10種常見致病軍團菌的基因分型晶片及檢測用試劑盒的製作方法

2023-05-14 05:45:06 1

專利名稱：10種常見致病軍團菌的基因分型晶片及檢測用試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因晶片及包含該晶片的檢測用試劑盒，尤其是涉及嗜肺軍團菌，安氏軍團菌，博滋曼軍團菌，杜莫夫軍團菌，費菲軍團菌，戈爾曼軍團菌，喬丹河軍團菌，長灘軍團菌，米氏軍團菌，邁氏軍團菌等10種軍團菌的的基因晶片及檢測用試劑盒。
背景技術：
水是生命得以存在的必要條件，它使我們人類得以繁衍生息，人類的生活、生產、娛樂都離不開水。它同時也是許多病原微生物滋生、傳播的場所和載體，這些病原微生物一旦進入人體則將可能使人患病、甚至導致死亡，嚴重威脅著人類健康。隨著社會的發展和生活水平的提高，人們越來越關心自身的健康問題，而各種水體(包括生活飲用水，江河湖泊，遊泳場館等)的安全問題也日益成為人們關注的熱點。因此，為了保護人們的身體健康，對各種水體尤其是飲用水中病原微生物的檢測是十分必要和亟需的。
軍團菌(76^io/ e77a)是一種革蘭氏陰性桿菌,廣泛存在於自然和人工環境的水體、土壤中，可以通過含菌氣溶膠的方式在空氣中播散而被人體吸入導致人類感染，引發急性發熱性肺部疾病——軍團病。自1976年首次在美國發現軍團病以來，該病已呈現出世界性分布及病死率高的兩大特點。軍團菌的生長繁殖與環境因密切相關，集中空調的冷卻塔冷卻水、冷凝水以及溫泉水是軍團菌在外界適宜的生存環境。當環境水中的軍團菌繁殖到一定濃度，則會形成氣溶膠進而感染人。宿主感染主要受其易感性和細菌毒力的影響，任何年齡均可發生，但中老年、基礎免疫較差者、長途旅行者、吸菸者為高危人群，並以醫院、賓館、大型建築工地等公共場所易染軍團菌。
此外，軍團菌屬種類多樣，常規的細菌培養和血清鑑定分型，耗時長，工作量大，通量低，不能滿足流行病學調查及對突發致病事件快速分析需要。免疫血清學方法是利用細菌抗原的獨特性及抗原抗體結合的特異性建立起來的現代檢測技術，具有特異性強等特點。許多臨床疾病已經開始使用這種方法進行病原體檢測，如利用HBV表面抗原檢測HBV病毒。然而，由於這種方法需要經過至少48小時的細菌培養、擴增和單菌落的分析，並需要對每一個樣品的大量單菌 落進行抗血清凝聚反應，耗時長且可能出現假陰性。另外，世界上沒有一家公司或單位能生產全部細菌的抗血清，即使是最常用的大腸桿菌的抗血清，也只有少數幾個公司和單位有全部血清型的抗血清而且價格昂貴。
1993年,Luk, J.M.C et.al選取沙門氏菌(5: eflierica )0_抗原基因簇的特異核苷酸序列，通過PCR方法鑑定了沙門氏菌的O-抗原[Luk, J.M.C.et.al (1993) 「Selectiveamplification of abequose and paratose synthase genes (xfb) by polymerase chainreaction for identification of S.enterica major serogroups (A, B, C2 and D)，，，J.Clin.Microbiol.31: 2118-2123]，開啟了從0抗原基因簇中篩選特異分子標識的先河，為細菌多樣的O-抗原檢測提供了高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高的分子檢測方法。細菌O抗原種類繁多，一般不同的細菌具有不同的O-抗原，同一種屬內的細菌也大多有不同的O-抗原。研究表明，細菌O-抗原的多樣性是由負責其合成的基因簇的遺傳學多樣性導致，O-抗原基因簇中的一些特定基因對於其編碼的表面抗原具有極高的特異性，由此為啟發，可以從O抗原基因簇中篩選特異分子標識，用於軍團菌分子分型。
目前，應用軍團菌檢測方面的專利或專利申請主要有: (I)擴增常見致病型軍團菌基因特異區引物及其應用(公布號:CN102168131)，該專利申請提供了一種分別擴增米克戴德軍團菌Hegionella micdadei)；博茲曼軍團菌{Legionella bozemanii);長灘軍團菌{Legionella 1ngbeachae')中 gjTi 基因(DNAgyrase B subunit gene,以下簡稱特異區的引物,還提供了一種包括擴增米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌基因特異區的引物的PCR試劑盒，利用該PCR試劑盒對米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌進行檢測，簡便快速、特異性好、靈敏度高，可用於水體和臨床樣品的監督和檢測、飲用水中病原菌檢測、細菌學分類及流行病學調查等領域，具有深遠的社會效益和較大的經濟效益。
(2) 一種檢測水中常見致病菌的DNA微陣列(公布號:CN1396270A，
公開日:2003年2月12日)，該專利申請公開了一種DNA微陣列檢測水中常見致病菌的技術。該技術利用16S rRNA基因檢測與鑑定水中常見致病菌，兩條引物分別設計在16S rRNA基因的保守區，探針在16S rRNA基因的可變區。該DNA微陣列技術可檢測埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、變形桿菌屬、厭氧梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、軍團桿菌、結核分枝桿菌、耶爾森氏菌、李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、空腸彎曲菌，可用於臨床疾病診斷、水和食品的監督與檢測與流行病學調查。該技術由於16S rRNA的高度保守性，分辨能力較低，無法區分到種，也無法區分大腸桿菌和志賀氏菌。
(3)一種擴增嗜肺軍團菌gyrB基因特異區的引物及其應用(公布號:CN101967474)，該專利申請公開了一種擴增嗜肺軍團菌中gyrB基因(DNA gyrase B subunit gene,以下簡稱gyrB)特異區的引物，還提供了一種包括擴增嗜肺軍團菌gyrB基因特異區的引物的PCR試劑盒，利用該PCR試劑盒對嗜肺軍團菌進行檢測，簡便快速、特異性好、靈敏度高，可用於水體和臨床樣品的監督和檢測、飲用水中病原菌檢測、細菌學分類及流行病學調查等領域，具有深遠的社會效益和較大的經濟效益。(4)嗜肺軍團菌基因克隆、重組、表達和蛋白純化方法(公布號:CN1664105)，該專利申請公開了一種嗜肺軍團菌Legionella pneumophila macrophage infectivity potentiator基因的克隆、重組、表達、純化方法與專用引物，以及MIP蛋白及其類似物、衍生物在軍團菌感染病人的臨床診斷和治療方面的應用。本方法將獲得的嗜肺軍團菌基因組DNA，用PCR方法獲得基因，並將該基因重組後克隆到大腸桿菌表達載體中，誘導表達後提取MIP蛋白，進而應用親和層析方法得到高純度的蛋白，為臨床進一步診斷嗜肺軍團菌感染應用於檢測嗜肺軍團菌抗原和抗體。發明內容
本發明的一個目的是提供一種用於檢測常見致病軍團菌的基因分型晶片及檢測用試劑盒，以彌補傳統飲用水水質檢測技術存在的費時、耗力，分辨能力差的缺陷，擴展病原微生物檢測範圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強度，縮短檢測周期。
為實現上述目的本發明公開了如下的技術 內容: 一種檢測致病軍團菌(Z￡^i0/^77a)的基因晶片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特徵在於該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種: (1)嗜肺軍團菌，安氏軍團菌，博滋曼軍團菌，杜莫夫軍團菌，費菲軍團菌，戈爾曼軍團菌，喬丹河軍團菌，長灘軍團菌，米氏軍團菌，邁氏軍團菌等10種軍團菌的16s-23s間區序列(ITS)中所選取的至少一種DNA片段； (2)(I)中選取的DNA片段的互補DNA片段； 本發明所述的固相載體為帶有活性基團的玻璃片。
所述寡聚核苷酸探針優選具有SEQ ID NO: 1-29所示的核苷酸序列，或不同於SEQID NO: 1-29但編碼的胺基酸序列與SEQ ID NO: 1-29所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；本發明所述的基因晶片，還包括正對照探針。
上述的優選序列及功能如下所示:
權利要求
1.一種檢測多種致病軍團菌的基因晶片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特徵在於該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種: (1)嗜肺軍團菌，安氏軍團菌，博滋曼軍團菌，杜莫夫軍團菌，費菲軍團菌，戈爾曼軍團菌，喬丹河軍團菌，長灘軍團菌，米氏軍團菌，邁氏軍團菌等10種軍團菌的16s-23s間區序列(ITS)中所選取的至少一種DNA片段； (2)(I)中選取的DNA片段的互補DNA片段； 上述所述的固相載體為帶有活性基團的玻璃片。
2.權利要求1所述的基因晶片，其中所述寡聚核苷酸探針具有SEQID ΝΟ:1-29所示的核苷酸序列，或不同於SEQ ID NO: 1-29但編碼的胺基酸序列與SEQ ID ΝΟ:1_29所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列。
3.權利要求1或2所述的基因晶片，其中還包括正對照探針；具有SEQID N0:30所示的核苷酸序列。
4.權利要求1所述的基因晶片在製備檢測嗜肺軍團菌，安氏軍團菌，博滋曼軍團菌，杜莫夫軍團菌，費菲軍團菌，戈爾曼軍團菌，喬丹河軍團菌，長灘軍團菌，米氏軍團菌，邁氏軍團菌10種軍團菌中至少一種致病菌的方面應用。
5.權利要求1所述基因晶片的使用方法，其特徵在於包含步驟: (1)根據權利要求1所述病原菌的16S-23S間區序列(ITS)設計併合成用於PCR擴增的引物； (2)製備待測樣品的基因組DNA，使用步驟(I)中的引物，對待測樣品基因組DNA進行PCR擴增，得到靶序列； (3)標記步驟(2)中得到的靶序列； (4)將標記後的靶序列與權利要求1所述的基因晶片雜交； (5)用生物晶片掃描儀獲取雜交信號並分析雜交結果。
6.權利要求5所述的方法，其特徵在於步驟(I)中所述的引物包括SEQID NO:31-32所示的核苷酸序列的至少一種。
7.一種檢測嗜肺軍團菌的試劑盒，其特徵在於包含權利要求2所述SEQ ID NO: 1-29所示的核苷酸序列或其互補核苷酸序列的至少一種。
8.權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於還包含PCR擴增的引物，該引物具有SEQIDNO: 31-32的核苷酸序列的至少一種。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特徵在於還包含雜交盒、雜交液。
10.權利要求7所述的試劑盒在製備檢測嗜肺軍團菌，安氏軍團菌，博滋曼軍團菌，杜莫夫軍團菌，費菲軍團菌 ，戈爾曼軍團菌，喬丹河軍團菌，長灘軍團菌，米氏軍團菌，邁氏軍團菌10種軍團菌的中至少一種致病菌方面的應用。
全文摘要
本發明提供了一種針對10種常見致病軍團菌(Legionella)的基因分型晶片及檢測用試劑盒，其主要針對嗜肺軍團菌，安氏軍團菌，博滋曼軍團菌，杜莫夫軍團菌，費菲軍團菌，戈爾曼軍團菌，喬丹河軍團菌，長灘軍團菌，米氏軍團菌，邁氏軍團菌等10種軍團菌。該基因晶片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，上述寡聚核苷酸探針包含從16s-23s間區序列(ITS)上選取的DNA片段或其互補的DNA片段。利用設計的引物將待檢測樣品基因組DNA擴增並標記後，用上述基因晶片進行雜交，根據雜交信號，可檢測出不同種類的軍團菌。利用本發明的基因晶片可達到檢測常見致病軍團菌的目的，操作簡便，準確性高，重複性強，並且可更準確的指導醫療用藥。
文檔編號C40B40/06GK103160587SQ20131011229
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月2日 優先權日2013年4月2日
發明者王磊, 曹勃陽, 劉向前, 王敏, 馮露 申請人:南開大學