一種新型血管化組織工程骨及其構建方法
2023-05-13 18:27:36
一種新型血管化組織工程骨及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型血管化組織工程骨，包括圓柱體支架材料、兩個內部軸向預製的圓形隧道、動靜脈血管蒂；所述圓柱體支架材料為醫用可吸收材料，所述兩個內部軸向預製的圓形隧道互相平行，在出口處設有出口孔圓形倒角，在圓形隧道內部均勻分布人或動物成骨誘導幹細胞；所述動靜脈血管蒂包括受體血管蒂上的動脈、靜脈及動脈、靜脈移植物，動靜脈血管蒂在支架材料內並行分開排列，遠端血管吻合或結紮。本發明可以實現對組織工程骨的快速充分、安全有效的移植後血管化，有效提高臨床療效，為移植細胞提供良好的營養供應及新陳代謝環境，促進組織工程骨移植後的成骨活性，促進組織工程骨移植物的廣泛臨床應用。
【專利說明】一種新型血管化組織工程骨及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織工程領域，特別涉及一種新型血管化組織工程骨及其構建方法。【背景技術】
[0002]組織工程學(Tissue Engineering)概念最早由Langer和Vacanti提出，是根據細胞生物學和工程學的原理，將具有特定生物學活性的組織細胞與生物材料相結合，在體外或體內構建組織和器官，以維持、修復、再生或改善損傷組織和器官功能的一門科學。在骨組織工程領域，組織工程骨治療大段骨缺損逐漸顯示出誘人的前景，但同時也面臨著一些新的問題。
[0003]活體中絕大多數組織細胞由血液供應氧氣和養料，受組織中氧氣擴散作用的限制，毛細血管的氧氣供應範圍只限於鄰近100~200 μ m區域。對於組織工程複合物來說，雖然在體外可以通過灌注反應器等方法來加強氧氣和養料的供應，一旦植入體內，支架內的種子細胞在早期仍然只能通過臨近毛細血管的擴散效應來攝取賴以生存的氧氣和養料，嚴重影響了組織工程複合物的活性與功能。由於骨組織代謝非常旺盛，組織工程骨在體內對周圍血液供應的要求更高，而臨床對大塊組織工程骨的需要也在逐漸增加，為了保證較大尺寸的組織工程骨植入體內後能夠成活並發揮有效成骨修復作用，有必要在其構建過程中採取血管化策略。
[0004]目前常用的組織工程骨血管化構建方法包括優化支架材料的設計、使用生長因子、聯合使用內皮祖細胞及藉助外科學血管預置技術等，近些年來血管預置技術已被逐漸應用於構建血管化的組織工程骨。血管預置技術是在組織工程骨複合物的基礎上，在植入體內的過程中，藉助於帶血供的筋膜、血管束或者血管環等，預先構建好機體和組織工程骨之間的血供連接，以期儘快建立起受區與組織工程複合物的血液供應，促使組織工程複合物最大程度的成活並發揮修復作用。其中較受關注的有血管束預置技術(Vascularbundle)及動靜脈血管環路預置技術(AV Loop)等。血管束預置技術基於骨組織骨髓腔內軸向血供原理，使用遠端結紮的血管束穿過組織工程骨中央部孔洞或凹槽，其血管長入和營養方式為從中央到外周，Lei Cai採用比格犬BMSC接種HA支架，藉助預置血管束的血管化方法修複比格犬腓骨骨缺損，Wang將BMSC接種TCP支架，並預置兔的隱動靜脈束，構建出血管化組織工程骨並修復兔股骨骨缺損，但由於以上傳統的血管束預製技術均採用動靜脈一體的血管束放置於大尺寸組織工程骨支架單獨的孔洞或凹槽內進行預血管化，血管化面積有限，血管化速度慢，對組織工程骨成骨的促進效果不夠理想；而動靜脈血管環路預置技術(AV Loop)則是針對這些問題對血管束技術的進一步改進，受Erol和Spira利用動靜脈環路構建出大鼠帶軸向血管皮瓣模型的啟發，Kneser首次將動靜脈環路包繞組織工程骨構建血管化組織工程骨，很快這一技術已在小動物體內廣泛應用，Beier JP等人則在大動物如山羊模型 中應用隱動靜脈血管環路包繞組織工程骨構建血管化組織工程骨。動靜脈血管環路技術其血管長入和營養方式為從外周到中央，具有血流速度快，促血管生成作用強等優點，但該法僅將血管環路環繞在組織工程骨外面，對血管蒂長度要求高，對支架中央部分血運供應有限，且轉移過程中不易操作，易損傷血管，難以投入實際應用。因此，如何提高血管束技術的成血管面積，避免血管環路技術的諸多應用限制，保證移植物整體快速、充分安全的血管化，成為目前血管化組織工程骨臨床應用亟需解決的問題。
【發明內容】
[0005]針對上述現有技術存在的缺陷或不足，本發明的目的在於構建一種新型血管化組織工程骨，將動靜脈血管蒂分別放置在其內相對獨立的隧道內，進行血管遠端結紮或吻合的血管預製，其血管長入和營養方式介於外周及中央之間，可以實現對組織工程骨的快速充分、安全有效的移植後血管化，有效提高臨床療效，為移植細胞提供良好的營養供應及新陳代謝環境，促進組織工程骨移植後的成骨活性，促進組織工程骨移植物的廣泛臨床應用。
[0006]本發明的一種新型血管化組織工程骨，包括圓柱體支架材料、兩個內部軸向預製的圓形隧道、動靜脈血管蒂；所述圓柱體支架材料為醫用可吸收材料，所述兩個內部軸向預製的圓形隧道互相平行，在出口處設有出口孔圓形倒角，在圓形隧道內部均勻分布人或動物成骨誘導幹細胞；所述動靜脈血管蒂包括受體血管蒂上的動脈、靜脈及動脈、靜脈移植物，動靜脈血管蒂在支架材料內並行分開排列，遠端血管吻合或結紮。
[0007]所述人或動物成骨誘導幹細胞的密度為2X IO7個/ml，接種時間為4小時。
[0008]所述圓柱體支架材料直徑為12mm,高為IOmm,選用的材料為β _磷酸三鈣(β-TCP)。
[0009]所述圓形隧道的主隧道直徑為3mm，軸向圓形隧道兩端設長2mm直徑5mm的出口孔圓形倒角。
[0010]所述動靜脈血管蒂為哺乳類動物受體知名動靜脈，血管直徑在Imm以上。
[0011]本發明的一種新型血管化組織工程骨的構建方法，包括以下步驟:
[0012]1)體外製備支架材料:將醫用可吸收材料製備成圓柱體，在圓柱體內部軸向預製兩個圓形隧道，兩端出口孔圓形倒角；
[0013]2)組織工程骨的體外構建:將體外擴增的人或動物成骨誘導幹細胞接種在製備好的支架材料上，在體外靜態或動態培養，得到組織工程化骨組織；
[0014]3)血管環路或血管束的準備:暴露人或動物隱動靜脈束，切開血管束膜，分離隱動靜脈，遠端結紮；
[0015]4)血管環路或血管束的嵌入:將分離好的隱動靜脈分別導入預製好的圓形隧道內，遠端顯微外科血管吻合形成動脈環或簡單結紮形成血管束。
[0016]本發明的新型血管化組織工程骨由於在組織工程骨支架內設計了兩個內部軸向預製的圓形隧道供動靜脈血管蒂內置，具有如下有益效果:1、由於血管在支架材料的孔洞內走行，避免了血管蒂在轉移過程中受損，同時減小了對受區血管蒂長度的要求，更具有臨床可行性；2、由於動脈和靜脈被分別放置在組織工程骨支架上獨立的孔洞內，之間有一定距離，增加了血管蒂的供血營養面積，有利於新生血管的均勻分布及促進整體成骨；3、由於支架的圓形隧道介於支架中心及支架外周之間，其血管長入和營養方式亦介於外周及中央之間，可以實現對組織工程骨的快速充分、安全有效的移植後血管化，有效提高臨床療效，為移植細胞提供良好的營養供應及新陳代謝環境，促進組織工程骨移植後的成骨活性。【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明:
[0018]圖1是本發明一種新型血管化組織工程骨為預置血管環路時的三維結構示意圖；
[0019]圖2是本發明一種新型血管化組織工程骨為預置血管束時的三維結構示意圖。
[0020]圖中1、圓柱體支架；2、軸向預製的圓形隧道；3、出口孔圓形倒角；4、動靜脈血管蒂。
【具體實施方式】
[0021]實施例1:組織工程骨預置血管環路血管化方法
[0022]見圖1，取商品化的β-TCP支架，製備成底面直徑為12mm高為IOmm的圓柱形狀，在支架內部小心打出兩個直徑為3_的軸向中空通道，兩端出口孔圓形倒角，無菌消毒處理後BMSCs接種並體外培養誘導2周。分離比格犬隱動靜脈約4cm，在遠端分別結紮隱動靜脈。BMSCs/β -TCP複合物植入前12小時更換為無血清的培養基，以減少殘留的胎牛蛋白作為抗原植入後對受體造成的影響。放置BMSCs/ β -TCP細胞支架複合物於原來隱動靜脈血管床處，並預留兩根縫合線穿過細胞支架複合物的隧道，以便於術後的固定。利用未剪去的結紮線作為牽引，分別將隱動靜脈自上而下地穿過細胞支架複合物的中空隧道。調整好隱動靜脈和細胞支架複合物的相對位置，以防止近心端血管的迂曲而造成術後近心端血管的相互壓迫。將預置的兩根固定用縫合線分別在細胞支架複合物的兩側約2~3_縱向縫合於肌肉床，防止比格犬術後的活動引起細胞支架複合物在肌肉袋的活動。在隱動脈的遠心端靠近支架處使用顯微血管夾夾閉隱動脈，隱靜脈因為壓力較小，可不放置血管夾。在手術顯微鏡下使用帶有鈍頭針的注射器，用肝素生理鹽水衝洗剪斷結紮部位的血管斷端。可見到隱靜脈有血回流出，分別`在顯微鏡下修剪隱動靜脈的血管斷端，剪去血管的外膜。使用11-0顯微縫合線對兩血管斷端進行顯微吻合。吻合成功後，反覆檢查吻合口是否滲漏。如有滲漏，視出血量的大小給予壓迫止血或補針縫合。撤去隱動脈的顯微血管夾，可以見到隱靜脈因為隱動脈的血流立刻充盈。取周圍的軟組織少許分別在血管和支架隧道處包裹血管，形成套袖樣的保護，防止支架隧道的邊緣對血管的卡壓。血管的近心端、遠心端的保護完成後，分離肌肉床兩側的筋膜並縫合，使細胞支架複合物完全地被周圍的肌肉以及筋膜包裹，逐層關閉。皮膚採用水平褥式縫合，線結宜短，防止比格犬術後因異物感撕咬，碘伏消毒傷口。術後再次肌肉注射青黴素(80萬單位/次，每天2次，連續3天)以預防感染，術後皮下注射低分子肝素鈉(1250IU/次，連續3天)。
[0023]上文中BMSCs為自體骨髓間充質幹細胞。
[0024]實施例2:組織工程骨預置血管束血管化方法
[0025]見圖2，取商品化的β-TCP支架，製備成底面直徑為12mm高為IOmm的圓柱形狀，在支架內部小心打出兩個直徑為3mm的軸向中空通道，無菌消毒處理後BMSCs接種並體外培養誘導2周。分離比格犬隱動靜脈約4cm，在遠端分別結紮隱動靜脈。BMSCs/ β -TCP複合物植入前12小時更換為無血清的培養基，以減少殘留的胎牛蛋白作為抗原植入後對受體造成的影響。放置BMSCs/ β -TCP細胞支架複合物於原來隱動靜脈血管床處，並預留兩根縫合線穿過細胞支架複合物的隧道，以便於術後的固定。利用未剪去的結紮線作為牽引，分別將隱動靜脈自上而下地穿過細胞支架複合物的中空隧道。調整好隱動靜脈和細胞支架複合物的相對位置，以防止近心端血管的迂曲而造成術後近心端血管的相互壓迫。將預置的兩根固定用縫合線分別在細胞支架複合物的兩側約2~3_縱向縫合於肌肉床，防止比格犬術後的活動引起細胞支架複合物在肌肉袋的活動。取周圍的軟組織少許分別在血管和支架隧道處包裹血管，形成套袖樣的保護，防止支架隧道的邊緣對血管的卡壓。血管的近心端、遠心端的保護完成後，分離肌肉床兩側的筋膜並縫合，使細胞支架複合物完全地被周圍的肌肉以及筋膜包裹，逐層關閉。皮膚採用水平褥式縫合，線結宜短，防止比格犬術後因異物感撕咬，碘伏消毒傷口。術後再次肌肉注射青黴素(80萬單位/次，每天2次，連續3天)以預防感染，術後皮下注射低分子肝素鈉(1250IU/次，連續3天)。 [0026]上文中BMSCs為自體骨髓間充質幹細胞。
[0027]需要說明的是，上述實施例中，組織工程骨支架材料也可以選用任何醫用材料，不限於β-TCP。凡是採用本發明的結構，均應屬於本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種新型血管化組織工程骨，其特徵在於:包括圓柱體支架材料、兩個內部軸向預製的圓形隧道、動靜脈血管蒂；所述圓柱體支架材料為醫用可吸收材料，所述兩個內部軸向預製的圓形隧道互相平行，在出口處設有出口孔圓形倒角，在圓形隧道內部均勻分布人或動物成骨誘導幹細胞；所述動靜脈血管蒂包括受體血管蒂上的動脈、靜脈及動脈、靜脈移植物，動靜脈血管蒂在軸向預製的圓形隧道內並行分開排列，遠端血管吻合或結紮。
2.根據權利要求1所述的一種新型血管化組織工程骨，其特徵在於:所述人或動物成骨誘導幹細胞的密度為2X IO7個/ml,接種時間為4小時。
3.根據權利要求1所述的一種新型血管化組織工程骨，其特徵在於:所述圓柱體支架材料直徑為12mm,高為IOmm,選用的材料為β-磷酸三鈣。
4.根據權利要求1所述的一種新型血管化組織工程骨，其特徵在於:所述軸向預製的圓形隧道的主隧道直徑為3_，軸向圓形隧道兩端設長2_直徑5_的出口孔圓形倒角。
5.根據權利要求1所示的一種新型血管化組織工程骨，其特徵在於:所述動靜脈血管蒂為哺乳類動物受體知名動靜脈，血管直徑在Imm以上。
6.一種新型血管化組織工程骨的構建方法，其特徵在於包括以下步驟: O體外製備支架材料:將醫用可吸收材料製備成圓柱體，在圓柱體內部軸向預製兩個圓形隧道，在出口處設有出口孔圓形倒角； 2)組織工程骨的體外構建:將體外擴增的人或動物成骨誘導幹細胞接種在製備好的支架材料上，在體外靜態 或動態培養，得到組織工程化骨組織； 3)血管環路或血管束的準備:暴露人或動物隱動靜脈束，切開血管束膜，分離隱動靜脈，遠端結紮； 4)血管環路或血管束的嵌入:將分離好的隱動靜脈分別導入預製好的圓形隧道內，遠端顯微外科血管吻合形成動脈環或簡單結紮形成血管束。
【文檔編號】A61F2/28GK103767807SQ201410012287
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月10日 優先權日:2014年1月10日
【發明者】曹誼林, 肖苒, 王黔, 吳驍偉 申請人:中國醫學科學院整形外科醫院