與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記及其應用的製作方法
2023-05-13 23:44:16 2
專利名稱：與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於農業生物技術領域，具體地涉及與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記及其應用。
背景技術：
氮素是水稻生長中最重要的營養。半個世紀以來，隨著矮稈耐肥高效品種的培育 與推廣，世界各國都把增施氮肥作為增加水稻產量的重要農業措施。然而，儘管近年來化 肥用量年年增長、在生產成本中的比重逐年增加，糧食產量卻一直徘徊不前。從1984年到 1993年，我國化肥用量增加了 81 %，而糧食總產只增加了 14. 6%。而且，高氮引起的環境汙 染問題日趨嚴重。據統計，我國氮肥的平均利用率只有35%，養分損失不僅嚴重浪費了有限 的養分資源，由於其向水體和大氣的排放，也帶來了令人擔憂的環境問題。有的地下飲用水 中NO3-含量超過上限50mg/L，NO3-汙染會引起許多疾病，如高鐵血蛋白缺氧症、胃癌和幼兒 畸形等。水稻是全球半數人口的主食，我國是水稻生產大國，全國水稻年播種面積達4. 8 億畝，約佔糧食作物總面積的26. 6%左右。由於水稻與其他作物不同，需水量大，施肥次數 多，擱田或雨量大引起的N03_流失多，水稻生產成為目前最大的汙染源之一。這一現象在歐 洲早已引起極大關注，德國巴登符騰堡州1989年就把旱作施肥列為地下水硝酸鹽汙染的 重要來源，通過專門法律條款限制水資源保護區的旱作種植及氮肥施用量。因此，探討有限 氮素供應條件下作物高產高效的新途徑不僅是實現我國兩高一優農業生產目標所必需的， 而且也是保護環境、造福子孫後代的重要問題。水稻育種實踐證明，利用氮素營養調控基因培育新品種將是提高氮素利用效率和 作物產量以及減少環境汙染最為經濟有效的方法。隨著分子生物學的發展，使難以鑑定、易 受環境影響的農藝性狀採用分子輔助育種已成為可能，該技術可在早代進行準確、穩定的 選擇，從而加速育種進程，提高育種效率，但該技術的基礎是必須擁有優良的目標基因及與 之緊密連鎖的分子標記。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的上述缺陷，用分子生物學方法以氮高效水稻品 種為材料，篩選和尋找新的、而且穩定存在的與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記，用 於水稻輔助選擇育種及新品種鑑定，同時，根據所得分子標記也有助於水稻氮營養調控基 因的克隆。本發明所述的氮營養調控基因即氮高效基因。實現上述目的的技術方案如下與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記，所述的分子標記為位於水稻第2染色 體上的SSR分子標記RM5897，其核苷酸序列如下上遊引物5，-GGCATCTTCCCCTCTCTCTC-3，
下遊引物5，-CCAACCCAAACCAGTCTACC-3，。與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記，所述的分子標記為位於水稻第2染色 體上的STS分子標記AP5756，其核苷酸序列如下
上遊引物5，-CTATTGGTGGTTAGGGCTGAT-3，下遊引物5，-AGTTGATTTAGATGTGTTTTA-3 『。上述與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記RM5897和AP5756，是使用下述方 法得到的(1)氮高效基因供體親本來自中國水稻研究所的秈稻品種窄葉青8號(ZYQ8)，與 普通粳稻品種京系17(JX17)進行雜交，利用F 1代花葯培養獲得加倍單倍體(DH)群體，從 中獲得氮高效株系DH78，通過DH78與JX17回交和自交，進行配組和基因定位，統計分離群 體單株標記帶的出現頻率和交換類型並計算交換值，用Mapmaker EXP3. Ob計算標記與氮營 養調控基因之間的遺傳距離。(2)用CTAB法提取水稻親本幼苗及雜交後代幼苗基因組DNA。(3)採用SSR和STS分子標記方法進行水稻氮營養調控基因分子標記的篩選。(4)篩選出一個SSR分子標記RM5897和一個STS分子標記AP5756，經連鎖分析， 發現這兩個標記與水稻氮營養調控基因相連鎖，分別位於水稻氮營養調控基因的兩側。採用SSR和STS分子標記進行篩選與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記的方 法是(1) SSR、STS引物在親本以及他們的雜交後代間DNA多態性分析用SSR標記技術篩選，採用根據Temnykh在2000年發表的分布於水稻12條染色 體上的SSR引物，引物由上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR儀上進行PCR擴增，PCR反 應體系為20ng/ul 水稻基因組 DNA lul, 10XPCR Buffer 2. 0ul,25mM MgCl2 2. 0ul,2mM dNTP 2. Oul，IOuM 引物 2. 0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0. 3ul，ddH20 10. 7ul，總體系 20ul。 反應程序94°C預變性4分鐘；94°C變性1分鐘，55°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，40個循 環；72°C補齊10分鐘；產物檢測在含有0. 5ug/ul EB的5. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈 下觀察並拍照記錄結果。用STS標記技術篩選，首先對基因組已完成測序的粳稻日本晴(http://rgp. dna. affrc. go. jp)禾口辛山稻 93-11 (http://www. rise, genomics, org. cn)的序列進 亍序列比對， 根據日本晴和93-11序列比對的結果設計合適的引物用於ZYQ8和JX17的多態性篩選，弓丨 物由上海申能博彩公司合成，在PTC-225 PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20ng/ul 水稻基因組 DNA lul, 10XPCR Buffer 2. 0ul,25mM MgCl2 2. 0ul,2mM dNTP 2. Oul，IOuM 弓| 物 2. 0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0. 3ul，ddH20 10. 7ul，總體系 20ul。反應程序94°C預變 性4分鐘；94°C變性1分鐘，52°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，40個循環；72°C補齊10分 鍾；產物檢測在含有0. 5ug/ul EB的5. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察並拍照記錄 結果。(2)分子標記的連鎖分析分別提取分離群體單株的總DNA，用與前面同樣的反應體系、篩選獲得的多態性引 物及程序進行單株的PCR擴增，統計單株標記帶的出現頻率和交換類型並計算交換值，用 MapnakerEXP3. Ob計算標記與水稻氮營養調控基因之間的遺傳距離。
探討有限氮素供應條件下作物高產高效的新途徑不僅是實現我國兩高一優農業 生產目標所必需的，也是保護環境、造福子孫後代的重要問題。本發明是利用分子標記方法 得到兩個新的與氮營養調控基因緊密連鎖的分子標記。利用這種方法，不僅克服了常規育 種方法所需時間周期長等缺點，還可以有目的地將調控基因在實驗室內選擇獲得並有目的 地進行多個基因的聚合，從而培育出具有穩定性狀的水稻新品種。同時，也可利用這兩個氮 營養調控基因分子標記，深入進行氮營養調控基因的克隆並對其進行結構和功能分析，這 對於進一步了解水稻氮營養調控的分子遺傳學機制有積極的意義。因此，本研究結果在水 稻育種實踐及氮素營養調控的理論研究上都有重要意義。其優點具體歸納如下(1)本發明與氮營養調控基因緊密連鎖的分子標記，是在對水稻氮高效株系及其 雜交後代單株中獲得的新標記，可用於水稻氮營養調控新品種的鑑定和輔助選擇育種。(2)本研究所用的材料具有很高的氮素利用和調控能力，因此，根據所得的分子標 記有望克隆到新的氮營養調控基因。(3)為克隆水稻氮營養調控基因、基因序列分析以及轉氮營養調控基因水稻研究 奠定了良好基礎。下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
圖1為兩個水稻品種及其後代基因組DNA的SSR分子標記RM5897篩選電泳譜帶 圖；圖2為兩個水稻品種及其後代基因組DNA的STS分子標記AP5756篩選電泳譜帶 圖；圖3為檢測分子標記RM5897與氮營養調控基因連鎖的電泳譜帶圖(部分圖)；圖4為檢測分子標記AP5756與氮營養調控基因連鎖的電泳譜帶圖(部分圖)；圖5為SSR分子標記RM5897和STS分子標記AP5756與氮營養調控基因NI間的 遺傳距離圖。圖1-5中符號分別表示1-DH78 ；2-JX17 ；3-DH78/JX17 的 F1 植株；F2_DH78 和 JX17 雜交後代的單株(通過 雜交、回交的自交得到)。
具體實施例方式實施例1 用SSR分子標記獲得與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記RM5897植物材料氮高效基因供體親本來自中國水稻研究所的秈稻品種窄葉青8號(ZYQ8)，與普通粳稻品種京系17 (JX17)進行雜交，利用F1代花葯培養獲得加倍單倍體(DH) 群體，從中獲得氮高效株系DH78，通過DH78與JX17雜交、回交和自交，進行配組和基因定 位，從該群體後代中鑑定得到87株與DH78表型相似的個體用於連鎖關係分析。(一)、提取DNA首先配製DNA提取緩衝液，按順序依次加1體積的DNA提取溶液(0. 35M sorbitol ；0. IM Tris, ρΗ8· 2 ；0. 005Μ EDTA)，1 體積的核裂解液(0. 2Μ Tris, ρΗ7· 5 ；0. 05ΜEDTA ；2M NaCl ；0. 055M CTAB)和0. 4體積的5% sarkosyl,加入亞硫酸氫鈉，終濃度為0. 02M。稱取0. Ig的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然後加入700 μ 1的DNA提取緩衝液，65°C 水浴40分鐘。加700 μ 1的氯仿異戊醇(24 1)，並混勻。IOOOOrpm離心5分鐘，將上清 液轉移到新的離心管中。加2/3至1倍體積預冷的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉澱。13000rpm 離心8分鐘，倒出上清液，用70%的己醇洗滌DNA沉澱。將DNA涼幹並溶於100 μ 1 TE或 雙純水中。紫外分光光度法檢測DNA樣品的濃度，0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整 性。(二)、SSR 分析根據Temnykh在2000年發表的分布於水稻12條染色體上的SSR引物序列，由上 海申能博彩公司合成引物100對。1.PCR 擴增(1)反應體系為水稻基因組DNA 20ng/ul Iul，10XPCR Buffer 2. 0ul,25mM MgCl2 2. 0ul,2mM dNTP 2. Oul，IOuM 引物 2. 0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0. 3ul，ddH2010. 7ul，總體系 20ul。(2)反應程序94°C預變性4分鐘；94°C變性1分鐘，55 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，40個循 環；72°C補齊10分鐘。2.電泳檢測取擴增產物20ul，用5. 0%的瓊脂糖凝膠(含有0. 5ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀
察並拍照記錄結果。我們利用100對SSR引物對DH78和JX17進行多態性分析，其中有61對引物在雙 親間表現出多態性。進一步用這61對引物對DH78、JX17和其雜交、回交後代單株進行SSR 分析，發現SSR引物RM5897在所有的雜交後代單株中均出現氮高效親本DH78 —樣的帶型 (如圖1所示)。說明SSR引物RM5897與水稻氮營養調控基因存在聯繫。RM5897 引物序列為上遊引物 5，-GGC ATC TTC CCC TCT CTC TC-3，，下遊引物 5，-CCA ACC CAA ACC AGT CTA CC-3，，定位於水稻第2染色體上。(三)、SSR分子標記RM5897的連鎖性鑑定分別提取分離群體單株的總DNA，用與前面同樣的反應體系、篩選獲得的多態性引 物及程序進行單株的PCR擴增，統計單株標記帶的出現頻率和交換類型並計算交換值，用 MapnakerEXP3. Ob計算標記與水稻氮營養調控基因之間的遺傳距離。以RM5897對雜交後代 群體87個與DH78表型相似的單株進行PCR擴增。結果顯示，87個單株中有84單株的帶型 與氮高效親本DH78 —樣，有3株的帶型同時帶有雙親的帶型，沒發現與親本JX17帶型一樣 的單株。這一實驗結果表明SSR分子標記RM5897與水稻氮營養調控基因是緊密連鎖的， 但在分離群體單株中仍有一定的交換，如圖3所示，出現雙親帶型的單株表明發生了交換。 經計算，其重組率為1. 7%，SSR分子標記與氮營養調控基因間的遺傳距離為1. 7cM(如圖5 所示)。實施例2 用STS分子標記獲得與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記AP5756
植物材料同實施例1，具體做法如下(一)、提取DNA首先配製DNA提取緩衝液，按順序依次加1體積的DNA提取溶液(0. 35M sorbitol ；0. IM Tris, ρΗ8· 2 ；0. 005Μ EDTA)，1 體積的核裂解液(0. 2Μ Tris, ρΗ7· 5 ；0. 05Μ EDTA ；2Μ NaCl ；0. 055Μ CTAB)和0. 4體積的5 % sarkosyl,加入亞硫酸氫鈉，終濃度為 0. 02M。稱取0. Ig的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然後加入700 μ 1的DNA提取緩衝液，65°C 水浴40分鐘。加700 μ 1的氯仿異戊醇(24 1)，並混勻。IOOOOrpm離心5分鐘，將上清 液轉移到新的離心管中。加2/3至1倍體積預冷的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉澱。13000rpm 離心8分鐘，倒出上清液，用70%的己醇洗滌DNA沉澱。將DNA涼幹並溶於100 μ ITE或純 水中。紫外分光光度法檢測DNA樣品的濃度，0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。(二)、STS 分析:STS引物設計根據日本晴和93-11序列比對的結果設計合適的引物用於雙親的多 態性篩選，由上海申能博彩公司合成設計的STS引物5對。1.PCR 擴增(1)反應體系為水稻基因組DNA 20ng/ul Iul，10XPCR Buffer 2. 0ul,25mM MgCl2 2. 0ul,2mM dNTP 2. Oul，IOuM 引物 2. 0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0. 3ul，ddH2010. 7ul，總體系 20ul。(2)反應程序94°C預變性4分鐘；94°C變性1分鐘，55 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，40個循 環；72°C補齊10分鐘。2.電泳檢測取擴增產物20ul，用5. 0%的瓊脂糖凝膠(含有0. 5ug/ul EB)電泳，紫外燈下觀
察並拍照記錄結果。我們利用5對STS引物對DH78和JX17進行多態性分析，其中有1對引物在雙親 間表現出多態性。進一步用這對引物對DH78、JX17和其雜交後代單株進行STS分析，發現 STS引物AP5756在所有的雜交後代單株中均帶有親本DH78—樣的帶型(如圖2所示)。說 明STS引物AP5756與水稻氮營養調控基因存在聯繫。AP5756 引物序列為上遊引物 5，-CTA TTG GTG GTT AGG GCT GAT-3，，下遊引物 5，-AGT TGA TTT AGA TGT GTT TTA-3，，定位於水稻第2染色體上。(三)、STS分子標記AP5756的連鎖性鑑定分別提取分離群體單株的總DNA，用與前面同樣的反應體系、篩選獲得的多態性引物及程序進行單株的PCR擴增，統計單株標記帶的出現頻率和交換類型並計算交換值，用 MapnakerEXP3. Ob計算標記與水稻氮營養調控基因之間的遺傳距離。以AP5756對雜交後代 群體87個與DH78表型相似的單株進行PCR擴增。結果顯示，87個單株中有81單株的帶型 與氮高效親本DH78 —樣，有6株的帶型同時帶有雙親的帶型，沒發現與親本JX17帶型一樣 的單株。這一實驗結果表明SSR分子標記AP5756與水稻氮營養調控基因是緊密連鎖的， 但在分離群體單株中仍有一定的交換，如圖4所示，出現雙親帶型的單株表明發生了交換。 經計算，其重組率為3. 4%，SSR分子標記與氮營養調控基因間的遺傳距離為3. 4cM(如圖5 所示)。
經上述實施例1、2所獲的分子標記可以用於水稻氮營養調控新品種的鑑定及氮高效水稻的輔助選擇育種，同時為克隆氮營養調控基因奠定基礎，另外，本發明對選育環保 類型水稻新品種、提高肥料利用率和保護環境都具有一定的實踐意義。序列表中國水稻研究所與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記及其應用4120DNA人工序列1ggcatcttcc cctctctctc220DNA人工序列2ccaacccaaa ccagtctacc321DNA人工序列3ctattggtgg ttagggctga t421DNA人工序列4agttgattta gatgtgtttt a
權利要求
與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記，其特徵在於，所述的分子標記為位於水稻第2染色體上的SSR分子標記RM5897，其核苷酸序列如下上遊引物5』-GGCATCTTCCCCTCTCTCTC-3』下遊引物5』-CCAACCCAAACCAGTCTACC-3』。
2.與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記，其特徵在於，所述的分子標記為位於水 稻第2染色體上的STS分子標記AP5756，其核苷酸序列如下上遊引物 5』 -CTATTGGTGGTTAGGGCTGAT-3， 下遊引物 5，-AGTTGATTTAGATGTGTTTTA-3』。
3.根據權利要求1或2所述的與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記在水稻氮營養 調控新品種的鑑定及輔助選擇育種中的應用。
全文摘要
本發明屬於農業生物技術領域，公開了與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記，所述的分子標記分別為位於水稻第2染色體上的SSR分子標記RM5897和STS分子標記AP5756。本發明的與水稻氮營養調控基因相連鎖的分子標記可用於水稻氮營養調控新品種的鑑定及氮高效水稻的輔助選擇育種，通過分子標記輔助選擇育種可克服常規方法工作量大、難度高、易受環境影響、育種周期長等缺點；同時為克隆氮營養調控基因奠定基礎，另外，本發明對選育環保類型水稻新品種、提高肥料利用率和保護環境都具有一定的實踐意義。
文檔編號C12N15/11GK101805731SQ20101015411
公開日2010年8月18日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者姜華, 曾大力, 郭龍彪, 錢前, 馬麗蓮, 高振宇 申請人:中國水稻研究所