洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯ｙ病毒通用檢測引物和探針的製作方法
2023-05-13 22:14:21
洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯ｙ病毒通用檢測引物和探針的製作方法
【專利摘要】本發明屬於一種基於DNA體外擴增技術的植物病毒分子生物學檢測方法領域，涉及針對洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Ｙ病毒的檢驗檢疫和分子生物學研究。本發明利用洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Ｙ病毒基因結構的相似性，以其共有的CI蛋白序列為序列源，篩選出對兩種目標病毒基因序列都具有高度互補性的引物和探針序列。本發明的目的就是提供一種通用引物和探針序列，能夠對洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Ｙ病毒同時進行檢測，以取代多重PCR的複雜操作。
【專利說明】洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒通用檢測引物和探針
【技術領域】
[0001]本發明屬於一種基於DNA體外擴增技術的植物病毒分子生物學檢測方法，涉及針對馬鈴薯Y病毒屬內的洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒的檢驗檢疫和分子生物學研究領域。
【背景技術】
[0002]DNA體外擴增技術又被稱為聚合酶鏈式反應，簡稱PCR (polymerase chainreact1n)，羅氏公式擁有相關專利(見美國專利4，683，195,4, 683, 202,4, 965, 188)。目前，PCR技術在分子生物學研究和檢測【技術領域】的應用非常普遍，相關技術資料可以參考分子克隆 _ 實驗手冊(Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, NewYork)等文獻。
[0003]洛奏皺紋花葉病毒rugose mosaic virus, BaRMV)屬於馬鈴暮Y病毒屬(Potyvirus),已證實的宿主包括:洛葵(Basella Rubra),蝴蝶蘭(Phalaenopsis)等。洛葵皺紋花葉病毒感染會導致植株產生皺縮花葉，是引起受感染植株退化的主要病毒之一。
[0004]馬鈴薯Y病毒Wa1 Virus V, PVY)與洛葵皺紋花葉病毒同屬於馬鈴薯Y病毒屬，其寄主範圍包括茄 科及一些莧科、藜科、菊科和豆科植物，通過機械接種可感染120種植物。馬鈴薯Y病毒在湘南煙區的感染及其嚴重，特別是對於前作種植馬鈴薯或相鄰煙田種植馬鈴薯的，常常導致菸草發生馬鈴薯Y病毒嚴重感染。
[0005]洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒均可通過蚜蟲傳播，也可以通過機械接種、嫁接、組織切片等方式傳播。與其它馬鈴薯Y病毒屬成員一樣，馬鈴薯Y病毒和洛葵皺紋花葉病毒存在於感病寄主植物的各個部分，在寄主植物細胞中產生一種由71.4kDa的Cl蛋白圓構成的柱狀內含體，在細胞質中分散或成束分布並引發不同程度的植物病徵。
[0006]洛葵皺紋花葉病毒為單分體基因組病毒，病毒基因組的5』末端共價結合一個小分子Vpg蛋白。洛葵皺紋花葉病毒的基因組長9.8kb，編碼的多聚蛋白切割產生10個蛋白，按照排列順序依次為:32.4kDa的Pl蛋白(功能未知)，51.9kDa的HC-Pro蛋白(即輔助成分，與蚜蟲傳播有關)，41.5kDa的P3蛋白(功能未知)，6.0kDa的6K1蛋白(功能未知)，71.4kDa的Cl蛋白(即柱狀內含體蛋白，可能與病毒的胞間運動有關)，5.5kDa的6K2蛋白(功能未知)，21.7kDa的NIa-VPg蛋白(即VPg蛋白)，27.7kDa的NIa-Pro蛋白(核內含體蛋白酶)，59.8kDa的NIb蛋以及29.8kDa的外殼蛋白(Coat Protein)。馬鈴薯Y病毒的基因結構與洛葵皺紋花葉病毒的非常相似。
[0007]國內目前對馬鈴薯Y病毒和洛葵皺紋花葉病毒的檢測主要以血清學方法和分子生物檢測法為主。血清學方法包括免疫電鏡法(Immuno-specific electron microscopy,ISEM)、免疫擴散法(SDS-1mmunodiffus1n test)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫斑點試驗(immunoblotting test)、膠體金標記層析技術(Gold immunochromatography assay,GI CA)等；分子生物檢測法包括斑點雜交法(Dot Hybridizat1n)、印痕雜交法(SouthernBlot或Northern Blot)、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等。上述方法中，基於對檢測靈敏度和快速簡單的要求，以RT-PCR最為適用並且在實際工作中應用最廣。RT-PCR法具有極高的檢測靈敏度，非常適合於樣本的快速檢測要求。目前常用於對名貴花卉品種的檢查。
【發明內容】
[0008]發明目的:由於RT-PCR引物序列的高度專一性，通常情況下，對於同一樣本的不同病毒檢測需要進行多次RT-PCR擴增反應，或使用多重PCR技術，這樣既增加了實驗的複雜程度，有提高了檢測成本，從而限制了它的應用範圍。本發明的目的就是提供一種通用引物和探針序列，能夠對洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒同時進行檢測，以取代多重PCR的複雜操作。
[0009]本發明的原理如下:本發明利用洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒基因結構的相似性，以其共有的Cl蛋白序列為序列源，通過比對找出具有高度相似度的片段區間，通過序列分析排除二級結構和非特異性序列區間，最終篩選出所需要的引物和探針序列。其中洛奏皺紋花葉病毒基因序列來自 Basella rugose mosaic virus, complete genome (NCBIReference Sequence: NC_009741.1 )，馬鈴薯 Y病毒基因序列來自 Potato virus Y genomicRNA, complete genome, isolate T13 (GenBank: AB714135.1)。
[0010]本發明所涉及引物及探針的核苷酸序列如下(自左至右按5』到3』方向排列):上遊引物:GF-1:GTff GGR TCff GGA MR TC ;下遊引物:GD_1:CYRST GGff GTK GCT GAff ACC T ;探針:GP-1:GCC AAC MYT GCG CAT GCG AGG,對病毒RNA進行逆轉錄PCR擴增前，如果後續將用雜交方式進行檢測，則需在引物GF-1和⑶-1的5』端標記上生物素(b1tin)、鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0011]用本發明引物對擴增洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒進行檢測時須進行的病毒RNA樣品製備方法可見有關文獻。檢測洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒RT-PCR擴增產物的方法包括:(1)用瓊脂糖凝膠電泳法分析擴增產物；(2)用與互補寡核苷酸探針雜交來進行檢測，包括DNA微陣列、斑點印跡法和反向斑點印跡法。上述所用的具體實驗方法均不屬於本發明申請內容。
【具體實施方式】
[0012]具體實施例一
病毒RNA逆轉錄反應(10 μ L的反應體系可用於逆轉錄1.0 ng~2.5 μ g總RNA): (I)將以下組分加入無核酸酶的微量離心管中:引物GF-1和⑶-1各I pmole，帶洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒樣品總RNA I μ g，1mM dNTP混合物(dATP，dGTP，dCTP和dTTP均為1mM, pH 7.0) 0.5 μ 1，加入滅菌蒸餾水至6 μ L ; (2)混合物在65°C加熱5分鐘後，迅速置於冰上冷卻，短暫離心後，加入以下組分:5X第一鏈合成緩衝液2 μ L，0.1MDTT lyL,40單位/μ L RNasin 0.5 μ L，在離心管中輕輕將各種成分充分混合，並在37°C下孵育2分鐘；
(3)在室溫下加入0.5μ L (200單位/ μ L)逆轉錄酶，輕輕地吹打混勻，在37°C孵育50分鐘。[0013]具體實施例二
病毒RNA逆轉產物的PCR擴增:
(1)在0.2mL PCR反應管中加入下列成分至終體積50 μ L:10 μ L cDNA, 5 μ L 10 XPCR緩衝液，1.5 μ L 50mM MgCl2,1 μ L 1mM dNTP混合物，上遊引物GF-1 (10 μ Μ)和下遊引物GD-1(10 μ Μ)各I μ L，Taq DNA聚合酶(5U/μ L) 0.5 μ 1，加滅菌蒸餾水至總體積50μ L ；(2)PCR反應條件:
94°C,2min
94。。，25s \
60°C, 25s 30 個循環 72°C,40s /
72°C,5min0
[0014]具體實施例三
探針在雜交膜上的固定:(I)將探針GP-1溶於二甲基亞碸，探針終濃度為10~20 μ M ;
(2)把探針溶液點在雜交膜正表面；(3)把點有探針的雜交膜放入紫外交聯設備中照射3~5min進行探針固定；(4)把雜交膜浸入蒸餾水洗滌，然後放入50°C烘箱乾燥1min備用。
[0015]具體實施例四 雜交顯色反應:(1)操作前先將雜交緩衝液(20!1111^8-!1(:1，5011111((:1，pH8.4)預熱到
室溫，將雜交儀預熱到42°C; (2)用PCR儀將PCR反應產物加熱至99°C、7min然後快速冷卻至4°C、3min，使DNA解鏈，然後置於冰上暫時存放；(3)取10 μ L經過解鏈處理的PCR反應產物與100 μ L經過預熱的雜交緩衝液充分混合，將混合液加到固定了探針的雜交膜表面，用雜交盒密封后置於雜交儀於45°C雜交2hr，用去離子水充分洗滌；(4)將雜交膜浸入含1%BSA的磷酸緩衝液(pH 8.0)，於37°C反應30分鐘，用去離子水充分洗滌；(5)加入100 μ L鏈黴親和素-鹼性磷酸酶複合物(終濃度=1 μ g/mL)，於37V反應30分鐘，使鏈黴親和素-鹼性磷酸酶複合物與結合在PCR產物5』端上的生物素相結合，用去離子水充分洗滌；(6)取100XNBT 100 μ L加入至Ij 1mL AP反應緩衝夜中，混勻後，再加入100XBCIP 100 μ 1，混勻，即配成反應工作液，加入混合NBT/BCIP的顯色反應液顯色(一般約20~30min)，完成顯色後用去離子水洗滌後甩幹。
【權利要求】
1.本發明涉及針對馬鈴薯Y病毒屬內的洛葵皺紋花葉病毒與馬鈴薯Y病毒的檢驗檢疫和分子生物學研究方法，其特徵在於:所進行的檢測或研究涉及以下引物及探針核苷酸序列(自左至右按5，到3，方向排列):上遊引物GF-1 =GTff GGR TCff GGA AAR TC ;下遊引物⑶-1:CYRST GGff GTK GCT GAff ACC T ;探針 GP-1:GCC AAC MYT GCG CAT GCG AGG。
2.根據權利要求1所述的引物和探針，其特徵在於:在引物GF-1和GD-1的5』端標記上生物素、鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK104032039SQ201410316427
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年7月4日 優先權日:2014年7月4日
【發明者】王利兵, 朱金國, 吳志鵬 申請人:王利兵, 吳志鵬