馬鈴薯致病疫黴二醯甘油醯基轉移酶基因dgat2-4及其應用的製作方法

2023-05-25 17:37:01 1

馬鈴薯致病疫黴二醯甘油醯基轉移酶基因dgat2-4及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種馬鈴薯致病疫黴二醯甘油醯基轉移酶基因DGAT2-4及其應用，通過RT-PCR的方法，在馬鈴薯致病疫黴中分離到的與三醯甘油合成相關的二醯甘油醯基轉移酶基因DGAT2-4，屬於分子生物學和生物【技術領域】。通過酵母突變體互補實驗鑑定和轉基因酵母突變體細胞內三醯甘油含量測定表明，它是一個新的二醯甘油醯基轉移酶基因，其編碼的二醯甘油醯基轉移酶能夠將醯基CoA底物加到Sn-1,2-二醯甘油的Sn-3的位置上形成三醯甘油，可以用於提高植物、微生物中油份含量。
【專利說明】馬鈴薯致病疫黴二醯甘油醯基轉移酶基因DGAT2-4及其應 用 (一） 發明領域
[0001] 本發明涉及馬鈴薯致病疫黴二醯甘油醯基轉移酶（diacylglycerol acyltransferase,DGAT)DGAT2-4及其應用，屬於分子生物學和生物【技術領域】。 (二） 技術背景
[0002] 馬鈴薯致病疫黴能夠導致馬鈴薯和番茄等重要農作物發生晚疫病，但其菌絲體中 三醯甘油（triacylglycerol，TAG)含量高,並含有豐富的長鏈多不飽和脂肪酸（Yen，Stone etal. 2008 ;Sun，Liuetal. 2013)。馬鈴薯致病疫黴基因組測序完成，為克隆、鑑定馬鈴薯 致病疫黴TAG合成途徑相關基因及進一步的基因工程應用奠定了基礎。
[0003] 三醯甘油由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，是脂肪酸和能量的儲藏庫，普遍 存在於植物、動物和真菌中。TAG除作為重要的食用油外，還是重要的化工原料。
[0004] 近年來,通過植物和微生物生產的TAG來替代原油被作為一種可持續的綠色環保 能源而受到人們的重視。TAG合成途徑主要有兩條，依賴醯基CoA的途徑和不依賴醯基CoA 的途徑。依賴醯基CoA的途徑又稱為Kennedy途徑，以醯基CoA作為底物在甘油骨架上進 行連續的醯化反應。
[0005]DGAT是一種跨膜蛋白（細胞溶質DGAT除外），在依賴醯基CoA的Kennedy途徑 中催化TAG合成的最後一步反應，將醯基CoA底物加到Sn-1，2-二醯甘油的Sn-3的位置 上形成三醯甘油，是植物中儲存油脂積累的限速步驟（Ichihara,Takahashietal. 1988; Sebei,Ouerghietal. 2006)oDGAT超表達能夠增加擬南芥種子中油脂的含量（Xu,Francis etal. 2008)。另外，在大豆、油菜、玉米中也有同樣的結果（Jako,Kumaretal. 2001; Zheng,Allenetal. 2008 ;Lock，Snyderetal. 2009)。
[0006] 克隆、鑑定新的DGAT基因，對利用轉基因技術，在植物或微生物中過量表達高催 化活性的DGAT酶，從而提高植物或微生物中含油量具有重要的意義。
[0007] 本發明在馬鈴薯致病疫黴中克隆到1個編碼DGAT的cDNA序列，在DGAT基因的突 變體釀酒酵母中誘導表達這個基因，發現其編碼產物能夠利用油酸（oleicacid，0A)合成 TAG，證明了其具有二醯甘油醯基轉移酶活性。 (三）


【發明內容】

[0008] 本發明利用同源克隆的方法，從馬鈴薯致病疫黴（Phytophthorainfestans)中 克隆到了 1個DGAT基因的cDNA全長序列，其編碼的胺基酸序列與其它物種中已鑑定的 DGAT胺基酸系列進行系統進化樹分析表明，該基因屬於DGAT2,因此將這個基因命名為 PiDGAT2-4。其核苷酸序列如SEQ.ID.NO1所示；其胺基酸序列如SEQ.ID.NO2所示。
[0009] 本發明通過RT-PCR的方法，在馬鈴薯致病疫黴中分離到的與三醯甘油合成相關 的二醯甘油醯基轉移酶基因DGAT2-4 ;通過酵母突變體互補實驗鑑定和轉基因酵母突變體 細胞內三醯甘油含量測定表明，它是一個新的二醯甘油醯基轉移酶基因，其編碼的二醯甘 油醯基轉移酶能夠將醯基CoA底物加到Sn-1，2-二醯甘油的Sn-3的位置上形成三醯甘油， 可以用於提高植物和微生物中油份含量。
[0010] 該基因CDNA序列如下：
[0011] 序列表
[0012] (I)SEQIDNO1 的信息
[0013] (a)序列特徵
[0014] *長度：1146鹼基對
[0015] *類型：核酸
[0016] *鏈型：雙鏈
[0017] *拓撲結構：線性
[0018] (b)分子類型：cDNA
[0019] (C)假設：否
[0020] (d)反義：否
[0021] (e)最初來源：馬鈴薯致病疫黴
[0022] (f)序列描述：SEQINNO. 1
[0023] ATGGCGAAGCTCACGAATGCGGCTTGCGGTCGCACATCTGCGTGGCCGGACTTTGATACT 60 CGCCCAGAGTTGCGAACGCTACGAGGGCGATTCATGCGACGCTTCGATCTCTTCATTCTC 120 TACGGTCTCTGGGTCGTCGGCCTCCXGTTTCTCGCAGTAATGTGGGTCTTCTCACTCTTC 180 TGTTTGGTGCAATGGAGTTGGAGACGAGCTACACACGACCATGCTCCTCCGATGGCATTT 240 TCAGCCCAGATATACCTGGGTTTCATCGTGCTGCACGAAAGCTACCACTACCTCACAAAA 300 CCTTCGTTGCATCAGTGGCCATTTATGAGACGTTTTTTTCGACAAGTTTTTCTTCATTAC 360 CCATACTTCCGCCTCAACGTCTTGGTTTTTGAAGAGCGTTCGAAAACTTCAAGTGAAAAT 420 GGCAAATGCAACAAAGAAATTGCCAGCAAGGCCGTTGAAGAGAACAATCTGTCGCCATTC 480 GTGACCCCCGATGATCGCGCTCTATTTGCCTTCCATCCGCACGGTGTCCTCTCCAGTGGA 540 TTCGCCTTCAACGGCGCGCACCACATGGGATTCTTGCATGCCCATTGTCGCTGGCTCGTA 600 TCGGAGAATCTCTTCTGGTTCCCCGTCATGCGCGACCTGTTGAACTGGATGGACTTCAGT 660 TGCGTATCTCGATCGACTTTCCATCGTTTCATGGCCACAGGTCAAAATGTGTGTTTGATC 720
[0024] CCTGGCGGCTTCGAAGACGCAACACTCTACGAACGAGGCAAACATCGTGTGTACATCAAG780AAACGCTTTGGCTTTATCAAGTTGGCTTTGCAGTATGGGTACAAGGTGCACCCAGTGTAC840 ACGTTCGGGGAGGAGTACGCTTATCACACCTTTCCTTATCTGCTCAAGTTGCGTCTCAAG900 CTGAACGAGTTCAAGATTCCTGGAGTCTTTTTCTTCGGTCTTCCGCATTGTTTCTTTCTG960 CCTCGCACCGACGTGGACCTTATCACTGTCGTTGGAGAACCCTTGGTCCTGCCGCGTATC1020 GAACAACCGACCMGGAAGACGTGCAGMATACCATGGTCAGTACGTCGAGGCTCTGCAA1080 AAGCTGTTCAACAAGTACAAGTCTGTGTACGCAGTCGACCCAGACGCTGAACTTGAATTA1140 TACTGA 1146
[0025] (?SEQINNO.2的信息
[0026] (a)序列特徵
[0027] *長度：381胺基酸
[0028] *類型：胺基酸
[0029] *鏈型：單鏈
[0030] *拓撲結構：線性
[0031] (b)分子類型：蛋白質
[0032] 序列描述
[0033] MET Ala Lys Leu Thr Asn Ala Ala Cye Gly Arg Thr Ser Ala Trp 15 10 15 Pro Asp Phe Asp Thr Arg Pro Glu Leu Arg Thr Leu Arg Gly Arg 16 20 25 30 Phe MET Arg Arg Phe Asp Leu Phe lie Leu Tyr Gly Leu Trp Val 31 35 40 45 Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Val MET Trp Val Phe Ser Leu Phe 46 50 55 60 Cys Leu Val Gln Trp Ser Trp Arg Arg A丄a Thr His Asp His Ala 61 65 70 75 Pro Pro MET Ala Phe Ser Ala Gln lie Tyr Leu Gly Phe 工Ie Val 76 80 85 90 Leu His Glu Ser Tyr His Tyr Leu Thr Lys Pro Ser LeU His Gln 91 95 100 105 Trp Pro Phe MET Arg Arg Phe Phe Arg Gln Val Phe Leu His Tyr
[0034] 106 HO lib 120 Pro Tyr Phe Arg Leu Asn Val Leu Val Phe Glu GIu Arg Ser Lys 121 125 13C 135 Thr Ser Ser G丄u Asn G丄y Lys Cys Asn Lys Glu He Ala Ser Lys 136 140 145 150 Aia Val Giu Glu Asn Asn Leu Ser Pro Phe Val Thr Pro Asp Asp 151 155 16C 155 Arg Ala Leu Phe Ala Phe His Pro His Gly VaI Leu Ser 5er Gly 166 170 175 130 Phe Ala Phe Asn Gly Ala His His MET Gly Phe Leu His Ala His 181 185 19C 195 Cys Arg Trp Leu Val Ser Glu Asn Leia Phe Trp Phe Pro Val MET 196 200 2：] 5 210 Arg Asp Leu Leu Asn Trp MET Asp Phe Ser Cys Val Ser Arg Ser 211 215 220 225 Thr Phe His Arg Phe MET Ala Thr Gly Gln Asn Val Cys Leu lie 226 230 235 240 Pro Gly Gly Phe Glu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu Arg Gly Lys His 241 245 250 255 Arg Val Tyr lie Lys Lys Arg Phe Gly Phe He Lys Leu Ala Leu 256 260 265 270 G_n Tyr Gly Tyr Lys Val His Pro Val Tyr Thr Phe Gly Glu Glu 27： 275 280 285 Tyr Ala Tyr His Thr Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Leu Arg Leu Lys 286 290 295 300 Leu Asn Glu Phe Lys lie Pro G丄γ Va丄Phe Phe Phe G丄y Leu Pro 301 305 310 315 His Cys Phe Phe Leu Pro Arg Thr Asp Val Asp Leu lie Thr Val 316 320 325 330 Va丄G丄y G丄u Pro Leu /a丄 Leu Pro Arg 工丄e Glu G丄n Pro Thr Lys W丄 335 34C 345
[0035] Glu Asp Val Gln Lys Tyr His Gly Gln Tyr Val Glu Ala Leu Gln 34 6 350 355 360 Lys Leu Phe Aen Lys Tyr Lys Ser Val Tyr Ala Val Asp Pro Asp 361 365 370 375 Ala Glu Leu Glu Leu Tyr 376 380
[0036] 利用酵母載體pYES2將PiDGAT2-4基因轉化到釀酒酵母突變體H1246中，進行突 變體互補實驗以驗證06八1'活性。釀酒酵母突變體!11246((^&1，11'〇1， &代1&11(1&代2)為4 基因突變體，由於酵母中的1個DGAT2、1個PDAT和2個ASAT基因被敲除，在此突變體酵母 細胞中不能合成TAG，因而在油酸存在下生長受到抑制。但是體內一旦有TAG合成，生長抑 制會得到緩解，酵母細胞就能在一定程度上恢復生長。
[0037] 結果顯示（附圖1)，酵母濃度在OD值為1.0時，轉空載體pYES2的酵母突變體 H1246在含有油酸的酵母固體培養基上只有少量生長，經梯度稀釋後生長几乎完全受到抑 制；而轉空載體PYES2的野生型SCY62酵母和轉PiDGAT2-4基因的酵母突變體H1246在OD 值為I. 0時正常生長，經梯度稀釋後仍能不同程度繼續生長，表明在轉PiDGAT2-4基因酵母 細胞中都有TAG的合成，也即PiDGAT2-4具有二醯甘油醯基轉移酶活性。
[0038] 將上述轉基因酵母經半乳糖誘導培養48h後，收集等量菌體，用普利萊基因技術 有限公司（ApplygenTechnologies)的甘油三酯酶法測定試劑盒Plasmatriglyceride assaykitE1003測定轉基因酵母中TAG含量（附圖2)。對照組中野生型酵母TAG含量為 54. 17μM，突變體酵母H1246中TAG含量為4. 90μM，轉PiDGAT2-4基因的突變體酵母H1246 中TAG含量達到64. 17μM(附圖3)，明顯高於野生型酵母，說明PiDGAT2-4基因編碼產物具 有較高的二醯甘油醯基轉移酶活性。 (四）【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1 :酵母突變體互補實驗
[0040]圖 1 中：SCY62+pYES2:轉空載體pYES2 的野生型酵母SCY62 ;H1246+pYES2 :轉空 載體pYES2的突變體酵母H1246 ;H1246+PiDGAT2-4 :轉pYES2:DGAT2-4載體的突變體酵母 H1246 ; 1/10、1/20、1/40、1/60、1/100 :不同稀釋濃度的酵母。酵母濃度在OD值為1.0時，轉 空載體PYES2的酵母突變體H1246在含有油酸的酵母固體培養基上只有少量生長，經梯度 稀釋後生長几乎完全受到抑制；而轉空載體PYES2的野生型SCY62酵母和轉PiDGAT2-4基 因的酵母突變體H1246在OD值為I. 0時正常生長，經梯度稀釋後仍能不同程度繼續生長， 表明在轉PiDGAT2-4基因酵母細胞中都有TAG的合成，也即PiDGAT2-4具有二醯甘油醯基 轉移酶活性。
[0041] 圖2:標準曲線
[0042] 圖2中：經梯度濃度稀釋的標準品進行顏色反應後，在550nm下測定相應吸光值， 繪製的標準曲線。
[0043] 圖3:各轉基因酵母TAG含量
[0044] 圖3中：縱坐標表示測定的酵母細胞中TAG的含量，橫坐標為不同類型的酵母； SCY62:轉pYES2空載體的野生型酵母；H1246:轉pYES2空載體的突變體酵母H1246;B:轉 pYES2:DGAT2-4載體的酵母H1246;每個轉基因TAG含量的測定都設三次重複，取平均值。 轉PYES2空載體的野生型酵母SCY62細胞中TAG含量為54. 17μM，轉pYES2空載體的突變 體酵母Η1246細胞中TAG含量為4. 90μΜ，轉PiDGAT2-4基因的突變體酵母Η1246中TAG含 量達到64. 17μM，明顯高於轉pYES2空載體的野生型酵母和突變體酵母，說明PiDGAT2-4基 因編碼產物具有較高的二醯甘油醯基轉移酶活性。
[0045](五）具體發明實施方式
[0046] 實施例1:馬鈴薯致病疫黴DGAT基因DGAT2-4cDNA的獲得
[0047] 1.馬鈴薯致病疫黴的培養：接種馬鈴薯致病疫黴到新鮮的燕麥培養基，20度，黑 暗培養。
[0048] 2.總RNA的提取：收集生長15天左右的菌絲體，利用TRIZOL法（Invitrogen)提 取總RNA。
[0049]3.取 2 微克總RNA,用MMLVReverse Transcriptase (Promega)，按試劑說明書使 用方法反轉錄成單鏈cDNA。
[0050] 4.以所獲得的馬鈴薯致病疫黴的cDNA為模板，用引物5' -
[0051] GGTACCATGTTCTACATCCCCCTAGGGC-3'（SEQ. ID. NO. 4所示）和
[0052] 5' -GAGCTCCTAAACGATCACCAACGTTTCGTCC-3'（SEQ.ID.NO. 5 所示）進行PCR反 應，PCR體系：CldH2O35. 5μI;IOXperbuffer(含Mg2+) 5μI;dNTP(2. 5mM) 4μ1;引物 (5μM)各2μI;模板IμI;Taq酶0· 5μI。反應條件：94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒， 58°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，35個循環；72°C延伸10分鐘。擴增得到PiDGAT2-4基因 cDNA全長序列，將擴增的該片段膠回收後，連接到克隆載體pMD18-T中。
[0053] 5.序列測定：本工作在上海生工生物工程技術服務有限公司進行。獲得 PiDGAT2-4基因cDNA全長序列長度1146bp。
[0054] 6.同源檢索：利用BLAST軟體將上述獲得的cDNA片段編碼的胺基酸序列與基因 銀行中的序列進行比較，其編碼的胺基酸序列與其它物種中已鑑定的DGAT胺基酸系列進 行系統進化樹分析表明，該基因屬於DGAT2,因此將這個基因命名為PiDGAT2-4。
[0055] 實施例2 :馬鈴薯致病疫黴PiDGAT2-4基因，如下序列：
[0056] (I)SEQ ID NO. 1的信息
[0057] (a)序列特徵
[0058] *長度：1146鹼基對
[0059] *類型：核酸
[0060] *鏈型：雙鏈
[0061] *拓撲結構：線性
[0062] (b)分子類型：cDNA
[0063](C)假設：否
[0064] (d)反義：否
[0065] (e)最初來源：馬鈴薯致病疫黴（Phytophthora infestans)
[0066] (f)序列描述：SEQINNO. 1
[0067] IATGGCGAAGCTCACGAATGCGGCTTGCGGTCGCACATCTGCGTGGCCGGACTTTGATACT 60 61 CGCCCAGAGTTGCGAACGCTACGAGGGCGATTCATGCGACGCTTCGATCTCTTCATTCTC 120 121 TACGGTCTCTGGGTCGTCGGCCTCCTGTTTCTCGCAGTAATGTGGGTCTTCTCACTCTTC 180 181 TGTTTGGTGCAATGGAGTTGGAGACGAGCTACACACGACCATGCTCCTCCGATGGCATTT 240 241 TCAGCCCAGATATACCTGGGTTTCATCGTGCTGCACGAAAGCTACCACTACCTCACAAAA 300 301 CCTTCGTTGCATCAGTGGCCATTTATGAGACGTTTTTTTCGACAAGTTTTTCTTCATTAC 360 361 CCATACTTCCGCCTCAACGTCTTGGTTTTTGAAGAGCGTTCGAAAACTTCAAGTGAAAAT 420 421 GGCAAATGCAACAAAGAAATTGCCAGCAAGGCCGTTGAAGAGAACAATCTGTCGCCATTC 480 481 GTGACCCCCGATGATCGCGCTCTATTTGCCTTCCATCCGCACGGTGTCCTCTCCAGTGGA 540 541 TTCGCCTTCAACGGCGCGCACCACATGGGATTCTTGCATGCCCATTGTCGCTGGCTCGTA 600 601 TCGGAGAATCTCTTCTGGTTCCCCGTCATGCGCGACCTGTTGAACTGGATGGACTTCAGT 660 661 TGCGTATCTCGATCGACTTTCCATCGTTTCATGGCCACAGGTCAAAATGTGTGTTTGATC 720 721 CCTGGCGGCTTCGAAGACGCAACACTCTACGAACGAGGCAAACATCGTGTGTACATCAAG 780 781 AAACGCTTTGGCTTTATCAAGTTGGCTTTGCAGTATGGGTACAAGGTGCACCCAGTGTAC 840 841 ACGTTCGGGGAGGAGTACGCTTATCACACCTTTCCTTATCTGCTCAAGTTGCGTCTCAAG 900 901 CTGAACGAGTTCAAGATTCCTGGAGTCTTTTTCTTCGGTCTTCCGCATTGTTTCTTTCTG 960 961CCTCGCACCGACGTGGACCTTATCACTGTCGTTGGAGAACCCTTGGTCCTGCCGCGTATC1020 1021GAACAACCGACCAAGGAAGACGTGCAGAAATACCATGGTCAGTACGTCGAGGCTCTGCAA1080 1081AAGCTGTTCAACAAGTACAAGTCTGTGTACGCAGTCGACCCAGACGCTGAACTTGAATTA1140 1141TACTGA
[0068] (3)SEQINNO. 2 的信息
[0069] (a)序列特徵
[0070] *長度：381胺基酸
[0071] *類型：胺基酸
[0072] *鏈型：單鏈
[0073] *拓撲結構：線性
[0074] (b)分子類型：蛋白質
[0075] (C)序列描述
[0076] MET Ala Lys Leu Thr Asn Ala Ala Cys Gly Arg Thr Ser Ala Trp 15 10 15 Pro Asp Phe Asp Thr Arg Pro Glu Leu Arg Thr Leu Arg Gly Arg 16 20 25 30 Phe MET Arg Arg Phe Agp Leu Phe 工Ie Leu Tyr Gly Leu Trp Val 31 35 40 45 Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Val MET Trp Val Phe Ser Leu Phe 46 50 55 60 Cys Leu Val Gln Trp Ser Trp Arg Arg Ala Thr His Asp His Ala 61 65 70 75 Pr ) Pro MET A丄a Phe Ser Ala Gln lie Tyr Leu G丄y Phe I丄e Val 76 80 85 90 Leu His Glu Ser Tyr His Tyr Leu Thr Lys Pro Ser Leu His Gln 91 95 100 105 Trp Pro Phe MET Arg Arg Phe Phe Arg Gln Val Phe Leu His Tyr 106 HO 115 120 Pro Tyr Phe Arg Leu Asn Val Leu Val Phe Glu Glu Arg Se Lys 121 125 130 135 Thr Ser Ser Glu Asn Gly Lys Cys Asn Lys Glu lie Ala Ser Lys 136 140 145 150 Ala Val Glu Glu Asn Asn Leu Ser Pro Phe Val Thr Pro Asp Asp 151 155 160 165
[0077] Arg Ala Leu Phe Ala Phe His Pro His Gly Val Leu Ser Ser 31y 166 170 175 180 Phe Ala Phe Asn Gly Ala His His MET Gly Phe Leu His Ala His 181 185 190 195 Cys Arg Trp Leu Val Ser Glu Asn Leu Phe Trp Phe Pro Val MET 196 200 205 210 Arg Asp Leu Leu Asn Trp MET Asp Phe Ser Cys Val Ser Arg Ser 211 215 220 225 Thr Phe His Arg Phe MET Ala Thr Gly Gln Asn Val Cys Leu工Ie 226 220 235 240 Pro GIy Gly Phe Glu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu Arg Gly Lys His 241 245 250 255 Arg Val Tyr工Ie Lys Lys Arg Phe Gly Phe lie Lys Leu Ala Leu 256 260 265 270 Gln Tyr Gly Tyr Lys Val His Pro Val Tyr Thr Phe Gly Glu Glu 271 275 280 285 Tyr Ala Tyr His Thr Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Leu Arg Leu Lys 286 290 295 300 Leu Asn Glu Phe Lys工Ie Pro Gly Val Phe Phe Phe Gly Leu Pro 301 305 310 315 His Cys Phe Phe Leu Pro Arg Thr Asp Val Asp Leu lie Thr Val 316 320 325 330 Val Gly Glu Pro Leu Val Leu Pro Arg工Ie Glu Gln Pro Thr Lys 331 335 340 345 GIu Asp Val Gln Lys Tyr His Gly GIn Tyr Val Glu Ala Leu Gin 346 350 355 360 Lys Leu Phe Asn Lys Tyr Lys Ser Val Tyr Ala Val Asp Pro Asp 361 365 370 375 Ala Glu Leu Glu Leu Tyr 376 380
[0078] 實施例3 :酵母表達載體pYES2:PiDGAT2-4的構建
[0079] 用KpnI和SacI從實施例I中構建的含有PiDGAT2-4cDNA全長片段的pMD18-T載 體上切下該PiDGAT2-4片段，與相同限制性內切酶酶切的酵母表達載體pYES2連接。連 接產物轉化大腸桿菌XLlO感受態細胞，然後在含氨苄青黴素的LB固體平板上培養，對菌 落進行PCR篩選、鑑定和質粒DNA的酶切分析，獲得帶有PiDGAT2-4基因的酵母表達載體 pYES2:PiDGAT2-4。實施例4 :酵母突變體互補實驗
[0080] 1.利用醋酸鋰法將空載體PYES2分別轉化到野生型酵母SCY62和突變體酵母 H1246中；用同樣的方法將酵母表達載體pYES2:PiDGAT2-4轉化到突變體酵母H1246中。
[0081] 2.取陽性酵母克隆於IOmlSC-U(SyntheticCompletemediumwithoutUracil) 液體培養基中，28 °C，過夜培養。
[0082]3.次日，取I. 5ml過夜培養物接種到25ml新鮮的SC-U培養液中（含1 %NP40)， 28〇C, 180rpm〇
[0083] 4.當培養液0D600到0· 4-0.6之間，添加Iml濃度為50%的半乳糖，22°C，180rpm， 繼續培養48小時。使培養液OD值為I. 0,然後按1、1/10、1/20、1/40、1/60、1/100分別對培 養液進行酵母濃度梯度稀釋，取各濃度的培養液2μL，點在含有油酸的酵母SC-U固體培養 基上，28°C培養72h。結果顯示（附圖1)，酵母濃度在OD值為I. 0時，轉空載體pYES2的酵母 突變體H1246在含有油酸的酵母固體培養基上只有少量生長，經梯度稀釋後生長几乎完全 受到抑制；而轉空載體PYES2的野生型SCY62酵母和轉PiDGAT2-4基因的酵母突變體H1246 在OD值為1.0時正常生長，經梯度稀釋後仍能不同程度繼續生長，表明在轉PiDGAT2-4基 因的酵母突變體H1246細胞中有TAG的合成，也即PiDGAT2-4基因編碼產物具有二醯甘油 醯基轉移酶活性。
[0084] 實施例5 :PiDGAT2_4二醯甘油醯基轉移酶活性在酵母中的測定
[0085] 1.收集實施例4中液體培養48h的酵母培養液，室溫7000rpm離心IOmin,收集菌 體約0. 35g，然後用500μL磷酸緩衝液重新懸浮。用超聲波細胞破碎儀破碎30min，已破碎 酵母細胞壁。破碎頻率為振蕩l〇s，間隔10s。
[0086] 2.選用普利萊基因技術有限公司（ApplygenTechnologies)的甘油三酯酶法測 定試劑盒PlasmatriglycerideassaykitE1003測定酵母中甘油三酯的濃度。按試劑盒 說明書配製工作液：按體積4:1比例，取4mL試劑Rl與ImL試劑R2混合即可，立即使用或 4°C保存〈ld，變色棄去。
[0087] 3.標準品稀釋：4mM甘油三酯標準品用蒸餾水稀釋為2000、1000、500、250、125、 62. 5、31. 25、15. 625 μ M，注意設置0濃度對照反應管。
[0088] 4.按照試劑盒操作說明向標準品和測定樣品中添加試劑。
[0089] 5. 37?反應IOmin。
[0090] 6.用蒸餾水空白管調零，然後在550nm波長下測定各管OD值。
[0091] 7.繪製標準曲線（附圖2)並計算待測樣品的甘油三酯濃度。結果顯示（附圖3)， 轉空載體PYES2的野生型SCY62酵母細胞中TAG含量為54. 17μM，轉空載體pYES2的酵母 突變體Η1246細胞中TAG含量為4. 90μΜ，轉pYES2:PiDGAT2-4載體的酵母突變體Η1246細 胞中TAG含量達到64. 17μM，明顯高於野生型酵母，說明PiDGAT2-4基因編碼產物具有較高 的二醯甘油醯基轉移酶活性。
【權利要求】
1. 馬鈴薯致病疫黴二醯甘油醯基轉移酶基因 DGAT2-4,其特徵在於其核苷酸序列如 SEQ. ID. NO 1所示；其胺基酸序列如SEQ. ID. NO 2所示。
2. 如權利要求1所述的基因 DGAT2-4在提高植物和微生物中油份含量中的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK104357467SQ201410665651
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月19日 優先權日:2014年11月19日
【發明者】亓寶秀, 李新徵, 孫美紅, 宋憲亮 申請人:山東農業大學