取並具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發明的原理和實際應用，從而使所屬技術領域技術人員能很好地理解和利用本發明。本發明僅受權利要求書及其全部範圍和等效物的限制。