微生物發酵生產透明質酸鈉的製造方法

2023-05-13 20:48:56 1

專利名稱：微生物發酵生產透明質酸鈉的製造方法
技術領域：
本發明涉及微生物和用於日用化妝品的中間載體，特別是涉及一種以微生物發酵工程來生產用於化妝品的透明質酸鈉的方法。
透明質酸(Hyaluronic acid)是一種由葡萄糖醛酸與N-乙醯氨基葡萄糖交替連接組成的線性多聚物，分子量多數在20萬-350萬道爾頓之間或更高。產品為白色粉末，以透明質酸鈉鹽的形式存在。
透明質酸具有極好的保水性和協助滲透的特性，應用於臨床醫學作為粘結劑，化妝品工業作為替代甘油的高級保水因子，其需求量日益增加，應用領域逐步擴展，已為世界各國所重視。
透明質酸傳統的提取方法是採用動物組織為原料，從人臍帶、雞冠、牛羊豬眼的玻璃體中提取透明質酸，這些動物組織必須是新鮮採集的，並經冷凍處理。所說的動物組織來源困難，價格昂貴，而這些動物組織中透明質酸的含量很低，產品收率低。在提取過程中，須使用大量的有機溶劑和酶，工藝複雜，操作單元多，使透明質酸的成本大增。另外用從動物組織中提取的方法生產的透明質酸雜質含量高，精製困難。
本發明的目的在於提供一種工藝簡單、成本低的以微生物發酵工程來生產透明質酸鈉的方法。
本發明的解決技術方案是這樣的採用多種原料用微生物發酵法來生產透明質酸，所需培養基的來源廣，不受限制，價格較便宜，降低了透明質酸的成本，同時有利於工業化生產。由於透明質酸是微生物分泌到細胞體外的胞外多糖，在提取過程中，不需將細胞破碎，發酵液中的蛋白質含量少，這使得提取工藝變得簡單，不需大量的有機溶劑，更不需要蛋白酶，使透明質酸的成本大大降低。而且發酵法生產透明質酸的得率比較高。用發酵法生產的透明質酸還有利於進一步精製，製成較純製劑，用於眼科手術及其它醫學領域。
要採用微生物發酵法來生產透明質酸，最關鍵的措施是要篩選和培養一種能夠優質高產地製造透明質酸的菌株並篩選出一種最適宜於培養該菌株的培養基。
本發明人於1990年從日本東京大學醫學研究所吉彥昌教授處獲得一種適宜於生產透明質酸的菌種，其學名為Streptococcus equi，中文名為馬疫鏈球菌。然而，當用這種菌株來製造透明質酸鈉時，所獲產品中的蛋白質含量較高(3.68重量%)，當將含有較高蛋白質的透明質酸鈉用於化妝品時容易引起皮膚過敏，因此該原始菌種不夠理想。
本發明人決定以上述的馬疫鏈球菌作為原始菌種進行誘變和篩選，培養一種更優良的菌株。所採用的誘變方法是用15W紫外燈在約30cm距離處照射原始菌株60-90秒，然後通過測定透明質酸酶活力的方法，選擇出透明質酸酶活力弱或無的單菌落，經過8個月的反覆篩選培養，獲得了一種適應性強，生命力旺盛，透明質酸(下文簡稱HA)產量高的，安全的突變型新菌株(菌株編號N90006)。
本發明人對新菌株用下述方法進行鑑定。首先按微生物學的常規方法在形態和生理生化兩方面確定N90006號新菌株是一種馬疫鏈球菌的突變體。然後在透明質酸酶鑑定平板上與作為原始菌株的日本菌株進行比較，證明該新菌株是一種透明質酸酶活力很弱的突變類型。在進行鑑定時，所用的鑑定平板是含有1%牛血清白蛋白、0.2%透明質酸、1%瓊脂糖、pH6.8±1的培養基平板。通過劃線法或影印法接種鑑定平板，於37℃培養至菌落形成(通常在40小以上)，然後用2N乙酸覆蓋10分鐘，觀察菌落周圍的透明圈的大小以進行比較。日本菌株在鑑定平板上形成的透明圈很大，而新菌株N90006形成的透明圈則很小或者幾乎不形成透明圈。這說明日本菌株的透明質酸酶活力較強，而本發明的新菌株的透明質酸酶活力很小或基本上無活力。由此可證明N90006號新菌株是一種馬疫鏈球菌的突變體。
本發明人將該新菌株送往中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO，M94034(以下簡稱CCTCC94034)，保藏日為1994年6月20日。
下面對CCTCC94034菌株的特徵描述如下a、菌體直徑為0.6-1μm的圓球形或卵圓球形，常排列成鏈狀，菌鏈的長短與生長環境有關，在液體培養基中易呈長鏈狀，在固體培養基上易呈短鏈狀。
b、菌落透明、閃光，微隆起，呈露滴狀。
c、草蘭氏染色陽性，培養久後呈陰性，無芽孢。
d、兼性厭氧。
e、溶血血平板上菌落周圍形成不透明的綠色圈。
f、蘭氏分類(Lance field)Dg、安全性對人及馬以外的動物無侵染性。
h、發酵特性山梨醇+ 馬尿酸鈉-乳糖- 七葉苷-菊糖- 精氨酸-然後本發明人以CCTCC94034菌株作為培養對象，篩選出一種最適宜該菌株生長和繁殖的培養基。該培養基是一種水溶液體系的培養基。每升培養基液含有以下物質蛋白腖 5-15g KH2PO45-15g乙酸鈉 3-15g NaHCO32-5gMgSO4·7H2O 0.1-1.0g FeSO4·7H2O 0.05-0.2gMnCl2·4H2O 0.05-0.2g CaCl20.02-0.2g酵母粉 3-10g 葡萄糖 20-60g單寧酸 0.01-0.3g應予說明，上述培養基配方只是本發明的CCTCC94034菌株最適宜繁殖的培養基，由於該菌株是一種適應性很強而且生命力旺盛的菌株，所以與上述配方相近似的其他培養基也可用來培養CCTCC94034菌株，然而這也應被認為屬於本發明的範圍。因此，凡是使用CCTCC94034菌株來生產透明質酸鈉的方法，皆應被認為屬於本申請的保護範圍。
由於CCTCC94034菌株在其生長和繁殖的過程中不斷地製造透明質酸(HA)並將其排洩到培養基中，HA與培養基中的氫氧化鈉作用，從而生成了透明質酸鈉。當菌株停止或放緩生長和繁殖時，不再生成HA，於是培養基的pH值不再下降，根據這一點，即可終止發酵。為了獲得透明質酸鈉產品，只要將微生物分離除去，然後再將透明質酸鈉從培養基溶液中沉澱出來並加以收集即可。這些步驟，皆是公知技術，因此，不管採用什麼方法來分離除去微生物和用什麼方法來沉澱透明質酸鈉，只要使用CCTCC94034菌株，即應認為是本發明的範圍。
在分離微生物時，可以先將其殺死，也可以不殺死，只要能將其除去即可。分離的手段有多種多樣，例如硅藻土吸附法、離心法等。沉澱透明質酸鈉的方法也有多種多樣，例如乙醇沉澱法和其他沉澱劑的沉澱法等。
也就是說，本發明提供了一種適宜於通過發酵來生產透明質酸鈉的新菌株，其特徵在於，它是馬疫鏈球菌(Streptococcus equi)的一種突變體，其保藏號為CCTCC94034。
另外，本發明提供了一種通過微生物發酵來生產透明質酸鈉的方法，其特徵在於，使馬疫鏈球菌CCTCC94034在培養基中發酵，在發酵過程中將培養基的pH值維持在6.5-7.5之間，當終止發酵後將微生物細胞與培養基溶液分離，然後再從已除去微生物細胞後的培養基溶液中分離並收集生成的透明質酸鈉。
本發明在上述方法的基礎上，提供了一種進一步限定的方法，其特徵在於，其中，每升所說的培養基溶液含有以下物質蛋白腖 5-15g KH2PO45-15g乙酸鈉 3-10g NaHCO32-5gMgSO4·7H2O 0.1-1.0g FeSO4·7H2O 0.05-0.2gMnCl2·4H2O 0.05-0.2g CaCl20.02-0.2g酵母粉 3-10g 葡萄糖 20-60g單寧酸 0.01-0.3g本發明方法其他進一步限定的特徵為發酵過程的pH值控制在7.2-7.5之間;溫度為32-38℃，最好為37±1℃;發酵時進行攪拌，攪拌速度最好為50-150rpm;在發酵終止後將微生物細胞與培養基溶液分離的方法為硅藻土和/或活性炭吸附法;從已除去微生物細胞後的培養基溶液中分離透明質酸鈉的方法為乙醇沉澱法。
與現有技術的微生物相比，本發明的馬疫鏈球菌CCTCC94034的適應性強，生命力旺盛，並且其透明質酸酶的活力很弱，製造透明質酸的能力強而且制出的透明質酸中的蛋白質含量較低。
與現有技術用微生物發酵來生產透明質酸鈉的方法相比，本發明使用馬疫鏈球菌CCTCC94034，工藝過程簡單，操作容易，成本較低，透明質酸鈉的得率較高(一般達到4.0g/l發酵液，最高時達到8g/l發酵液)，透明質酸鈉產品中的蛋白質含量較低(一般為0.03重量%，最低時達到0.008重量%)，因此更適合作為高級化妝品的原料。
下面舉出實施例來進一步解釋本發明。
實施例1使用馬疫鏈球菌CCTCC94034作為生產透明質酸的微生物，使用液體培養基進行培養，當終止發酵後，分離除去培養基中的微生物，然後從該培養基中沉澱回收透明質酸鈉。整個工藝過程包括如下步驟1、按下列配方分別稱取各種成分蛋白腖 10g KH2PO410g乙酸鈉 5g NaHCO33gMgSO4·7H2O 0.1g FeSO4·7H2O 0.1gMnCl2·4H2O 0.1g CaCl20.05g酵母粉 5g 葡萄糖 40g單寧酸 0.2g2、培養基溶液的配製和處理(1)將葡萄糖40g用蒸餾水溶解，稀釋至150ml，以121℃單獨滅菌15分鐘，備用。
(2)將單寧酸0.2g用蒸餾水溶解，稀釋主40ml，以121℃單獨滅菌15分鐘，備用。
(3)將上述配方中的其他成分混合，用蒸餾水溶解，稀釋至760ml，將其pH值調節至7.2，以121℃滅菌25分鐘，然後將其轉移到安裝在恆溫水浴上的三口玻璃瓶中，將溫度控制在37±1℃，並開動攪拌機，以100rpm的攪拌速度攪拌。
3、接種發酵將50ml馬疫鏈球菌CCTCC94034的預培養液接種到玻璃瓶內的760ml培養液中，同時通入氮氣以保證厭氧條件。接著通過玻璃瓶的側口滴加上述的葡萄糖溶液150ml和單寧酸溶液40ml。這時由於發酵過程的進行以及CCTCC94034菌株不斷產生透明質酸，使PH值開始下降。用40重量%的NaOH溶液將pH控制在7.2-7.5之間。上述的葡萄糖溶液和單寧酸溶液在10小時內滴加完，這時全部溶液的總體積的為1升。繼續發酵20小時，這時培養液的pH值已停止下降，於是終止發酵。
4、透明質酸鈉的提取(1)用1.5M的NaCl溶液將發酵液稀釋至1.5升。
(2)加入45g硅藻土和2g活性炭，攪拌2小時以吸附微生物細胞等雜質和脫除溶液的顏色;
(3)過濾除渣;
(4)將濾液進行離心分離，以進一步除淨雜質;
(5)往離心後的清液中加入1.5倍體積的乙醇以使透明質酸鈉沉澱，過濾，收集沉澱物;
(6)將所獲沉澱用0.15M的NaCl溶液1100ml溶解，然後往其中加入15g硅藻土和1g活性炭，攪拌1小時，然後過濾除渣;
(7)將濾液再進行一次離心分離;
(8)將離心後的清液用精微過濾機過濾滅菌;
(9)將滅過菌的濾液緩緩注入2升乙醇中，靜置8小時，攪拌一次，然後再靜置6小時;
(10)收集沉澱物，用無水乙醇洗滌後進行真空乾燥，結果獲得白色的透明質酸鈉4.6g，此即為成品。由於初始培養基溶液為1l，故透明質酸鈉的得率即為4.6g/l培養液。
對該產品分析的結果，測得其分子量約為4.6×105道爾頓，產品中的蛋白質含量為0.028重量%。
權利要求
1.一種新菌株，其特徵在於，它是馬疫鏈球菌(Streptococcu-s equi)的一種突變體，其保藏號為CCTCC94034。
2.一種通過微生物發酵來生產透明質酸鈉的方法，其特徵在於，使馬疫鏈球菌CCTCC94034在培養基中發酵，在發酵過程中將培養基的pH值維持在6.5-7.5之間，當終止發酵後將微生物細胞與培養基溶液分離，然後再從已除去微生物細胞後的培養基溶液中分離並收集生成的透明質酸鈉。
3.如權利要求2的方法，其特徵在於，在每升所說的培養基溶液中含有以下物質蛋白腖 5-15g KH2PO45-15g乙酸鈉 3-10g NaHCO32-5gMgSO4·7H2O 0.1-1.0g FeSO4·7H2O 0.05-0.2gMnCl2·4H2O 0.05-0.2g CaCl20.02-0.2g酵母粉 3-10g 葡萄糖 20-60g單寧酸 0.01-0.3g
4.如權利要求2或3的方法，其特徵在於，發酵過程的pH值控制在7.2-7.5之間。
5.如權利要求2或3的方法，其特徵在於，發酵過程的溫度控制在32-38℃之間。
6.如權利要求5的方法，其特徵在於，發酵過程的溫度控制在37±1℃。
7.如權利要求2或3的方法，其特徵在於，發酵過程的攪拌速度為50-150rpm。
8.如權利要求2或3的方法，其特徵在於，將微生物細胞與培養基溶液分離的方法為硅藻土和/或活性炭吸附法。
9.如權利要求2或3的方法，其特徵在於，從已除去微生物細胞後的培養基溶液中分離透明質酸鈉的方法為乙酸沉澱法。
全文摘要
通過馬疫鏈球菌CCTCC94034在液態培養基中的發酵作用來生產透明質酸鈉，當終止發酵後用硅藻土和/或活性炭吸除來除去培養液中的微生物細胞，然後用乙醇沉澱法來分離並收集培養液中的透明質酸鈉，將其真空乾燥後獲得成品。透明質酸鈉的得率在4g/l以上，分子量約為4.5×10
文檔編號C12N1/20GK1102435SQ9411488
公開日1995年5月10日 申請日期1994年8月17日 優先權日1994年8月17日
發明者黃日波, 馬慶生, 陳冠成, 韋永振 申請人:桂平縣生物技術開發公司