芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速製備方法

2023-05-16 02:24:46 2

專利名稱：芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速製備方法
技術領域：
本發明涉及一種芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速製備方法。
背景技術：
芹菜「Apium graveolens L. 」又名香芹、旱芹，是傘形科一年生或兩年生草本植 物，喜肥沃土壤，全國和世界各地均有栽培。芹菜籽為傘形科植物旱芹的乾燥成熟果實，已 記載於《中華人民共和國衛生部 維吾爾藥分冊》和《維吾爾藥志》等書籍，是 新疆資源豐富的藥食兼用植物資源。維吾爾醫認為芹菜籽能消除寒溼閉阻，消食健胃，消腫 散氣，消石止痛，調和百藥，增強瀉藥的功能，振奮性慾。用於寒溼性大小關節痛疼，頸項疼 痛，脅肋疼痛，體內結石，嘔吐血痢，小便不通，月事不行，死胎不下以及內臟寒溼性病變。維 吾爾醫藥臨床表明，芹菜籽有散氣、消腫、利尿、開通阻滯、降血壓等功效，在維吾爾藥中主 要用於治療高血壓病、關節炎、類風溼關節炎、氣滯性子宮炎、腹水、腎臟等疾病。蛋白質是人體的重要組成部分，也是人類飲食結構的重要成分。近來的研究結果 表明，小分子量的多肽更容易被人體吸收，具有對人體有益的各種生理功能。抗氧化性多 肽是生物活性肽的一種，通過減少氧自由基、羥自由基從而達到抗衰老的功能，使用安全性 高。同時還能防止油脂氧化，作為抗氧化劑使用時，這類多肽安全、高效，無助氧化作用。目 前食品工業中使用的抗氧化劑大多是人工合成的化學抗氧化劑，對人體有一定的毒害作 用，使人們對其安全性產生憂慮。而抗氧化活性肽逐漸顯示出其在醫藥、食品、化妝品、飼料 等領域應用的優勢。目前，抗氧化肽在農業、醫藥、食品和化妝品等領域已經有了一定的應用實踐並取 得了較好的效果。近年來的研究發現自由基可以導致脂質過氧化，損傷蛋白質、脫氧核糖、 機體細胞等，從而引發一系列疾病，如心血管疾病、白內障、老年痴呆、癌症等。而抗氧化多 肽具有清除自由基、防止脂質過氧化的功效，可作為一種基料添加到功能性食品中，起到防 止各種疾病發生的作用。另外，抗氧化性多肽可以應用於化妝品行業，作為一些修復型化妝 品的添加劑，如營養霜和面膜，可以快速恢復皮膚的光澤與彈性，減少皺紋，對延緩衰老起 著積極的作用；用於護髮，有很好的光澤效果和高效的保護作用，可使頭髮免受環境條件和 化學因素的破壞。由於抗氧化多肽的分子小，所以直接從動植物組織中提取天然抗氧化多肽時，天 然提取資源有限，工藝複雜，成本昂貴。如何提高生產效率、降低成本成為抗氧化多肽的問 題。在國內植物多肽類化合物的研究尚處於初始階段，研究範圍小，對於多肽類化合物的化 學研究文獻很有限，而且使用的方法中植物多肽類化合物回收低，不適用於大規模製備，這 很大程度上限制了抗氧化多肽類活性化合物的應用和工業化生產。因此，尋找安全高效的 抗氧化替代品就顯得十分重要。

發明內容
本發明目的在於，提供一種芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速製備方法，該方法通過磷酸緩衝溶液提取、硫酸銨沉澱、以及陰離子交換樹脂DEAE柱吸附、洗脫等步驟分離得 到具有抗氧化活性的多肽，為維吾爾藥食兩用植物芹菜籽的生物活性物質基礎研究，並開 發相應的產品提供了依據。該方法提取、分離過程簡單，又不易使多肽失活，製備的多肽抗 氧化活性高，無毒性、熱穩定性好，易於擴大規模生產，降低純化過程成本，是製備生物活性 多肽的理想方法之一。通過該方法獲得的多肽作為製備食品、藥品以及化妝品添加劑的用 途。本發明所述的一種芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速製備方法，按下列步驟進行a、將脫脂芹菜籽用液氮研磨，再用磷酸緩衝液在溫度4°C攪拌提取，時間為1-8小 時，過濾，將濾液用低溫離心機除去沉澱，得到上清液備用；b、將上清液加入無水硫酸氨，充分攪拌溶解後放置冰箱靜置24小時，離心，沉澱， 將沉澱物採用透析脫鹽後，乾燥得到粗提多肽；C、將粗提多肽用乙酸銨緩衝液溶解，離心，濾液再用乙酸銨緩衝液稀釋，經陰離子 交換樹脂DEAE柱，將吸附物用含有乙酸銨的氯化鈉溶液洗脫，所得溶液透析脫鹽，低溫幹 燥，即可得到抗氧化多肽；d、再利用常規方法十二烷基磺酸鈉-PAAG確定提取的多肽的成分及其分子量，對 分離的多肽進行抗氧化活性即2，2』 -聯氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)自由基清 除來確定多肽的抗氧化活性。步驟a、b和c中的提取、分離、純化過程所用水均為三蒸水。步驟a、b和c中的低溫離心速度為12000轉/分。步驟a中磷酸鹽緩衝溶液的濃度為0. 01-0. lmol/L, pH = 6. 0-8. 0。步驟b中無水硫酸銨飽和度為30 % -80 %。步驟d中乙酸銨緩衝溶液的濃度為0. 01-0. 05mol/L, pH = 8. 0-9. 0。所述的方法獲得的芹菜籽抗氧化多肽作為製備食品或化妝品的添加劑的用途。


圖1為本發明芹菜籽抗氧化多肽的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳圖， 其中0號為標準蛋白標記，甲狀旁腺激素(1-34) (4. IkDa)，抑肽酶(6. 5kDa)，甲狀旁腺 激素(1-84) (9. 5kDa)，溶菌酶(14. 4kDa)，胰蛋白酶抑制劑(20. OkDa)，磷酸丙糖異構酶 (27. OkDa)，豬胃蛋白酶(35. OkDa)，卵清蛋白(45. OkDa)，牛血清白蛋白(66. OkDa) ；1號為 芹菜籽抗氧化多肽。
具體實施例方式實施例1多肽的提取取100克脫脂的芹菜籽用液氮研磨，再用濃度為0. lmol/L, pH = 6. 0的磷酸緩衝 液在溫度4°C攪拌提取1小時，將提取液先用紗布過濾，將濾液用低溫離心速度為12000轉 /分除去沉澱，得到上清液備用；多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為30%，充分攪拌溶解後放入於冰箱中靜置24小時，離心速度為12000轉/分，沉澱，將沉澱物採用透析脫鹽，乾燥，得到粗提 多肽；將粗提多肽用pH 9. 0，濃度為0. 01mol/L的乙酸銨緩衝液溶解，離心速度為12000 轉/分，濾液再用乙酸銨緩衝液稀釋，經過已平衡好的陰離子交換樹脂DEAE柱，將吸附物用 含有乙酸銨的氯化鈉溶液(即在乙酸銨溶液中加入氯化鈉)洗脫，所得溶液透析脫鹽，經低 溫乾燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。所述的方法獲得的芹菜籽抗氧化多肽作為製備食品或化妝品的添加劑的用途。實施例2多肽的提取取100克脫脂的芹菜籽用液氮研磨，再用濃度為0. 08mol/L,pH = 7. 0的磷酸緩衝 液在溫度4°C攪拌提取4小時，將提取液先用紗布過濾，濾液用低溫離心速度為12000轉/ 分除去沉澱，得到上清液備用；多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為40%，充分攪拌溶解後放入於冰 箱中靜置24小時，離心速度為12000轉/分，沉澱，將沉澱物採用透析脫鹽，乾燥，得到粗提 多肽；將得到的粗提多肽用pH 8. 2，濃度為0. 02mol/l的乙酸銨緩衝液溶解，離心速度 為12000轉/分，濾液再用乙酸銨緩衝液稀釋，經過已平衡好的陰離子交換樹脂DEAE柱，將 吸附物用含有乙酸銨的氯化鈉溶液(即在乙酸銨溶液中加入氯化鈉)洗脫，所得溶液透析 脫鹽，經低溫乾燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。所述的方法獲得的芹菜籽抗氧化多肽作為製備食品或化妝品的添加劑的用途。實施例3多肽的提取取100克脫脂的芹菜籽用液氮研磨，再用濃度為0. 05mol/L,pH = 8. 0的磷酸緩衝 液在溫度4°C攪拌提取6小時，將提取液先用紗布過濾，濾液用低溫離心速度為12000轉/ 分除去沉澱，得到上清液備用；多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為50%，充分攪拌溶解後放入於冰 箱中靜置24小時，離心速度為12000轉/分，沉澱，將沉澱物採用透析脫鹽，乾燥，得到粗提 多肽；將得到的粗提多肽用pH 8. 7，濃度為0. 04mol/l的乙酸銨緩衝液溶解，離心速度 為12000轉/分，濾液再用乙酸銨緩衝液稀釋，經過已平衡好的陰離子交換樹脂DEAE柱，將 吸附物用含有乙酸銨的氯化鈉溶液(即在乙酸銨溶液中加入氯化鈉)洗脫，所得溶液透析 脫鹽，經低溫乾燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。所述的方法獲得的芹菜籽抗氧化多肽作為製備食品或化妝品的添加劑的用途。實施例4多肽的提取取100克脫脂的芹菜籽用液氮研磨，再用濃度為0. 01mol/L,pH = 7. 5的磷酸緩衝 液在溫度4°C攪拌提取8小時，將提取液先用紗布過濾，濾液用低溫離心速度為12000轉/分除去沉澱，得到上清液備用；多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為60%，充分攪拌溶解後放入於冰 箱中靜置24小時，離心速度為12000轉/分，沉澱，將沉澱物採用透析脫鹽，乾燥，得到粗提 多肽；將得到的粗提多肽用pH 8. 4，濃度為0. 05mol/l的乙酸銨緩衝液溶解，離心速度 為12000轉/分，濾液再用乙酸銨緩衝液稀釋，經過已平衡好的陰離子交換樹脂DEAE柱，將 吸附物用含有乙酸銨的氯化鈉溶液(即在乙酸銨溶液中加入氯化鈉)洗脫，所得溶液透析 脫鹽，經低溫乾燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。所述的方法獲得的芹菜籽抗氧化多肽作為製備食品或化妝品的添加劑的用途。實施例5多肽的提取取100克脫脂的芹菜籽用液氮研磨，再用濃度為0. 03mol/L,pH = 6. 5的磷酸緩衝 液在溫度4°C攪拌提取7小時，將提取液先用紗布過濾，濾液用低溫離心速度為12000轉/ 分除去沉澱，得到上清液備用；多肽的分離將上清液根據體積添加無水硫酸氨至其飽和度為80%，充分攪拌溶解後放入於冰 箱中靜置24小時，離心速度為12000轉/分，沉澱，將沉澱物採用透析脫鹽，乾燥，得到粗提 多肽；將得到的粗提多肽用pH 8. 0，濃度為0. 03mol/l的乙酸銨緩衝液溶解，離心速度 為12000轉/分，濾液再用乙酸銨緩衝液稀釋，經過已平衡好的陰離子交換樹脂DEAE柱，將 吸附物用含有乙酸銨的氯化鈉溶液(即在乙酸銨溶液中加入氯化鈉)洗脫，所得溶液透析 脫鹽，經低溫乾燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。實施例6通過本發明所述方法獲得的芹菜籽抗氧化多肽進行分子量範圍的確定試劑配製及樣品處理樣品緩衝液0. 5mL的0. 5mol/L的三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(pH 6. 8)、2mL的 10%十二烷基磺酸鈉、ImL甘油、0. 5mL的β -巰基乙醇、ImL的水、微量的溴酚藍；樣品的處理樣品溶液和樣品緩衝液等體積混合，隔水煮沸lOmin，離心IOmin ；電極緩衝液將15. 1克三羥甲基氨基甲烷、94克甘氨酸、50mL的10%十二烷基磺 酸鈉溶解並定容至4L。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳儲存液30% (W/V)丙烯醯 胺、0. 8% (ff/V)N, N，-甲叉雙丙烯醯胺；15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳的分離膠配製1. lmL&H20、2. 5mL的 30% (V/V)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳儲存液、1. 3mL的1. 5mol/L的三羥甲基 氨基甲烷-氯化氫(pH 8. 8)、0. 05mL的10% (W/V)十二烷基磺酸鈉、0. 05mL的10% (W/V) 過硫酸銨、0. 002mL的N，N，N' , N'-四甲基乙二胺；5%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳的分離膠配製0. 68mL的H20、0. 17mL 的30% (V/V)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳儲存液、0. 13mL的0. 5mol/L的三羥 甲基氨基甲烷_氯化氫(pH 6. 8)、0. OlmL的10% (W/V)十二烷基磺酸鈉、0. OlmL的10%(W/V)過硫酸銨、0. OOlmL的N，N, N' ,N'-四甲基乙二胺；電泳條件恆壓100伏，電泳時間約2小時。考馬斯亮藍脫色液25%無水乙醇、8%的冰乙酸。考馬斯亮藍染色液將0. 6克的考馬斯亮藍G-250溶解在300mL的脫色液中，過 濾，棕色瓶儲存；電泳結束後將凝膠片置於考馬斯亮藍染色液中4h，再用脫色液浸泡至背景色褪色 完全為止。實施例7通過本發明所述方法獲得的芹菜籽抗氧化多肽活性的確定將5mL的2,2』-聯氮-雙_(3_乙基苯並噻唑啉_6_磺酸)(簡稱Abts) (19. 2mg) 與88 μ L的7mmoL/L的過硫酸鉀水溶液混合，在室溫，避光的條件下靜置過夜，形成2， 2』 -聯氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)自由基儲備液，該儲備液在室溫，避光的條 件下穩定，使用前用磷酸鹽緩衝溶液釋放成工作液，要求其在30°C，734nm波長下的吸光度 為 0. 7+0. 02。將所得的芹菜籽抗氧化多肽用0. 1M，pH = 8. 7的磷酸鹽緩衝溶液配成溶液， 取10 μ L的多肽溶液，並加入6 μ L的磷酸鹽緩衝溶液，再加入184 μ L的2，2』 -聯 氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)自由基工作液，準確振30秒，在20°C下測定反應液 在734nm處5min的吸光值。實驗以Vc為陽性對照，設試劑空白，樣品空白和樣品實驗組。根據樣品的吸光值、樣品空白和試劑空白的吸光值，計算所得多肽對2，2』 _聯 氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)自由基清除的IC50濃度。IC50濃度為當樣品對 2，2』-聯氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)自由基清除率達到50%時，所需的樣品濃 度。表1所得多肽的IC50濃度(清除Abts自由基的IC50)
權利要求
一種芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速製備方法，其特徵在於按下列步驟進行a、將脫脂芹菜籽用液氮研磨，再用磷酸緩衝液在溫度4℃攪拌提取，時間為1 8小時，過濾，將濾液用低溫離心機除去沉澱，得到上清液備用；b、將上清液加入無水硫酸氨，充分攪拌溶解後放置冰箱靜置24小時，離心，沉澱，將沉澱物採用透析脫鹽後，乾燥得到粗提多肽；c、將粗提多肽用乙酸銨緩衝液溶解，離心，濾液再用乙酸銨緩衝液稀釋，經陰離子交換樹脂DEAE柱，將吸附物用含有乙酸銨的氯化鈉溶液洗脫，所得溶液透析脫鹽，低溫乾燥，即可得到抗氧化多肽；d、再利用常規方法十二烷基磺酸鈉 PAAG確定提取的多肽的成分及其分子量，對分離的多肽進行抗氧化活性即2，2』 聯氮 雙 (3 乙基苯並噻唑啉 6 磺酸)自由基清除來確定多肽的抗氧化活性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟a、b和c中的提取、分離、純化過程所 用水均為三蒸水。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟a、b和c中的低溫離心速度為12000轉/分。
4.根據權利要求1-3所述的方法，其特徵在於步驟a中磷酸鹽緩衝溶液的濃度為 0. 01-0. lmol/L, pH = 6. 0-8. 0。
5.根據權利要求2-3所述的方法，其特徵在於步驟b中無水硫酸銨飽和度為 30% -80%。
6.根據權利要求1-3所述的方法，其特徵在於步驟d中乙酸銨緩衝溶液的濃度為 0. 01-0. 05mol/L, pH = 8. 0-9. 0。
全文摘要
本發明涉及一種芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速製備方法，該方法通過磷酸緩衝溶液提取、硫酸銨沉澱、以及陰離子交換樹脂DEAE柱吸附、洗脫等步驟分離得到具有抗氧化活性的多肽，為維吾爾藥食兩用植物芹菜籽的生物活性物質基礎研究，並開發相應的產品提供了依據。該方法提取、分離過程簡單，又不易使多肽失活，製備的多肽抗氧化活性高，無毒性、熱穩定性好，易於擴大規模生產，降低純化過程成本，是製備生物活性多肽的理想方法之一。通過該方法獲得的多肽作為製備食品以及化妝品添加劑的用途。
文檔編號C07K1/36GK101906132SQ20101022746
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者趙波, 阿吉艾克拜爾·艾薩, 阿布力米提·伊力, 馬慶苓 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所