皂苷化合物及其製備方法和應用的製作方法
2023-05-16 22:53:46
專利名稱：皂苷化合物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種化合物(本發明中稱為零陵香皂苷B)和含有該化合物的中藥零陵香提取物，以及該提取物的提取方法，所述化合物和含有該化合物的零陵香提取物具有抑菌和抗炎藥理作用。
背景技術：
零陵香為報春花科珍珠菜屬植物靈香草Lysimachia foenum-graecumHance的乾燥地上部分，主產於廣西、廣東、四川、雲南、貴州等地。其始載於《本草綱目拾遺》，目前零陵香為《廣西中藥材標準》收載，又名香草、蕙草、廣零陵香、燻草。零陵香味辛、甘，性平，無毒；歸肺，胃經；具有解表，止痛，行氣，驅蛔的功效，民間傳統主要治療感冒頭痛，咽喉腫痛，牙痛，胸腹脹滿，蛔蟲病等。
在藥用方面，零陵香可以和其他多種藥物進行配伍，如具有祛暑避穢，開竅止痛功效的避瘟散，零陵香為其中的主要成分之一，現收載於《中華人民共和國藥典》2005年版一部；另外，零陵香臨床上多治療夏季暑邪引起的頭目眩暈，頭痛鼻塞，噁心，嘔吐，暈車暈船等；同時因有濃鬱香味，零陵香又作為香料在食品工業、菸草行業有廣泛的應用。
目前對零陵香的化學成分及藥理作用研究主要集中於以下方面化學成分研究全草中含有揮髮油，油中主要是酯類、有機酸、烷烴等；樓鳳昌等人從零陵香的乙醚提取物中分得了二十九烷、三十一烷、豆甾醇、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和α-菠甾醇。
藥理及毒理研究藥理實驗證明其抑制流感病毒作用；毒理學和抗生育研究表明不妨礙生育能力，也無致畸作用，為低毒安全中藥。
因為零陵香是一種具有較高經濟價值的藥用和香料植物，而現代對其研究較少，所以有關零陵香的具體藥用價值、藥用部位及其活性成分，有待於進一步深入開發研究。
發明內容
本發明人經過大量的實驗摸索，結合現代先進的提取工藝，從零陵香中藥中提取分離出了一種新的化合物(本發明中稱為零陵香皂苷B)，以及含有零陵香皂苷B的提取物，實驗證明，該提取物及其有效成分具有明顯的抑菌、抗炎作用，極大地推動了對零陵香的研究。
本發明的目的在於提供一種化合物，其為一種新的皂甙類化合物，即，零陵香皂苷B，該化合物具有明顯的抑菌、抗炎效果。
本發明的目的還在於提供一種含有零陵香皂苷B的零陵香提取物。
本發明的目的還在於提供一種含有零陵香皂苷B的零陵香提取物的提取方法，該方法工藝條件確鑿，方法簡便易行，可以使提取物中的零陵香皂苷B的含量至少為0.1％。
本發明還提供了含零陵香皂苷B的零陵香提取物的抑菌、抗炎功效。
本發明提供了一種化合物，即零陵香皂苷B，其具有下式(I)的結構 本發明還提供含有零陵香皂苷B的零陵香提取物，零陵香皂苷B在提取物中重量百分含量至少為0.1％，優選0.1％～15％，更優選0.3％～10％。
本發明提供了一種含有零陵香皂苷B的零陵香提取物的製備方法，該方法包括將零陵香植物用醇提取，提取液上大孔吸附樹脂，樹脂再用乙醇洗脫的過程；具體為將零陵香植物用60～70％的乙醇加熱(優選加熱回流)提取，提取液用非極性有機溶劑例如用石油醚、二氯甲烷依次萃取至無色，濃縮成浸膏R，將浸膏R上大孔吸附樹脂，用濃度為30～70％的乙醇洗脫，洗脫液回收得到零陵香提取物。
本發明還提供了具有式I結構的化合物的製備方法，其中包括，將上述得到的零陵香提取物上矽膠柱，以二氯甲烷-甲醇(19∶1～19∶10)為洗脫劑洗脫，優選配比為19∶3～19∶8，將洗脫液用高效液相色譜以10-50％的甲醇水溶液洗脫分離即得到式I結構的化合物(零陵香皂苷B)。
在本發明的優選實施方案中，含有零陵香皂苷B的零陵香提取物的製備方法為零陵香藥材，切碎，用70％乙醇加熱提取，提取液濃縮，得乙醇浸膏，控制相對密度在1.2左右；乙醇浸膏稀釋，以非極性有機溶劑石油醚、二氯甲烷依次萃取至無色後，將其剩餘部分(極性部分)濃縮至幹，得浸膏R，浸膏R的收率約5％-30％(一般為15～20％)；將R浸膏用水溶解上大孔吸附樹脂柱(例如苯乙烯型大孔吸附樹脂)，用低濃度(不超過30％)乙醇洗脫近無色除去雜質後，再用較高濃度(30～70％)乙醇洗脫近無色後，30～70％的乙醇洗脫液回收至幹得到浸膏R1，浸膏R1相對於浸膏R的收率約5％-30％(一般10-20％)。浸膏R1就是零陵香提取物，以上就是含有零陵香皂苷B的提取物的製備方法。
將浸膏R1用矽膠柱層析分離，以二氯甲烷-甲醇比例為90∶10-60∶40的混合液洗脫，並用製備高效液相，C18反相色譜柱(製備型)，以甲醇-水比例為10∶90-50∶50的混合液洗脫，得到零陵香皂苷B。
零陵香皂苷B具有下列理化數據為白色粉末，m.p270℃-272℃(甲醇-水)，易溶於甲醇。Liebemann-Burchard反應陽性，點樣於矽膠G板，噴以香草醛濃硫酸溶液，並於105℃加熱5分鐘，斑點為紫紅色；MOLISH反應陽性。
分子式為C60H96O25，MALDI-TOF MS m/z 1239[M+Na]+，1255[M+K]+，高分辨質譜m/z 1239.6157[M+Na]+。1HNMR(氫譜)(500Hz，pyridine-d5)6.33(H-21，d，10.5Hz)、δ4.19(H-28，2H)、1.91(當歸醯基CH3，3H)、δ5.86(烯氫)、δ1.95(乙醯基CH3，3H)、四個糖端基質子信號[δ6.24，5.26，5.08，4.92]。
13C-NMR(碳譜)數據見下表。
NOE譜中阿拉伯糖質子(δ4.92)H-1/H-4(δ4.53)，(δ4.92)H-1/H-3(δ3.11，母核C-3)之間觀察到NOE，說明阿拉伯糖為β-D-型，並與母核C-3β-羥基相連；葡萄糖質子(δ5.08)H-1/H-3(δ4.12)，(δ5.08)H-1/H-5(δ3.72)之間觀察到NOE，說明為β-D-型；葡萄糖質子(δ5.26)H-1/H-3(δ4.27)，(δ5.26)H-1/H-5(δ3.98)之間觀察到NOE，說明為β-D-型；鼠李糖質子(δ6.24)H-1/H-4(δ4.15)之間觀察到NOE，說明羥基為α型；(δ4.65)H-16/H-28(δ4.19)之間觀察到NOE，說明H-16為β型；H-21δ6.33(1H，d，J＝10.0Hz)，因此可以確定H-21為α位，H-22為β位。
表1.零陵香皂苷B的13C-NMR(碳譜)(125Hz，pyridine-d5)數據
零陵香皂苷B在提取物中的含量測定採用高效液相色譜法測定。
1.儀器、試藥及對照品高效液相色譜儀Agilent 1100(四元泵、在線脫氣、自動進樣、恆溫箱、DAD檢測器)；超聲波清洗器(型號SK5200H，功率200W，頻率59KHz，上海科導超聲儀器有限公司)；Milipore超純水器。
乙腈(色譜純，Fischer)，其餘試劑均為分析純(北京化工廠生產)。
2.對照品溶液的製備精密稱取零陵香皂苷B 2.1mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得。
3.供試品溶液的製備精密稱取提取物2g，置250ml具塞錐形瓶中，加入甲醇100ml，超聲處理1小時，濾過，取續濾液取得。
4.色譜條件流動相乙腈-水(40∶60)檢測器蒸發光散射檢測器(40℃、2.0bar)流速1.0ml/分鐘色譜柱C18(5mm，4.6×250mm)5.方法學研究(1)線性範圍精密量取對照品溶液2、4、6、8、10ul，注入上述色譜條件測定並回歸，得到回歸曲線Y＝821.74X-110.56 r＝0.9991，零陵香皂苷B在0.042-0.21ug峰面積與樣品量之間成良好線性範圍。
(2)精密度、穩定性考察取樣品供試液5ul，進樣測定6次，RSD為1.2％；每間隔一定時間測定，48小時內測定峰面積基本一致。
(3)回收率考察加樣回收，回收率為100.3％(n＝3)，RSD＝1.2％。
6.含量測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液5ul，注入液相色譜儀。根據被測組分峰面積，用外標法計算含量。結果見表。
根據零陵香藥材和產收季節不同，零陵香皂苷B在提取物中的含量也不同，經試驗測得，零陵香皂苷B在提取物中重量百分比含量至少為0.1％，一般不超過15％，即0.1～15％，優選0.15～15％，更優選0.3～10％。
藥理藥效學實驗一、零陵香提取物抑菌作用研究1.實驗材料1.1動物昆明種小鼠，Wistar大鼠，清潔級，雌雄各半。合格證號SCXK-(軍)2002-001，以上動物均購於軍事醫學科學院實驗動物中心。
1.2藥物零陵香皂苷B臨用前用蒸餾水稀釋，配成所需濃度的混懸液，體外抑菌實驗中，需經100℃30min流通蒸汽滅菌。
止咳橘紅口服液，北京同仁堂股份有限公司同仁堂藥廠出品，批號3260113。
慶大黴素，中國藥品生物製品檢定所出品，批號0326-9713。
2.實驗方法和結果2.1體外抑菌試驗2.1.1菌種6個菌種，共30株，由解放軍總醫院微生物科提供肺炎鏈球菌 臨床分離菌4株；ATCC 496191株金黃色葡萄球菌(簡稱金葡)臨床分離菌4株；ATCC 259231株表皮葡萄球菌(簡稱表葡) 臨床分離菌4株；ATCC 122281株綠膿桿菌臨床分離菌4株；ATCC 278531株大腸桿菌臨床分離菌4株；ATCC 259221株肺炎克雷伯菌(簡稱肺克) 臨床分離菌4株；ATCC 138831株2.1.2方法採用瓊脂稀釋法，零陵香皂苷B(pH 6.5，用前均經100℃30分鐘流通蒸汽滅菌；)以無菌生理鹽水進行倍比稀釋，分別加入瓊脂培養基混勻，傾入平皿(肺炎鏈球菌平皿內加入10％羊血)，備用。
2.1.3結果見表2。
表2體外抑菌實驗結果
結果表明，該藥對表葡有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度為21.4ug/ml，對肺炎鏈球菌標準菌的最小抑菌濃度亦為21.4ug/ml。
2.2體內抑菌實驗通過預試，分別採用小鼠90％死亡率的金黃色葡萄球菌增毒菌液濃度和表皮葡萄球菌增毒菌液濃度進行試驗。
(注金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌均為臨床分離株，由解放軍總醫院微生物科提供，本院微生物室培養，金黃色葡萄球菌濃度為1.8×106cfu/ml，表皮葡萄球菌濃度為1.8×105cfu/ml，用前於每10ml菌液中加入1g乾酵母粉，即為增毒菌液)2.2.1對致死性金黃色葡萄球菌腹腔感染小鼠的死亡保護作用昆明種小鼠，雌雄各半，按體重分層後隨機分為陰性對照(給等容積蒸餾水)、陽性對照藥(止咳橘紅口服液5.0ml/kg，人臨床劑量10倍)、提取物等3組。各組連續3天按劑量灌胃給藥或給水，第4天給藥給水1小時後，腹腔注射1.8×106cfu/ml金黃色葡萄球菌酵母增毒液0.2ml/20g體重，觀察小鼠72小時內死亡情況。計算死亡率，經X2檢驗對結果進行統計。
結果見表3。
表3對致死性金黃色葡萄球菌感染小鼠的死亡保護作用
注與陰性對照比，X2-檢驗，*P＜0.05，**P＜0.01，P＜0.001***由表3可見，皂苷B1.00mg/kg劑量下均對金黃色葡萄球菌感染小鼠具有明顯的保護作用。
2.2.2對致死性表皮葡萄球菌腹腔感染小鼠的死亡保護作用動物分組給藥同前，第4天給藥給水1小時後，腹腔注射表皮葡萄球菌濃度為1.8×105cfu/ml酵母增毒液0.2ml/20g體重，觀察小鼠72小時內死亡情況。計算死亡率，經X2檢驗對結果進行統計。結果見表4。
表4對致死性表皮葡萄球菌感染小鼠的死亡保護作用
注與陰性對照比，X2-檢驗，*P＜0.05，**P＜0.01由表4可見，皂苷B1.00g/kg劑量下均對表皮葡萄球菌感染小鼠具有明顯的保護作用。表明該提取物對呼吸道一些常見菌均有一定的抑制作用。
二、抗炎作用研究1實驗材料1.1動物SPF級ICR小鼠，雄性，購自北京維通利華實驗動物中心，合格證號SCXK(京)2002-0003。
1.2試藥零陵香皂苷B分別為0.25、0.50、1.00g/kg組。臨用前用蒸餾水稀釋，配成所需濃度的混懸液，體外抑菌實驗中，需經100℃30min流通蒸汽滅菌。
阿斯匹林腸溶片，北京太陽藥業有限公司生產，批號20021102，實驗時研成細粉，以蒸餾水配製成混懸液。
2.實驗方法和結果2.1對急性滲出性炎症(二甲苯所致小鼠耳腫脹)的影響ICR小鼠，體重19-21g，按體重隨機均分8組，即空白對照組、阿司匹林0.2g/kg組、零陵香皂苷B0.25、0.50、1.00g/kg組，每組10隻，連續灌胃給藥4天，0.4ml/20g，空白對照組給相同體積的蒸溜水，於末次給藥1h後，將60μl二甲苯均勻塗於每鼠右耳兩面，40min後將小鼠頸椎脫臼處死，用直徑8mm鞏膜穿孔器取下左右耳片稱重，求出兩耳重量差、計算腫脹率，t檢驗比較組間差異，結果見表5。
腫脹率＝[(右耳重-左耳重)/左耳重]×100％。
表5對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響(X±SD)
注與空白對照組比較*P＜0.05**P＜0.01結果表明零陵香皂苷B對二甲苯所致小鼠耳腫脹有明顯抑制作用，與空白對照組比較P＜0.05-0.01，表明該藥有明顯抑制急性炎症滲透的作用。
上述實驗表明零陵香皂苷B對呼吸道一些常見菌均有一定的抑制作用，並對二甲苯所致小鼠滲出性炎症有明顯的抑制作用。
具體實施例方式
以下結合具體實施例對本發明進行詳細闡述，但並非用以限定本發明。
實施例1零陵香藥材4.5Kg，切碎，用70％乙醇回流提取2次，每次2小時，乙醇提取液濃縮至近幹，得乙醇浸膏約1.4Kg，控制相對密度在1.2左右；乙醇浸膏加水分散，以石油醚、二氯甲烷依次萃取至無色後，將其剩餘部分濃縮至幹，得浸膏R。取R浸膏用水溶解後上101型大孔吸附樹脂，樹脂用10％的乙醇和30％的乙醇洗脫近無色後棄去，再用70％乙醇洗脫至近無色，收集洗脫液回收至幹，得到浸膏R1，即是含有零陵香皂苷B的提取物。
將浸膏R1反覆上矽膠柱(柱層析用矽膠200目)，以19∶3～19∶8的二氯甲烷-甲醇為洗脫劑洗脫，隨行薄層TLC檢測，合併相同的洗脫液，再用高效液相色譜，C18反相色譜柱，以甲醇-水比例為10∶90-50∶50的混合液梯度洗脫，檢測波長為210nm，tR為35-40分，得到零陵香皂苷B。
按照所述含測方法，根據被測組分峰面積，用外標法計算含量，經實驗檢測零陵香提取物中零陵香皂苷B的含量為0.5％。
實施例2零陵香藥材(與實施例1的採收季節不同)4.5Kg，方法同實施例1，乙醇的濃度為60％，只是沒有萃取的過程，得到零陵香提取物，按照所述含測方法，根據被測組分峰面積，用外標法計算含量，經實驗檢測零陵香提取物中零陵香皂苷B的含量為0.1％。
實施例3零陵香藥材(與實施例1和2的產地不同)4.5Kg，方法同實施例1，得到零陵香提取物，按照所述含測方法，根據被測組分峰面積，用外標法計算含量，經實驗檢測零陵香提取物中零陵香皂苷B的含量為0.8％。
實施例4零陵香藥材(與實施例1～3的產地和採收季節均不同)4.5Kg，方法同實施例1，乙醇的濃度為70％，只是增加了反覆萃取除雜的步驟，得到零陵香提取物，按照所述含測方法，根據被測組分峰面積，用外標法計算含量，經實驗檢測零陵香提取物中零陵香皂苷B的重量百分比含量為7％。
實施例5零陵香藥材(與實施例1～4的產地和採收季節均不同)4.5Kg，方法同實施例1，乙醇的濃度為60％，只是沒有萃取的過程，得到零陵香提取物，按照所述含測方法，根據被測組分峰面積，用外標法計算含量，經實驗檢測零陵香提取物中零陵香皂苷B的重量百分比含量為0.1％。
以上描述了本發明優選實施方式，然其並非用以限定本發明。本領域技術人員對在此公開的實施方案可進行並不偏離本發明範疇和精神的改進和變化。
權利要求
1.一種具有式I結構的化合物
2.一種零陵香提取物，其特徵在於該提取物中含有式I結構的化合物，所述式I化合物在該提取物中的重量百分比含量至少為0.1％。
3.權利要求2所述的零陵香提取物，其中所述式I化合物在該提取物中的重量百分比含量為0.1％～15％。
4.權利要求3所述的零陵香提取物，其中所述式I化合物在該提取物中的重量百分比含量為0.15～15％。
5.權利要求2所述的零陵香提取物的製備方法，其中包括，將零陵香植物用醇提取，提取液上大孔吸附樹脂，樹脂再用乙醇洗脫，得到洗脫液即為零陵香提取物。
6.權利要求5所述的零陵香提取物的製備方法，其中包括，將零陵香植物用60～70％的乙醇加熱提取，提取液用石油醚、二氯甲烷依次萃取至無色，濃縮成浸膏，將浸膏上大孔吸附樹脂，用濃度為30～70％的乙醇洗脫，洗脫液回收得到零陵香提取物。
7.權利要求1所述的化合物的製備方法，其中包括，將零陵香植物用醇提取，提取液上大孔吸附樹脂，樹脂再用乙醇洗脫得到零陵香提取物，該提取物再上矽膠柱，以重量配比為19∶1～19∶10的二氯甲烷-甲醇為洗脫劑洗脫，將洗脫液用高效液相色譜以10-50％的甲醇水溶液洗脫分離。
8.權利要求5-7任一項所述的製備方法，其中所述的大孔吸附樹脂為苯乙烯型大孔吸附樹脂。
9.權利要求1所述的化合物在製備抗炎和抑菌藥物中的用途。
10.權利要求2所述的零陵香提取物在製備抗炎和抑菌藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種新的皂苷及含有該皂苷的零陵香提取物，所述的皂苷化合物在該提取物中的重量百分比含量至少為0.1％，以及一種製備該零陵香提取物的方法和其在抗炎抑菌方面的用途。
文檔編號A61P31/00GK101037465SQ20061006504
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月15日 優先權日2006年3月15日
發明者李向日, 林瑞超 申請人:北京同仁堂股份有限公司