一種基於螢光定量pcr檢測cyp2a6全基因缺失的方法

2023-05-13 19:57:51

一種基於螢光定量pcr檢測cyp2a6全基因缺失的方法
【專利摘要】本發明提供一種基於螢光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法，用於非疾病診斷目的。通過分別設計針對於CYP2A6基因和ALB基因的高特異性引物，利用螢光定量PCR技術來快速準確檢測CYP2A6全基因缺失的方法。其中，針對CYP2A6的引物探針組合為:Fp:5』-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3』；Rp:5』-GGAGGTGAACGCGGGA-3』；Probe:5』-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3』。
【專利說明】—種基於螢光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測CYP2A6全基因缺失的方法。
【背景技術】
[0002]CYP2A6基因是人細胞色素P450基因超家族的一員，其編碼的蛋白為一種重要的代謝酶，參與多種藥物及有毒化合物在人體內的代謝。CYP2A6基因在人群中表現出廣泛的多態性，其中CYP2A6全基因缺失在中國人群中的發生頻率為5% -15%。
[0003]替加氟以及以替加氟為主要活性成分的化合物是目前臨床上應用最為廣泛的抗嘧啶類藥物，對消化道腫瘤及等多種實體瘤均有良好治療效果。
[0004]大量研究表明，CYP2A6全基因缺失多態性與S_1和UFT等以替加氟為活性成分的藥物的藥效密切相關。未攜帶該多態性的患者相對於發生基因缺失的患者有更高的藥物應答率和更長的生存時間。此外，CYP2A6全基因缺失多態性與人對尼古丁的依賴性(菸癮)及多種癌症的易感性都有緊密的聯繫。
[0005]傳統檢測CYP2A6全基因缺失多態性的技術主要是PCR-凝膠電泳。這種方法成本低，重複性好，然而需要多次的PCR後處理，既操作複雜，又容易發生汙染而產生假性結果。SmartPCR技術很大程度上彌補了 PCR-凝膠電泳技術的不足之處，可以在短時間內檢測出CYP2A6全基因純合缺失，然而其無法檢測出CYP2A6全基因雜合缺失的樣本。
[0006]基於實時定量PCR技術對基因拷貝數進行定量的方法已成功應用於基因缺失的檢測技術。其基本原理是設計一套引物探針組合來特異性擴增待檢測的目的基因(靶基因)，同時設計一套引物探針組合來擴增一個在人基因組中保持拷貝數高度穩定的基因(內參基因)。在一次實時定量PCR反應中，同時對一個樣本的靶基因和內參基因進行擴增，並通過二者的擴增指標(Ct值)，計算二者拷貝數的比例。在未發生基因缺失的情況(也未發生異常擴增)，靶基因和內參基因的拷貝數比例應該是1:1，即兩種基因在基因組中均以正常二倍體的形式存在；而當靶基因發生雜合缺失的情況下，靶基因與內參基因的拷貝數比例應該是0.5: 1，即內參基因以正常二倍體的形式存在，而靶基因則只呈現出單倍體的狀態；而當靶基因發生純合缺失時，擴增靶基因的引物探針組合不能產生擴增信號，而內參基因的擴增則正常。在進行樣本檢測時，只需將一個未發生基因缺失的樣本作為對照(質控品)，則可以很清楚地判斷待檢測樣本是否發生了基因缺失，以及該缺失是雜合狀態還是純合狀態。
[0007]然而，該技術至今未見應用於CYP2A6全基因缺失的檢測；其根本原因是CYP2A6基因與CYP2A7基因及CYP2A13基因具有非常高的序列同源性(90%以上)，因而設計一套適宜於螢光定量PCR反應高特異性擴增CYP2A6基因的引物探針組合十分困難。

【發明內容】
[0008]本發明提供一種基於螢光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法，通過分別設計針對於CYP2A6基因和白蛋白基因(ALB)的高特異性引物，利用螢光定量PCR技術來快速準確檢測CYP2A6全基因缺失的方法。
[0009]為實現以上發明目的，本發明的技術方案如下。
[0010]該檢測方法包括以下環節:
[0011](I)基因特異性引物的設計
[0012]針對CYP2A6基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下:
[0013]Fp (上遊引物):5 』 -TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3 』
[0014]Rp (下遊引物):5 』 -GGAGGTGAACGCGGGA-3，
[0015]Probe (探針):5 』 -FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3 』
[0016]針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下:
[0017]Fp (上遊引物):5 』 -TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3 』
[0018]Rp (下遊引物):5 』 -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3 』
[0019]Probe (探針):5，-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3，
[0020]其中，FAM 為 6-carboxyfluorescein ；HEX % 6-carboxy-hexachlorof luorescein ；BHQ2 為 Black Hole Quencher-2
[0021](2)模板的製備:提取待測樣本的基因組DNA ；
[0022](3)實時定量PCR:針對環節⑴中的兩種特異性引物，建立被測樣本的檢測體系:
[0023]以反應體系總量20 μ L計，在同一個反應體系中，加入CYP2A6基因特異性上遊引物250ηΜ-500ηΜ、下遊引物250ηΜ_500ηΜ、探針100ηΜ_200ηΜ、以及ALB基因特異性上遊引物250ηΜ-500ηΜ、下遊引物 250ηΜ_500ηΜ、探針 100nM_200nM、2 XMastermixlO μ L、被測樣本基因組DNA約10-50ng，使用PCR等級的H2O補足體積20 μ L ;
[0024](4)結果判定:將配製好的各反應體系在螢光實時定量PCR儀上進行擴增，根據儀器給出的兩基因的擴增指標(Ct值)來進行結果判定。
[0025]上述擴增過程的最佳擴增參數為:95°C，2~15min，不循環；95°C，5~lOsec，60°C,20-30sec,68°C,20 ~30sec，共計 35 ~40 個循環。
[0026]對結果的判定分兩種情況進行:
[0027]第一種情況，若樣本在FAM通道和HEX通道均呈現正常擴增，則根據儀器給出的樣本在兩個通道的Ct值(FAM通道Ct值指代CYP2A6擴增，HEX通道Ct值指代ALB擴增)來判定該樣本的基因型，計算公式如下:Ratio(S) = 2Μ(εgammaρ2Α6)_α(Α?Β)。同時將已通過可靠技術檢測過確定為未攜帶CYP2A6全基因缺失多態性的樣本作為質控品，參照上述Ratio(S)公式求得質控品兩基因的拷貝數比例Ratio(C)，然後進一步求得待測樣本Ratio(C):Ratio(S)的值，即為r值。
[0028]若r值範圍在0.90~1.10範圍內，則該樣本未攜帶有CYP2A6全基因缺失多態性；[0029]若r值範圍在0.5~0.6範圍內，則該樣本為CYP2A6全基因雜合缺失。
[0030]第二種情況，若樣本在FAM通道沒有擴增，而在HEX通道擴增情況正常，則表明該樣本中沒有CYP2A6基因存在，即該樣本的基因型為CYP2A6全基因純合缺失；第二種情況實際上為第一種情況中的特殊例，即此時樣本的Ratio(S)為無窮大，其r值為O。
[0031]相應的，本發明還提供一種用於螢光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的試劑盒，當中包括權利要求1中所述的針對CYP2A6基因設計的序列特異性引物探針組合、針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合、以及2XMastermix和H20。
[0032]具體以試劑盒中的試劑總量20 μ L計，各試劑的較佳用量分別為:CYP2A6基因特異性上遊引物250nM-500nM、下遊引物250nM_500nM、探針100nM_200nM、以及ALB基因特異性上遊引物 250nM-500nM、下遊引物 250nM_500nM、探針 100nM_200nM、2 XMastermixlO μ L，H2O補足體積20 μ L。
[0033]本發明的有益效果如下:
[0034]1.簡單易行。本發明中只需一個反應便可以準確檢測出待測樣本的CYP2A6全基因缺失情況。
[0035]2.避免假性結果產生。在本發明中，針對CYP2A6基因設計的特異性引物具有很高的序列特異性，可以完全消除CYP2A7基因及CYP2A13基因序列同源性對PCR反應的幹擾；同時沒有PCR後操作，避免了交叉汙染，二者共同保證了檢測的準確性，避免了假性結果的產生。
[0036]3.靈敏度高。在本發明中，只需IOng基因組DNA便可以進行準確的CYP2A6全基因缺失檢測，相比於傳統的技術，大大提高了檢測的靈敏度。 [0037]4.節省耗材和時間。基於本實驗中設計和PCR反應的特點，使得該方法可以很大程度上節省實驗時間和耗材，檢測過程只需要60min，整個實驗也可以在4小時內全部完成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為本發明所設計的CYP2A6基因特異性及探針的示意圖。
[0039]圖2為本發明分別檢測一例CYP2A6全基因純合缺失樣本和未攜帶CYP2A6全基因缺失多態性樣本的結果圖。
[0040]圖3為本發明檢測5個樣本CYP2A6全基因缺失的結果圖。
[0041]圖4為本發明檢測40例DNA樣本CYP2A6全基因缺失所得到的統計結果。
【具體實施方式】
[0042]本發明提供一種基於螢光定量PCR快速準確檢測CYP2A6全基因缺失的方法，即通過分別設計針對於CYP2A6基因和ALB(作為內參基因)的高特異性引物，利用螢光定量PCR技術來快速準確檢測CYP2A6全基因缺失的方法。
[0043]請參閱圖1所示，本發明所設計的CYP2A6基因的特異性引物及探針組合。我們利用CYP2A6基因與CYP2A7及CYP2A13基因序列上細微差別，基於引物3』末端序列決定其延伸效率的原理，設計出一套可以高特異性擴增CYP2A6基因的引物探針組合。利用該組合進行實時定量PCR，既可以高效的擴增出CYP2A6基因，又可以完全避免CYP2A7及CYP2A13基因對反應特異性的幹擾。
[0044]該方法包括以下環節:
[0045](I)基因特異性引物的設計:
[0046]針對CYP2A6基因設計的序列基因特異性引物探針組合，序列如下:
[0047]Fp (上遊引物):5 』 -TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3 』[0048]Rp (下遊引物):5 』 -GGAGGTGAACGCGGGA-3，
[0049]Probe (探針):5，-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3 』
[0050]針對ALB基因設計的序列基因特異性引物探針組合，序列如下:
[0051 ] Fp (上遊引物):5，-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3 』
[0052]Rp (下遊引物):5 』 -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3 』
[0053]Probe (探針):5，-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3，
[0054]其中，FAM 為 6-carboxyfluorescein ；HEX % 6-carboxy-hexachlorof luorescein ；BHQ2 為 Black Hole Quencher-2。
[0055](2)模板的製備:提取待測樣本的基因組DNA。
[0056](3)實時定量PCR:針對步驟(1)中的兩種特異性引物，建立被測樣本的檢測體系:
[0057]每個被測樣本的反應體系為20 μ L0在同一個反應體系中，加入CYP2A6基因特異性上遊引物250ηΜ-500ηΜ、下遊引物250ηΜ_500ηΜ、探針100ηΜ_200ηΜ、加入ALB基因特異性上遊引物 250ηΜ-500ηΜ、下遊引物 250ηΜ_500ηΜ、探針 100nM_200nM、2XMastermixlO μ L、被測樣本基因組DNA約10-50ng，使用PCR等級的H2O補足體積20 μ L ;
[0058](4)結果判定:將配製好的各反應體系在螢光實時定量PCR儀上進行擴增，擴增過程的參數為:95°C，2 ~15min，不循環；95°C，5 ~lOsec，60°C，20_30sec，68°C，20 ~30sec，共計35~40個循環。根據儀器給出的兩基因的擴增指標(Ct值)來進行結果判定。對結果的判斷分兩種情況進行:
[0059]第一種情況，若樣本在FAM通道和HEX通道均呈現正常擴增，則根據儀器給出的樣本在兩個通道的Ct值(FAM通道Ct值指代CYP2A6擴增，HEX通道Ct值指代ALB擴增)來判定該樣本的基因型，計算公式如下:Ratio(S) = 2ct(GYP2A6)-ct(ALB)0同時將已通過可靠技術檢測過確定為未攜帶CYP2A6全基因缺失多態性的樣本作為質控品，根據上述公式求得質控品兩基因的拷貝數比例Ratio(C)，然後進一步求得待測樣本Ratio(C):Ratio(S)的值，即為r值。
[0060]若r值範圍在0.90~1.10範圍內，則該樣本未攜帶有CYP2A6全基因缺失多態性；
[0061]若r值範圍在0.5~0.6範圍內，則該樣本為CYP2A6全基因雜合缺失。
[0062]第二種情況，若樣本在FAM通道沒有擴增，而在HEX通道擴增情況正常，則表明該樣本中沒有CYP2A6基因存在，即該樣本的基因型為CYP2A6全基因純合缺失；第二種情況實際上為第一種情況中的特殊例，即此時樣本的Ratio(S)為無窮大，其r值為O。
[0063]請參閱圖2所示，利用本發明所設計的檢測反應體系，對一例已知基因型為CYP2A6全基因純合缺失的樣本和一例未攜帶有CYP2A6全基因缺失多態性的樣本進行檢測。從圖中可以清晰的看出，CYP2A6全基因純合缺失的樣本在FAM通道沒有擴增，而在HEX通道的呈現出正常的擴增情況；而未攜帶有CYP2A6全基因缺失多態性的樣本則在FAM和HEX兩個通道均呈現正常的擴增情況。
[0064] 請參閱圖3所示，利用本發明所設計的體系，對5例已知基因型的樣本進行驗證，其中編號2、3、4、5的樣本未攜帶CYP2A6全基因缺失(其中2號樣本作為質控品)，而編號I的樣本為CYP2A6全基因雜合缺失。從實驗結果中可以清楚看到，本發明所建立的方法可以準確的區別未攜帶CYP2A6全基因缺失多態性的樣本和CYP2A6全基因雜合缺失的樣本。
[0065]請參閱圖4所示，利用本發明對40例已知基因型的DNA樣本進行檢測，其中35例為未攜帶CYP2A6全基因缺失多態性的樣本，4例為CYP2A6全基因雜合缺失的樣本，I例為CYP2A6全基因純合缺失的樣本。本發明檢測結果與實際基因型完全符合，其中4例CYP2A6全基因雜合缺失的樣本的r值為0.53-0.56，而35例未攜帶CYP2A6全基因缺失多態性的樣本 r 值 為 0.91-1.10。
【權利要求】
1.一種基於螢光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法，用於非疾病診斷目的，包括以下環節: (1)基因特異性引物的設計: 針對CYP2A6基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下: 上遊引物:5 』 -TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3， 下遊引物:5 』 -GGAGGTGAACGCGGGA-3，
探針:5』 -FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3』 針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下: 上遊引物:5 』 -TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3， 下遊引物:5 』 -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3，
探針:5』 -HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3』
其中，FAM 為 6-carboxyfluorescein ；HEX 為 6-carboxy-hexachlorofIuorescein ；BHQ2 為 Black Hole Quencher-2 ； (2)|吳板的製備:提取待測樣本的基因組DNA ； (3)實時定量PCR: 以反應體系總量20 μ L計，在同一個反應體系中，加入CYP2A6基因特異性上遊引物250ηΜ-500ηΜ、下遊引物250ηΜ_500ηΜ、探針100ηΜ_200ηΜ、以及ALB基因特異性上遊引物250ηΜ-500ηΜ、下遊引物 250ηΜ_500ηΜ、探針 100nM_200nM、2XMastermixlO μ L、待測樣本的基因組DNA10-50ng，H2O補足體積20 μ L ; (4)結果判定:將配製好的反應體系在螢光實時定量PCR儀上進行擴增，根據儀器給出的兩基因的擴增指標進行結果判定。
2.根據權利要求1所述的基於螢光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法，其特徵在於，螢光實時定量PCR儀上進行的擴增過程的擴增參數為:95°C，2~15min，不循環；95°C，5 ~10sec，6(TC，20-30sec，68t:，20 ~30sec，共計 35 ~40 個循環。
3.一種用於螢光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的試劑盒，其特徵在於:包括權利要求I中所述的針對CYP2A6基因設計的序列特異性引物探針組合、針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合、以及2 XMastermix和H20。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於:以試劑盒中的試劑總量20μ L計，CYP2A6基因特異性上遊弓丨物250ηΜ-500ηΜ、下遊引物250ηΜ_500ηΜ、探針100ηΜ_200ηΜ、以及ALB基因特異性上遊引物250ηΜ-500ηΜ、下遊引物250ηΜ_500ηΜ、探針100ηΜ_200ηΜ、2XMastermixlO μ L, H2O 補足體積 20 μ L。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004852SQ201410270207
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月17日 優先權日:2014年6月17日
【發明者】戴鵬高, 尋曉潔, 陳超, 鄒暉 申請人:陝西佰美基因股份有限公司