一種水稻快速遺傳轉化的方法
2023-05-16 13:43:16
專利名稱：一種水稻快速遺傳轉化的方法
技術領域：
本發明是水稻轉基因技術領，具體是利用水稻成熟胚初級愈傷組織進行農桿菌轉化，大大縮短水稻轉基因周期的方法。
背景技術：
水稻既是一種重要的農作物，同時又是植物研究中的模式生物，自1984年世界上第一例轉基因菸草取得成功以來，水稻的轉基因工作一直成為科學家們努力的目標，直到 1994年第一例農桿菌轉化水稻才用確鑿的證據證實取得了成功，水稻的農桿菌轉化之所以起步很晚，主要是因為單子葉植物象水稻、玉米不是農桿菌的天然宿主，自然條件下農桿菌不能夠浸染水稻，但是經過數十年的努力，轉化方法和體系的不斷優化，特別是在培養基中添加了酚類物質乙醯丁香酮(AS)，使農桿菌轉化水稻取得了成功。目前水稻已經成為研究植物遺傳轉化的模式植物，水稻轉基因得到了很大的發展，為水稻和其他生物的功能基因組研究提供了強有力的工具。但是到目前為止，水稻的這種經典農桿菌介導轉基因方法，都是從愈傷組織誘導開始，仍然需要5-6個月的時間，這個周期對於研究者來說是十分漫長的，轉基因水稻工作還是一個長期、複雜的過程，並且轉化效率很大程度上依賴於水稻的基因型，特別是中國廣泛栽培的秈稻，大部分品種的遺傳轉化還是十分困難。另外對於對多個基因同步轉化工作來說，常規的轉化方法需要很大的空間以及轉化成本都大大的增加，因此建立一種周期短，基因型依賴小的遺傳轉化方法將對水稻的遺傳提供有力保障。近些年來，已經有文獻報導通過一些方法的改進可以縮短水稻農桿菌遺傳轉化的時間。但是這種遺傳轉化大部分針對一些較容易轉化的品種，實驗方法只限於少數一些品種，特別是對秈稻的轉化比較困難，又或者是操作步驟複雜，並沒有被廣大研究者所接受和推廣。但是對於從事水稻轉基因工作的科研者來說，縮短轉基因水稻的周期，不僅僅可以節省空間和實驗成本，更可以大大減少實驗工作量和加快實驗進程。因為本實驗室需要轉化大量的表達載體，而且轉化的品種又是一般的普感水稻品種，實驗的性質需要一種快速的、 便捷的農桿菌轉化方法。
發明內容
本發明提供一種通過農桿菌浸染培養時間較短的愈傷組織，直接進行選擇篩選培養，最後分化成苗的水稻快速遺傳轉化的方法。本方法主要通過以下技術方案實現一種水稻快速遺傳轉化的方法，在光照條件下培養水稻成熟種子誘導愈傷組織，選用初級愈傷組織作為農桿菌浸染的受體，直接在選擇培養基上篩選獲得抗性愈傷組織，抗性愈傷組織分化出抗性植株，煉苗、移栽獲得轉基因水稻。包括以下具體步驟
(1)首先剝去水稻種子穎殼，利用次氯酸鈉和酒精對種子進行消毒；
(2)在光照條件下，在誘導培養基上誘導水稻成熟胚愈傷組織；(3)在誘導8-12d後，初級愈傷組織直接作為農杆浸染的受體；
(4)在光照培養下，愈傷組織轉移到選擇培養基上繼續培養；
(5)獲得抗性愈傷組織，不經過繼代培養，直接把抗性愈傷組織轉入分化培養基；
(6)將產生抗性植株再進行生根培養，然後煉苗、移栽，即可獲得轉基因水稻植株。作為本發明的優選方案，培養條件為30°C全光照。在步驟(1)中用2. 5%的次氯酸鈉(含0. 1%的吐溫20)，倒去消毒液，然後70%酒精消毒2min，無菌水洗4-6次。初級愈傷侵染後經30d潮黴素抗性篩選，獲得的抗性愈傷組織直接進行分化培養30d。與已有技術相比，本發明的優點體現在
1.本發明大大縮短了水稻轉基因的周期，常規的水稻轉基因體系，一般經過30d的誘導，45d的繼代培養，45d的選擇和30d的分化培養，整個周期耗時150d左右，而本發明轉化周期只需90d左右，比原有方法轉化時間減少2個月左右。本發明簡化了水稻遺傳轉化的步驟，常規的水稻遺傳轉化，一般都是^rc下暗培養，然後再進行^rc光培養，比較繁瑣，本發明採用3o°c下全光照培養，不需要更換培養條件，簡化流程，省時省力。本發明對水稻品種的依賴性不強，不僅對粳稻的轉化適用，同時對秈稻的轉化同樣適用。
具體實施例方式1.種子的消毒方法
用2. 5%的次氯酸鈉(含0. 1%的吐溫20)，倒去消毒液，然後70%酒精消毒2min，無菌水洗4-6次。把不同消毒方法消毒後的種子分別放置在相同的YN誘導培養基上，然後在30°C 全光照進行培養，5d後進行汙染瓶數的統計，IOd天后觀察記錄愈傷組織的誘導情況。升汞消毒後的種子，芽生長的很旺盛，但是愈傷組織卻長的很小，有些種子沒有形成愈傷組織， 只是有綠苗出現。但是次氯酸鈉消毒以後，大部分的種子都已經形成膨大的愈傷組織，種子萌發的芽苗已經萎縮，變的很小。同時對誘導率進行了統計，同時接種200粒種子，升汞消毒後的愈傷組織誘導率是42. 9%，而次氯酸鈉消毒後的誘導率是70. 5%，兩者差異十分顯著。所以綜合汙染率和愈傷組織誘導率兩種因素，選擇2. 5%次氯酸鈉(添加0. 1%吐溫20) 消毒15min、70%酒精消毒aiiin為適宜的消毒方式。所以在愈傷組織的誘導過程中，次氯酸鈉與酒精的複合消毒更加徹底，可以顯著減少汙染。2.轉化體系所用的培養基
表1.所用的培養基成分
權利要求
1.一種水稻快速遺傳轉化的方法，其特徵在於，在光照條件下培養水稻成熟種子誘導愈傷組織，選用初級愈傷組織作為農桿菌浸染的受體，直接在選擇培養基上篩選獲得抗性愈傷組織，抗性愈傷組織分化出抗性植株，煉苗、移栽獲得轉基因水稻。
2.根據權利1所述的水稻快速遺傳轉化的方法，其特徵在於，包括以下具體步驟(1)首先剝去水稻種子穎殼，利用次氯酸鈉和酒精對種子進行消毒；(2)在光照條件下，在誘導培養基上誘導水稻成熟胚愈傷組織；(3)在誘導8-12d後，初級愈傷組織直接作為農杆浸染的受體；(4)在光照培養下，愈傷組織轉移到選擇培養基上繼續培養；(5)獲得抗性愈傷組織，不經過繼代培養，直接把抗性愈傷組織轉入分化培養基；(6)將產生抗性植株再進行生根培養，然後煉苗、移栽，即可獲得轉基因水稻植株。
3.根據權利1或2所述的水稻快速遺傳轉化的方法，其特徵在於，培養條件為30°C全光照。
4.根據權利2所述的水稻快速遺傳轉化的方法，其特徵在於，在步驟(1)中用2.5%的次氯酸鈉，2. 5%的次氯酸鈉中含0. 1%的吐溫20，倒去消毒液，然後70%酒精消毒aiiin，無菌水洗4-6次。
5.根據權利2所述的水稻快速遺傳轉化的方法，其特徵在於，初級愈傷侵染後經30d潮黴素抗性篩選，獲得的抗性愈傷組織直接進行分化培養30d。
全文摘要
本發明公開了一種水稻快速遺傳轉化的方法，在光照條件下培養水稻成熟種子誘導愈傷組織，選用初級愈傷組織作為農桿菌浸染的受體，直接在選擇培養基上篩選獲得抗性愈傷組織，抗性愈傷組織分化出抗性植株，煉苗、移栽獲得轉基因水稻。本發明大大縮短了水稻轉基因的周期，比原有方法轉化時間減少2個月左右。本發明簡化了水稻遺傳轉化的步驟，採用30℃下全光照培養，不需要更換培養條件，簡化流程，省時省力。本發明對水稻品種的依賴性不強，不僅對粳稻的轉化適用，同時對秈稻的轉化同樣適用。
文檔編號A01H5/00GK102174565SQ20111004068
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月20日 優先權日2010年11月12日
發明者周玉瓊, 唐秀麗, 張小輝, 朱蘇文, 江海洋 申請人:安徽農業大學