實時定量pcr檢測血液樣品中癌細胞的方法
2023-05-13 16:51:46
專利名稱：實時定量pcr檢測血液樣品中癌細胞的方法
技術領域：
本發明涉及醫學腫瘤學領域。具體地說，本發明涉及一種新的檢測血液中微量癌細胞的方法及其試劑盒。
背景技術：
惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，目前全球每年至少有700萬人死於惡性腫瘤，其中我國約130萬，惡性腫瘤已成為繼心腦血管病之後人類因疾病死亡的第二位原因。惡性腫瘤中90％以上屬於上皮來源的實體腫瘤(俗稱癌症，如肺癌、肝癌、胃癌等)，這些惡性實體腫瘤(以下簡稱腫瘤)致死的主要原因是轉移，尤其是全身轉移。臨床觀察到，對病理檢查無淋巴結轉移的早期腫瘤患者，根治性手術後仍有相當一部分因全身轉移而最終死亡，提示在手術時體內已經存在少量癌細胞全身播散但應用現有的診斷手段(如影像學和核醫學等)尚無法發現，這類隱匿性的轉移(OccultMetastasis，或稱微轉移，Micrometastasis)是患者術後腫瘤復發轉移的一個重要根源。動物實驗揭示，當瘤重達到1克(直徑≥1cm)時，每天約有106癌細胞從原發腫瘤脫落進入血液，這些癌細胞在血液中很少死亡，它們通過血液循環轉運到各器官後很快穿越血管內皮屏障進入組織，其中98％的癌細胞在組織內凋亡並被機體清除，但仍有2％的癌細胞存活下來並發展成為轉移病灶。德國學者曾對骨髓中的微轉移癌細胞進行培養，證明此類癌細胞能夠在體外生長，並且癌細胞活躍生長者生存期短。因此，血液中出現癌細胞是腫瘤轉移的一項早期預警指標，預示轉移的風險增高。
建立腫瘤轉移的早期預警系統在臨床上具有廣泛的應用價值，因為該系統不僅有助於對患者進行預後評估，而且更重要的是可以對術後轉移進行早期診斷和及時治療，以期鞏固療效和改善預後。此外，檢測血液中癌細胞還可以作為評估晚期腫瘤化療療效的一項分子標誌，文獻報導，化療後血液中癌細胞消失者預後好、生存期長。因此近十年來從血液中檢測癌細胞受到了國內外學者的普遍關注。隨著現代免疫學和分子生物學技術的發展，目前已經能夠對血液中的微量癌細胞進行檢測，表1列舉了近年來對6種常見腫瘤患者血液中癌細胞檢測的若干結果，上述報導中有6篇附有2年以上的隨訪結果，證明血液中檢出癌細胞與患者預後呈負相關。根據上海市腫瘤研究所的最新統計資料，這些腫瘤的發病率居上海市區惡性腫瘤的前10位，佔惡性腫瘤總發病率的70％以上。
表1惡性實體腫瘤患者血液中微量癌細胞檢測結果
注CEA癌胚抗原；CK細胞角蛋白；S5A肺癌特異性單抗識別的抗原；MAGE黑色素瘤抗原；EPCAM上皮細胞粘附分子。RT-PCR逆轉錄-多聚酶鏈反應；FCM流式細胞儀檢測；IHC免疫組化。
但是，目前血液中癌細胞的檢測技術還不完善，存在許多問題，一是檢測方法不統一，包括各家採用的檢測技術和腫瘤標誌不一致，研究結果很難相互比較；二是敏感性較低，通常只能從105正常血細胞中檢出1個癌細胞，其檢測極限相當於40-100個癌細胞/ml全血(按每毫升血含4-10×106白細胞計算)，可能會有一部分患者漏診；三是大部分腫瘤標誌基因在正常白細胞中有「非法表達」(Illegitimate Expression)現象，如採用RT-PCR檢測CK-19 mRNA在一部分健康人外周血中可能出現「假陽性」。
因此，本領域中迫切需要建立一種敏感性高、特異性好、適用面廣的檢測方法。
發明內容
為達到上述目的，本發明第一方面提供了一種體外檢測樣品中端粒酶逆轉錄酶的方法，所述方法包括以下步驟在端粒酶逆轉錄酶基因第1521-1819位核苷酸區間製備標準品；根據端粒酶逆轉錄酶基因第1657-1787位核苷酸區間設計引物及Tagman探針；用Taqman技術對端粒酶逆轉錄酶mRNA的拷貝數進行定量分析。
本發明第二方面還提供了一種體外實時定量檢測血液樣品中癌細胞的方法，它包括以下步驟用磁性分選技術從血液樣品中分離上皮細胞粘附分子陽性細胞；從上述細胞中抽提RNA並獲得cDNA；在端粒酶逆轉錄酶基因第1521-1819位核苷酸區間製備標準品；根據端粒酶逆轉錄酶基因第1657-1787位核苷酸區間設計引物及Tagman探針；用Taqman技術對端粒酶逆轉錄酶mRNA的拷貝數進行定量分析。
本發明第三方面提供了一種用於定量檢測血液樣品中癌細胞的試劑盒，所述試劑盒包含引物，DNA標準品和Taqman探針，其中所述引物及探針是根據端粒酶逆轉錄酶基因第1657-1787位核苷酸區間設計得到，所述DNA標準品根據端粒酶逆轉錄酶基因第1521-1819位核苷酸區間製得。
本發明的方法通過免疫磁性分選技術從血液中分離上皮細胞粘附分子(EPCAM)陽性細胞後，採用單個細胞實時定量PCR檢測俘獲的上皮細胞中端粒酶逆轉錄酶(hTERT)mRNA表達，從而對血液中的癌細胞作出診斷。本發明的優點是一，可用於幾乎所有上皮性惡性腫瘤的檢測，適用面廣；二，可以對每毫升僅含1個癌細胞的血液樣本進行檢測，具有較高的特異性和敏感性。
附圖簡述
圖1顯示了hTERT基因表達的常規PCR分析結果。
圖2顯示了hTERT基因表達值經對數轉換後的細胞數量與檢測結果呈線性關係。
圖3A和圖3B顯示了hTERT基因表達的實時定量PCR檢測的結果。
圖4A和圖4B顯示了GAPDH基因表達的實時定量PCR檢測的結果。
具體實施方案針對本領域中所存在的上述問題，本發明提出了一套新的解決方案。
首先，本發明選擇上皮細胞粘附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule，EPCAM)和人端粒酶逆轉錄酶(Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)作為區分癌細胞、正常上皮細胞和血液中白細胞的分子標誌，從而提供了能夠適用所有實體腫瘤的檢測技術。
EPCAM是二十世紀七十年代研究腫瘤特異性單克隆抗體時發現的一種胃腸道腫瘤抗原，近二十餘年來的研究顯示該抗原是實體腫瘤的一種共同抗原，在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、結腸癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌和腎細胞癌等實體腫瘤中均呈高表達。EPCAM屬於分子量約40KD的細胞膜糖蛋白，其主要功能是作為細胞膜的離子通道並涉及細胞之間的同源性粘附，並且EPCAM過表達抑制了上皮細胞鈣粘蛋白(E-Cadherin)介導的細胞粘附，從而有利於癌細胞轉移，因而活躍增殖的高轉移癌細胞其抗原表達較高。臨床研究表明，EPCAM過表達者容易轉移、預後較差。但EPCAM在正常上皮細胞表面也有表達，因而該抗原作為腫瘤標誌的特異性不夠理想。
腫瘤細胞的一個基本特徵是無限制增殖，該特徵與hTERT mRNA異常表達有關。目前已知細胞增殖受染色體末端的DNA序列控制，這段DNA由TTAGGG重複序列組成，稱為端粒。當細胞每次分裂後，端粒就丟失約150個鹼基長度的DNA片段，因此隨著細胞的不斷增殖，其端粒DNA長度不斷縮短，但端粒DNA縮短到一定程度時，細胞就停止生長進入老化期死亡。惡性腫瘤細胞通過啟動端粒酶基因表達逃脫上述控制。端粒酶是人體細胞內的一種逆轉錄酶，由端粒RNA、端粒酶相關蛋白(TEP1)和端粒酶逆轉錄酶hTERT組成，當TEP1與DNA末端的端粒序列結合時，hTERT就能夠以端粒RNA為模板複製端粒DNA，從而使得癌細胞維持恆定的端粒長度，有利於癌細胞無限制生長。由於成年人體內絕大部分細胞，除了原始的幹細胞、生殖細胞和活化的淋巴細胞外，均缺乏端粒酶活性，也不表達hTERT mRNA，而85％以上的腫瘤中均可以檢測到端粒酶活性和hTERT mRNA，這一特性使得hTERT成為腫瘤細胞的一種理想標誌。
因此，將EPCAM與hTERT組合可以鑑別正常上皮細胞和癌細胞，正常上皮細胞的表型為EPCAM+hTERT-，而癌細胞為EPCAM+hTERT+。
第二，在血液中正常白細胞與癌細胞的鑑別也是一個十分棘手的問題。由於血液中癌細胞含量甚少，採用病理形態觀察無法找到癌細胞。目前普遍採用RT-PCR等高度敏感的分子檢測技術進行分析，但由於正常白細胞存在腫瘤標誌基因的非法表達現象，假陽性問題很難排除。通過使用免疫磁性分選技術，可以排除檢測過程中正常白細胞的幹擾、消除假陽性和提高癌細胞診斷率。
第三，採用磁性分選技術從血液中分離獲得的EPCAM+細胞多數是腫瘤細胞，但其中含有少量正常上皮細胞的可能性還不能完全排除，因此尚需進一步鑑別。但經過磁性分選後得到的細胞數量很少，必須採用高度敏感的檢測技術才能分析。目前國外已有採用RT-PCR或IHC等技術分析俘獲的上皮細胞中癌細胞成分的成功報導，但這些分析方法的敏感性還可以進一步提高，例如，採用實時定量PCR技術至少能夠使檢測的敏感性提高100倍以上。
實時定量PCR是根據Taqman技術發展起來的一項新穎的基因檢測方法，其原理是將靶基因特異性的一組引物和螢光標記探針與模板cDNA進行雜交，然後在多聚酶鏈反應過程中利用Taq酶的3』-核酸外切酶活性水解探針3』-端的螢光淬滅基團，獲得螢光激發信號，後者與模板量呈正相關。應用這一技術可以從1-10pg RNA中檢測到靶基因mRNA的表達，由於1個細胞中至少含有10pg RNA，因而實時定量PCR的檢測極限可以達到1個細胞/樣本。
本發明提供了一種單個細胞實時定量PCR(Single Cell Quantitative Real-time PCR)技術，用於檢測hTERT基因表達，其檢測極限達到1個細胞/樣本，與常規PCR比較敏感性提高了100倍。
本發明另一方面還提供了一套PCR引物及探針，能夠特異性地擴增hTERT和內參照基因GAPDH的mRNA。具體而言，發明者根據Genbank資料庫中公開發表的hTERT(AF015950)和GAPDH(M33197)基因序列，採用美國賽百盛公司提供的引物設計軟體，根據端粒酶逆轉錄酶基因第1521-1819位核苷酸區間和第1657-1787位核苷酸區間分別設計了2組引物和探針，建立了hTERT和GAPDH的實時定量PCR檢測方法。
然而，本領域技術人員應當能夠理解，列舉上述具體的兩組引物和探針僅僅是為了描述本發明，它們並不起任何限制性的作用。本領域技術人員在閱讀了本說明書後，能夠採用常規的手段在端粒酶逆轉錄酶基因第1521-1819位核苷酸區間內通過適當選擇其他引物來合成DNA標準品，也能夠在端粒酶逆轉錄酶基因第1657-1787位核苷酸區間內選擇其它合適的引物和探針來達到本發明的目的。
實時定量PCR通常分為相對定量和絕對定量二類。相對定量分析以靶基因陽性表達的細胞作為標準，通過分析靶基因與內參照基因(如GAPDH等)的比值，獲得待測樣本中靶基因表達的相對值。這種方法的優點是容易開發，但所得的數值受陽性標準細胞的影響，不同的實驗室若採用不同的陽性細胞作為標準，則結果難以相互比較。絕對定量是採用拷貝數已知的DNA片段作為標準，該片段可採用基因克隆或PCR擴增獲得。由於絕對定量檢測是以一種可以標準化的DNA參照物作為基準，因而不同實驗室的檢測結果具有可比性。絕對定量PCR檢測技術是定量PCR的發展方向，近年來已被越來越多的研究者所採用。目前國外多採用相對定量PCR檢測癌細胞中hTERT mRNA表達，其局限性已被大家所認識。本發明採用絕對定量PCR方法較好地解決了上述問題。
癌細胞稀釋試驗顯示，該方法的檢測極限達到1個癌細胞/樣本，因而發明者將該技術稱為單個細胞實時定量PCR(Single Cell Quantitative Real-time PCR)。將該方法與常規PCR進行了比較，證明實時定量PCR檢測的敏感性可以提高100倍。此外，發明者應用該方法對10例正常肺組織和55例肺癌組織中hTERT mRNA含量進行了分析，確定了正常肺組織中hTERT基因表達的標準值。按此標準，肺癌組織中hTERT陽性表達率為69.1％。
另外，發明者對27例健康人和60例晚期肺癌病人血液中癌細胞進行了分析，結果顯示健康人血液經EPCAM特異性免疫磁性分選後未能檢出癌細胞，肺癌病人血液中癌細胞檢測陽性率為71.7％。說明本申請具有高度的特異性和敏感性，可以對血液中存在的微量癌細胞進行檢測。
以下藉助非限制性實施例詳細描述本發明。
實施例1單個細胞實時定量PCR檢測技術1.1材料與方法人體肺癌細胞株H460由美國德州大學MD Anderson癌症中心Paul J Chiao教授惠贈。胎牛血清及DMEM培養液為GIBCO公司產品。Trizol RNA抽提試劑盒購自上海申能博採生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas公司。PCR引物由上海申友生物技術有限責任公司合成。螢光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程公司。
根據Genbank資料庫中公開發表的hTERT(AF015950)和GAPDH(M33197)基因序列，採用美國賽百盛公司提供的引物設計軟體，分別設計了2組引物(表2)。
表2 PCR引物及探針序列
選擇活躍增殖期細胞按試劑盒要求抽提總RNA，採用紫外分光光度計(Biophotometer，德國Eppendorf公司)測定A260及A280。
取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應體積為20μl。
(1)實時定量PCR檢測(a)DNA標準品製備應用引物1對cDNA進行PCR擴增，擴增產物經PCR產物純化試劑盒(購自上海申能博彩公司)純化後採用紫外分光光度計測定雙鏈DNA含量，純化產物中的基因拷貝數按下述公式計算基因拷貝數/μl＝A260/13.2×片斷長度(kb)]×6.02×1011
(b)定量PCR反應母液10×PCR反應緩衝液2.5μl，250mM MgCl20.75μl，100mM上遊及下遊引物2各0.1μl(400nM)，50μM螢光素標記探針0.1μl(200nM)，10mM dNTP 0.5μl，熱啟動Taq酶(TaKaRa Ex Taq HS)0.25μl(1.25U)，加DEPC-H20至23μl。上述反應母液保存於-70℃。
(c)定量PCR反應液23μl反應母液中加入2μl cDNA。
(d)定量PCR反應條件50℃預熱300秒；95℃變性300秒；95℃20秒，60℃60秒，40個循環，60℃檢測；37℃30秒。
定量PCR儀為LightCycler(瑞士Roche公司)。
(2)常規PCR檢測PCR反應混合液與定量PCR同，不含螢光素標記探針，加石臘油30μl覆蓋。
PCR反應條件為95℃變性5min；95℃30s，60℃45s，72℃72s，35個循環；72℃延伸7min。
PCR產物經1.6％瓊脂糖電泳100V 30min，RB染色攝片。
1.2結果A、實時定量PCR的標準曲線在基因拷貝數為105-108範圍內，應用實時定量PCR檢測能夠給出線性結果，其標準曲線的相關係數R均＞0.999(見圖3和圖4)。此外，反應母液保存於-70℃條件下在6個月內非常穩定，不同實驗間誤差≤5％。
B、實時定量PCR與常規PCR結果比較將H460細胞稀釋至2×102/ml-2×107/ml，分別取50μl(內含10-100萬個癌細胞)抽提RNA並全部用於合成cDNA。取cDNA產物的1/10(2μl)進行常規PCR及定量PCR分析，比較二者的檢測敏感性。
圖1顯示了常規PCR的分析結果，表明該方法在100個癌細胞/樣本時可以觀察到產物條帶。
表3為採用定量PCR的分析結果，2次重複實驗顯示，在1-105細胞範圍內，hTERT基因表達值與細胞數量呈正相關(圖3)，檢測極限為1個癌細胞/反應。因而定量PCR的檢測敏感性較常規PCR提高100倍。
表3 H460細胞系列稀釋後定量PCR檢測hTERT基因表達
*hTERT mRNA拷貝數/反應實施例2肺癌組織hTERT基因表達的定量PCR分析2.1材料與方法55例非小細胞肺癌，男性42例，女性13例。所有腫瘤組織均經病理檢查證實，組織類型為腺癌22例，鱗癌20例，腺鱗癌13例。病理分期為I期18例，II期12例，III期25例。
10例正常肺組織取自距離肺癌病灶5cm以上的手術切除肺葉，經病理檢查不含癌組織。
實驗所用試劑及方法詳見實施例1。
2.2結果10例正常肺組織中hTERT表達值為4.33±2.41(單位拷貝數/103GAPDH拷貝)。55例肺癌組織中hTERT表達值為45.82±159.11。以正常肺組織hTERT均數+2標準差(10.0)作為陽性標準，則肺癌中hTERT陽性率為69.1％(38/55例)。
實施例3肺癌病人外周血微轉移癌細胞中hTERT基因表達的定量PCR分析3.1材料與方法60例IIIb-IV期肺癌患者，男性38例，女性22例，組織類型為腺癌55例，肺泡細胞癌5例，其中42例未接受過手術治療，20例為術後復發。
27例健康志願者，男性20例，女性7例，均為在校大學生。
所有人員均在知情同意下採集外周血5ml，10U/ml肝素抗凝。
血液樣本經1500rpm離心10min後去血漿，用生理鹽水加至5ml，然後每樣本中加入50μl EPCAM抗體交聯的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室溫下以30rpm轉速顛倒混勻2小時，按試劑盒要求分離陽性細胞組分。-70℃保存待測。
實驗所用試劑及方法詳見實施例1。
3.2結果27例健康人血液樣本中20例未檢測到GAPDH mRNA，表明經磁性分選後未獲得上皮細胞。7例樣本檢測到GAPDH基因表達，但hTERT mRNA低於陽性標準，說明所得的上皮細胞中不含癌細胞。
60例肺癌血液樣本11例未檢測到GAPDH mRNA表達，49例檢測到GAPDH基因表達，其中6例hTERT含量在陽性標準以下，其餘43例中hTERT含量高於陽性標準，癌細胞檢測陽性率為71.7％(43/60例)。
表4列舉了腫瘤原發組織和外周血癌細胞中hTERT基因表達的檢測結果。實驗結果揭示，hTERT的陽性檢出率在二者間基本相同。說明本申請具有高度的特異性和敏感性，可以對血液中存在的微量癌細胞進行檢測。
表4肺癌原發組織和外周血癌細胞hTERT基因表達分析
雖然上面結合實施例對本發明進行了具體描述，但是熟悉本領域的專業技術人員均了解，在不違背本發明的原則和精神的情況下，根據本說明書及所附權利要求書中公開的內容，可對本發明做出各種變動和改進。因此，所有這些變動和改進均應包括在所附權利要求書中所要求的保護範圍之內。
序列表110董，強剛120實時定量PCR檢測血液樣品中癌細胞的方法13004107016010170PatentIn version 3.1210121120212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4001cacatcgctc agacaccatg 20210221121212DNA213人工序列220
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221misc_feature223探針40010ggccaagttc ctgcactggc tga 2權利要求
1.一種體外檢測樣品中端粒酶逆轉錄酶的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟在端粒酶逆轉錄酶基因第1521-1819位核苷酸區間製備標準品；根據端粒酶逆轉錄酶基因第1657-1787位核苷酸區間設計引物及Tagman探針；用Taqman技術對端粒酶逆轉錄酶mRNA的拷貝數進行定量分析。
2.一種體外實時定量檢測血液樣品中癌細胞的方法，其特徵在於，它包括以下步驟用磁性分選技術從血液樣品中分離上皮細胞粘附分子陽性細胞；從上述細胞中抽提RNA並獲得cDNA；在端粒酶逆轉錄酶基因第1521-1819位核苷酸區間製備標準品；根據端粒酶逆轉錄酶基因第1657-1787位核苷酸區間設計引物及Tagman探針；用Taqman技術對端粒酶逆轉錄酶mRNA的拷貝數進行定量分析。
3.用於定量檢測血液樣品中癌細胞的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包含引物，DNA標準品和Taqman探針，其中所述引物及探針是根據端粒酶逆轉錄酶基因第1657-1787位核苷酸區間設計得到，所述DNA標準品根據端粒酶逆轉錄酶基因第1521-1819位核苷酸區間製得。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其中所述引物具有SEQ ID NO8、9所示的序列。
5.根據權利要求3所述的試劑盒，其中所述探針具有SEQ ID NO10所示的序列，且其5′端與螢光報告基團相連，3′端與螢光淬滅基團相連。
6.根據權利要求3所述的試劑盒，其中所述DNA標準品用具有SEQ ID NO6和7所示序列的引物擴增獲得。
全文摘要
本發明提供了一種體外定量檢測血液樣品中癌細胞的方法，它包括以下步驟用磁性分選技術從血液樣品中分離上皮細胞粘附分子陽性細胞；從上述細胞中抽提RNA並獲得cDNA；在端粒酶逆轉錄酶基因第1521－1819位核苷酸區間製備DNA標準品，在端粒酶逆轉錄酶基因第1657－1787位核苷酸區間設計引物及Tagman探針，用Taqman技術對端粒酶逆轉錄酶mRNA的拷貝數進行定量分析。本發明還提供了在體外檢測樣品中端粒酶逆轉錄酶的方法以及用於定量檢測血液樣品中癌細胞的試劑盒。
文檔編號C12Q1/25GK1673387SQ200410017149
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月24日 優先權日2004年3月24日
發明者董強剛 申請人:董強剛