一種戒菸靈中菸鹼的手性分析合相色譜串聯質譜法的製作方法

2023-05-14 01:41:01

本發明涉及戒菸靈化學成分測定方法，具體涉及一種戒菸靈中菸鹼的手性分析合相色譜串聯質譜法。

背景技術：

菸鹼，也叫尼古丁，是一種存在於茄科植物中的生物鹼，也是菸草的重要成分。菸鹼分子含有一個手性中心，即四氫吡咯環上的2位碳原子，所以菸鹼有兩個對映體：S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼。菸鹼的兩個對映體具有完全不同含量、代謝機理和生理特性。因此需進行戒菸靈（戒菸靈是應用中醫藥芳香醒腦開竅消炎的醫學原理和祖國傳統的氣味療法，選用30多種名貴中草藥通過現代科學方法精製而成的仿煙型點燃產品，大部分含有菸鹼成分）中菸鹼的手性分析。

目前關於菸鹼的手性分析，主要是採用氣相色譜法進行研究，例如申請號為201610663534.1的專利《一種捲菸菸絲中菸鹼的手性分析方法》，該方法前處理步驟複雜，並且檢測時間達到140min，不能滿足大量樣品的檢測，目前尚未有關於戒菸靈中菸鹼的手性分析的方法。因此有必要開發一種靈敏度高、精密度好、適合大批量準確定量戒菸靈中S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼的方法。手性柱-合相色譜串聯質譜在異構體分離方面有著明顯的優勢，因此通過大量實驗建立了戒菸靈中菸鹼手性的手性柱-合相色譜串聯質譜分析方法，該方法更適合用於大量樣品中菸鹼的手性分析。

技術實現要素：

本發明的目的正是以菸鹼為研究對象，對戒菸靈樣品進行了前處理方法研究，建立了串聯手性柱-合相色譜串聯質譜法檢測戒菸靈中菸鹼旋光異構體的分析方法，實現了對戒菸靈中菸鹼旋光對映體S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼的準確測定。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：將戒菸靈樣品乾燥、粉碎和過篩，樣品經過氫氧化鈉溶液浸潤後，採用甲基叔丁基醚和甲醇溶液萃取，萃取液經基質分散固相萃取淨化後，使用串聯手性柱-合相色譜串聯質譜法分析，採用峰面積歸一化法定量檢測戒菸靈中S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼的比例。具體步驟如下：

1. 標準溶液的配製：稱取約100.0 mg的S-(-)-菸鹼標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配製成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-菸鹼標準儲備液；稱取約50.0 mg的R-(+)-菸鹼標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配製成濃度約為1.0 mg/mL的R-(+)-菸鹼標準儲備液；利用S-(-)-菸鹼標準儲備液和R-(+)-菸鹼標準儲備液稀釋配製S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼濃度分別為100 μg/mL和80 μg/mL的混合標準溶液。

2.戒菸靈樣品的混勻：將戒菸靈樣品置於40 ℃烘箱中，1小時後將戒菸靈取出，粉碎後過0.45毫米孔徑標準篩。

3. 戒菸靈樣品的萃取：稱取0.3 g已粉碎的樣品於15 mL具塞離心管中，加入2.0 mL 5% 的氫氧化鈉溶液，渦旋1 min混勻後靜置10 min浸潤樣品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到離心管中，並於旋渦混合器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

4. 萃取液的淨化：取1.5 mL上清液於2 mL淨化離心管中（內含150 mg無水硫酸鎂，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑；統稱基質分散固相萃取材料），於旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以10000 rpm離心1 min。取上清液過0.45 μm有機相濾膜後進合相色譜串聯質譜分析。

5. 串聯手性柱-合相色譜串聯質譜法條件：分析柱1為Trefoil CEL1柱（柱長 150 mm ，內徑3.0 mm ，固定相粒徑2.5 µm），分析柱2為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長 250 mm ，內徑4.6 mm ，固定相粒徑5 µm)；流動相A為：CO2，流動相B：含0.05%異丙胺的甲醇；流速為1.1 mL/min；梯度洗脫條件為：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；10.0 min，92% A；10.2 min，97% A；12.0 min，97% A。柱溫40 ℃；進樣室溫度：10 ℃；進樣體積2 μL；背壓：1600 psi；ISM補償流路流動相為含0.1%甲酸的甲醇，流速為0.3 mL/min。分析時間總計12 min。質譜條件：離子源：電噴霧源，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為300 ℃，電噴霧電壓為5000 V，霧化氣壓力為40 psi；檢測方式：多反應監測（MRM）；MRM參數見下表。通過對峰面積進行歸一化定量S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼佔總菸鹼的比例。

本發明提供了一種戒菸靈中菸鹼的手性分析合相色譜串聯質譜法，具有以下優良效果：降低樣品液對色譜柱的汙染，合相色譜串聯質譜法檢測方法靈敏度高，特異性好，可避免假陽性，分析時間短，能實現對S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼的基線分離，R-(+)-菸鹼的檢出限（LOD）為0.04%，能夠滿足大批量戒菸靈樣品中菸鹼的手性分析。

附圖說明

圖1為混合標準溶液的色譜圖，

圖2為戒菸靈樣品的色譜圖。

具體實施方式

本發明通過以下具體實施例作進一步描述，但不限制本發明。

1. 儀器和試劑

ACQUITY UPC2超高效合相色譜儀（美國Waters公司），6410B三重串聯四級杆質譜儀（美國Agilent公司），AE163電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司），高速粉碎機（武漢銀彩科技有限公司），美國ColeparmerVotex-Genie漩渦振蕩器，德國SIGMA 3-30K-高速臺式冷凍型離心機。甲基叔丁基醚（色譜純），氫氧化鈉（分析純），甲酸（色譜純），，甲醇（色譜純），S-(-)-菸鹼標準品（CAS：54-11-5），R-(+)-菸鹼標準品（CAS：25162-00-9）。

2. 標準溶液的配製

稱取約100.0 mg的S-(-)-菸鹼標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配製成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-菸鹼標準儲備液；稱取約50.0 mg的R-(+)-菸鹼標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配製成濃度約為1.0 mg/mL的R-(+)-菸鹼標準儲備液；利用S-(-)-菸鹼標準儲備液和R-(+)-菸鹼標準儲備液稀釋配製S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼濃度分別為100 μg/mL和80 μg/mL的混合標準溶液。

3.戒菸靈樣品的混勻：將戒菸靈樣品置於40 ℃烘箱中，1小時後將戒菸靈取出，粉碎後過0.45毫米孔徑標準篩。

4. 戒菸靈樣品的萃取：稱取0.3 g已粉碎的樣品於15mL具塞離心管中，加入2.0mL 5% 的氫氧化鈉溶液，渦旋1min混勻後靜置10 min浸潤樣品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到離心管中，並於旋渦混合器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

5. 萃取液的淨化：取1.5 mL上清液於2 mL淨化離心管中（內含150 mg無水硫酸鎂，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑），於旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以10000 rpm離心1min。取上清液過0.45 μm有機相濾膜後進液相分析。

6. 串聯手性柱-合相色譜串聯質譜法條件：分析柱1為Trefoil CEL1柱（柱長 150 mm ，內徑3.0 mm ，固定相粒徑2.5 µm），分析柱2為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長 250 mm ，內徑4.6 mm ，固定相粒徑5 µm)；流動相A為：CO2，流動相B：含0.05%異丙胺的甲醇；流速為1.1 mL/min；梯度洗脫條件為：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；10.0 min，92% A；10.2 min，97% A；12.0 min，97% A。柱溫40 ℃；進樣室溫度：10 ℃；進樣體積2 μL；背壓：1600 psi；ISM補償流路流動相為含0.1%甲酸的甲醇，流速為0.3 mL/min。分析時間總計12 min。質譜條件：離子源：電噴霧源，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為300 ℃，電噴霧電壓為5000 V，霧化氣壓力為40 psi；檢測方式：多反應監測（MRM）；MRM參數見下表。通過對峰面積進行歸一化定量S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼佔總菸鹼的比例。

7. R-(+)-菸鹼的檢出限

菸鹼的手性組成通常以R-(+)-菸鹼佔總菸鹼的百分比來表示。為評估R-(+)-菸鹼的檢出限，本發明方法在S-(-)-菸鹼的標準溶液中加入R-(+)-菸鹼的標準溶液。結果表明，S-(-)-菸鹼的標準溶液中即可觀察到R-(+)-菸鹼的響應信號，對定量離子峰面積進行歸一化後，S-(-)-菸鹼的標準溶液中R-(+)-菸鹼的比例為0.04%（峰面積相對於總菸鹼峰面積），以此作為本方法R-(+)-菸鹼的檢出限。

8. 戒菸靈樣品中菸鹼的手性分析實例

將按照上述步驟處理的戒菸靈樣品進行合相色譜串聯質譜分析；採用戒菸靈MRM離子進行定性分析，對峰面積進行歸一化定量S-(-)-菸鹼和R-(+)-菸鹼佔總菸鹼的比例。

採用該方法對6個戒菸靈樣品進行了分析，結果見表1。

9. 分析方法的精密度

取同一戒菸靈樣品進行5次日內和日間平行測定，考察了本發明方法的精密度，結果見表2和表3。結果表明，戒菸靈樣品中R-(+)-菸鹼的日內和日間測定結果的變異係數分別為6.87%和8.79%，精密度較好。

採用具體實施方式中的方法對上述6個戒菸靈樣品進行了檢測。檢測得到的色譜圖如圖1和圖2所示。