一種用靶向探針技術檢測高血脂血清的方法

2023-05-14 05:45:11

專利名稱：一種用靶向探針技術檢測高血脂血清的方法
該技術屬分子生物學技術及其在臨床檢測中的應用現有技術經國際專利檢索在現有用於膽固醇及高低密度脂蛋白測試法的研製技術中可歸納為兩類一類是專利Jp 03304800以及專利CN 1048925A為代表的直接顯示法，另一類是以專利Jp 63085357為代表的通過免疫學手段進行如夾心法、ELISA法它們是利用一種抗體或兩種抗體進行檢測的技術。上述兩類方法雖已較廣泛的應用於血糖尿糖及血液中胺基酸檢測，無論是幹法還是溼法都有一個成本昂貴，操作手段繁雜以及對反應物不受保護的局限性。
專利Jp 63085357該方法需四步完成，包括四部分內容1、血液中apolipoprotein(LDL)滴在檢測試劑的幹紙片上；2、採用表面活性劑Triton x-100溶出低密度脂蛋白(LDL)；3、通過免疫學測定方法檢測血液中低密度脂蛋白；4、血液中低密度脂蛋白的測定方法是檢測高膽固醇血症的診斷方法。
專利Jp 02163657該方法用於糞便潛血檢測的裝置，是在一個長方形的疏水片上，通過小孔檢測糞便潛血的一個裝置。
專利Jp 03004800該方法是用於定性的膽固醇單項檢測紙，定性用或用水浸出液對紙片上顏色進行定量用。
專利CN 1048925A本方法是採用純化學偶聯的方法將下述三部連接成一個整體ABC，其中A為親膽固醇的試劑如脂類、蛋白質B為膽固醇酶促產物的顯色劑C為A、B的交聯劑，C具有連接A和B的雙功能化學試劑為彌補上述的不足本專利採用靶向探針的技術在比較短的時間內通過微量級檢測達到定量與半定量的檢測效果。無論是幹法還是溼法在測試卡的製備上方法簡便成本低廉，檢測手段簡易可行，使用效率高，可為常規比色法提高效率30倍，即每10-20分鐘內可完成30人次檢測。如每人次檢測3個指標則90個測試數據的高效率為本方法檢測血液中總膽固醇，高低密度脂蛋白的測試手段。
發明的目的在步入老齡化的人群中，與高脂血、高膽固醇相關的疾病如動脈粥樣硬化、糖尿病、腎綜合症等等，嚴重危害人們的健康，成為中老年人群中的常見病和多發病。在1994年美國醫學學會雜誌中文版第73卷第3期中指出「國家膽固醇教育規劃關於成年人高膽固醇血症的檢測評估和治療的第二次專項調查報告」一文中指出；應繼續把低密度脂蛋白視為降低膽固醇的主要目標。可見高膽固醇血症、低密度脂蛋白的升高是全球關注的中老年病的危險因素之一，波及面甚廣。為方便中老年人掌握自己的健康，隨時了解治療效果解脫病人看病難、檢測取血量大的困難與病人痛苦，減少病人交叉感染的機會，提高臨床檢測效率則是當前急待解決的問題。
為此，本發明所涉及的技術及內容具有先進性、新穎性，除了能滿足上述要求外，更能為高脂血病人配合醫務人員進行飲食治療或藥物治療提供及時的證據。
發明的內容及方案靶向探針技術是指該技術能夠靶向脂蛋白膽固醇酯探測膽固醇，以呈色反應顯示血脂濃度的一種技術，該技術的實現與製備靶向探針的包被原料及其DRV特性悉悉相關。即當高脂血清與靶向探針相接觸的瞬間，在高濃度膽酸鹽和磷酸鹽的介導下，所完成的脂蛋白膽固醇酯與靶向探針之間疏水基團相互作用過程，過程中脂蛋白膽固醇酯在系列酶的作用下完成並實現了酶促反應終產物與探針之間的顯色反應。色度的深淺顯示脂蛋白膽固醇含量的高低。
該靶向探針在指示血脂濃度時具有三個特異性結合過程1、血清中只有脂蛋白膽固醇酯能夠與靶向探針快速結合；2、被結合的脂蛋白膽固醇酯能特異性的與系列酶發生酶促反應；3、酶促反應的終產物與其能呈選擇結合的染料結合併呈現顯色反應，避免了外界環境的幹擾，見圖1、圖2。
優點及效果是將靶向探針的完整結構固相於紙片上成為幹法的紙卡，以及固相於測定板上成為溼法的測定板為主要技術路線。是屬領先技術，亦是填補空白技術。她區別於常量的比色法亦區別於微量的免疫技術測試卡以及用聚脂和聚胺浸沾的紙卡。
該技術的特點是將已製備好的能靶向脂蛋白膽固醇酯並能探測膽固醇的探針這樣一個完整結構固相於國產定量濾紙片上或測試板上，靶向探針的製備過程不涉及到化學反應，而血清中脂蛋白膽固醇酯與靶向探針所呈現的顏色反應則純屬生物化學領域中分子之間的反應。她即能方便存放，又能達到保護檢測試劑的良好效果。測試卡及測定板的特點及優點是1、體積小輕便，便於存放及攜帶；2、無試劑外溢，不汙染環境；3、使用方便，簡化操作手續，適於臨床檢測及家用測試；4、本方法(幹、溼法)屬微量測定，三個測試指標需6-50微升指血，檢測時需血量少，減少病人痛苦及交叉感染的機會；5、測程短效果高，每人次需時10-20分鐘(幹法)單位時間內溼法比常規法提高約30倍的效率；6、該方法中幹法可為醫生提供保守治療和藥物治療的證據，適於家用。
實施例實施例1溼法可用於定量的靶向探針測定板的製備方法1、靶向探針的製備方法1.1探針組成於每平方釐米測定板加入31μl-100μl，含有下述試劑成份的混合液磷酸鹽 維持pH為7.7 0.04-0.09μmoL4氨基安替比林 0.07-0.20μmoL膽酸鈉鹽 0.42-0.93μmoL酚(重蒸的)0.49-1.09μmoL膽固醇脂肪酶 0.1160-0.2480I、U膽固醇氧化酶 0.0558-0.1240I、U過氧化物酶0.6975-1.5500I、U1.2、將1.1中所示探針內含物與麥醇溶蛋白以E1cm280nm·1％近似於0.7的濃度按(3-1)∶(0.01-3)的比例逐滴混合於4-8℃低溫下，通過200γpm轉速的20分鐘攪拌，完成靶向探針的製備。控制乙醇濃度為10-40％。
1.3、取出上述靶向探針均勻的鋪到測定板上冷凍乾燥完成固相製備。
1.4、探針所用顏色除4氨基安替比林也可使用各種隱性顏料等如隱性孔雀緣，隱性結晶紫，螢光標記物，放射性標記物。
2、低密度脂蛋白沉澱片每平方釐米紙片上加入5μl-PVS(Polyvinylphyrolidonesolution)pH6-8，(PVP與磷酸緩衝液PBS的比為(5-10)∶100)混合沉澱劑冷凍乾燥-10℃—-20℃。
3、高密度脂蛋白沉澱片每平方釐米紙片上加入10μl PTA(Phosphotungstie acid)和Mg與混合物，二者的比為9.7(m mol)∶0.4(mol)並冷凍乾燥溫度為-70℃—-20℃。
4、紅血球過濾片採用國產微孔濾膜孔徑0.3—0.80μ，將指血滴到此濾片上，紅血球被隔到膜上，血清透過膜。
5、測試板的組裝分二部分5.1、分別將低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的沉澱片上各蓋一個0.3-0.80μ直徑的微孔濾膜，做為得到除掉低高密度脂蛋白的及紅血球的血清的裝置。
5.2、定量量取實施例5.1裝置所處理過的血清，溫度37℃5分鐘，於靶向探針測試板上。
5.3、處理過的血清樣品通過420-500nm濾光片進行比色測定與標準樣品進行比較確定血樣中脂蛋白含量。
6、測試卡及測試板上選用血清量為2-10μl血清。
實施例2幹法半定量靶向探針測定卡的製備方法1、靶向探針製備方法同實施例1中的1.1和1.2，只不過在1.3中將溼法的測定板改成1平方釐米的國產定量濾紙紙片做為固定靶向探針的支持物。
2、低密度脂蛋白沉澱片製備方法同實施例1中23、高密度脂蛋白沉澱片製備方法同實施例1中34、紅血球過濾片製備方法同實施例1中45、測試卡的組裝實施例3靶向探針與兔紅細胞膜的親和作用按實施例1中製備的靶向探針與兔紅血球碎片於4℃溫度下或室溫下放置，可見到兔紅血球碎片與靶向探針的親和現象。
實施例4靶向探針的另一製備途徑按實施例1中取麥醇溶蛋白與戊二醛與螢光抗體的比例為(0.5-2.5)∶(0.5-5.0)∶(0.1-1.5)的比例進行順序逐滴混合後於室溫下放置2-4小時，完成標記螢光抗體靶向相應抗原的探針。


圖1靶向探針與血清脂蛋白膽固醇酯結合前照片(顯微鏡放大10×10)圖2靶向探針與血清脂蛋白膽固醇酯結合後照片(顯微鏡放大10×10)
權利要求
1.一種用靶向探針技術檢測高血脂血清的方法，其特徵在於所述方法包括靶向探針的製備、低密度脂蛋白沉澱片、高密度脂蛋白沉澱片、紅血球過濾片選擇、測試板的組裝等；1)在每平方釐米測定板加入31μl-100μl試劑，此試劑為下述成份的混合液，磷酸鹽 維持pH為7.7 0.04-0.09μmoL4氨基安替比林0.07-0.20μmoL膽酸鈉鹽 0.42-0.93μmoL酚(重蒸的) 0.49-1.09μmoL膽固醇脂肪酶 0.1160-0.2480I、U膽固醇氧化酶 0.0558-0.1240I、U過氧化物酶 0.6975-1.5500I、U將上述探針內含物與麥醇溶蛋白以E1cm280nm·1％為近似於0.7的濃度按(3-1)∶(0.01-3)的比例在4-8℃溫度下逐滴混合，然後在4-8℃溫度下用200γpm轉速攪拌20分鐘，完成靶向探針的製備；取出上述靶向探針物質將其均勻的鋪到測定板或紙片上冷凍乾燥，完成固相製備；2)低密度脂蛋白沉澱片的製備在每平方釐米紙片上加入5μlPVS(PolyVinylphyrolidoneSolution)(PVP與磷酸鹽緩衝液PBS混合沉澱劑)在-10℃—-20℃冷凍乾燥；3)高密度脂蛋白沉澱片的製備在每平方釐米的紙片上加入10μlPTA(phosphotungstic acid)和Mg++混合物，在-10℃—-20℃下冷凍乾燥；4)紅血球過濾片的選擇採用國產微孔濾膜孔徑在0.30-0.80μ做為血清透過膜；5)測試板的組裝分別將低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的沉澱紙片上各蓋一個0.3-0.8μ直徑的微孔濾膜，做為除掉低、高密度脂蛋白的及紅血球的血清的裝置；然後定量量取經上述裝置處理過的血清放入在靶向探針測試板上溫育37℃5分鐘；將上述溫育後的血清於420-500nm濾光片下進行比色測定，測定後與標準樣品進行比較確定血樣中脂蛋白膽固醇的含量。
2.根據權利要求1、1)中所述，其特徵在於靶向探針內含物與麥醇溶蛋白混合時乙醇濃度控制在10-40％。
3.根據權利要求1、3)中所述，其特徵在於PVP與PBS的比為(5-10)∶100，pH6-8。
4.根據權利要求1所述靶向探針技術，其特徵是適用於製備多種測試卡及測定板，例如測定血糖，尿糖等。
5.根據權利要求1所述靶向探針技術，其特徵是適用於製備各種外敷貼片製劑，例如硝酸甘油貼片。
6.根據權利要求1所述靶向探針技術，其特徵是適用於製備口服緩釋片劑及檢測用的藥物片劑。
全文摘要
一種用靶向探針技術檢測高血脂血清的方法靶向探針是通過探針包被物與血清中脂蛋白膽固醇酯之間在高鹽的介導實現的，疏水相互作用，探針與脂蛋白膽固醇酯的特異性結合完成的。之後在系列酶的作用下，酶促反應終產物的顯色反應，呈色的深度顯示血脂的含量。本檢測分溼法及幹法兩種，幹法為半定量法適於家用，亦可為臨床治療手段提供證據。溼法為微量定量法，適於臨床化驗用。
文檔編號G01N33/49GK1114421SQ95104968
公開日1996年1月3日 申請日期1995年5月17日 優先權日1995年5月17日
發明者王素雲 申請人:北京大學