一種添加殼聚糖製備交聯酶聚集體的方法
2023-05-16 17:08:06 1
一種添加殼聚糖製備交聯酶聚集體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種添加殼聚糖製備交聯酶聚集體的方法，包括配製酶溶液、於酶溶液中加入殼聚糖和至少一種其它蛋白沉澱劑使酶蛋白聚集沉澱、用交聯劑交聯形成的酶聚集體和回收形成的交聯酶聚集體等步驟。本發明方法對於低濃度酶溶液也適用，所製備的交聯酶聚集體的活性高，是無載體固定化酶，可用於相應的酶催化反應中。
【專利說明】一種添加殼聚糖製備交聯酶聚集體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種添加殼聚糖製備交聯酶聚集體的方法及由此製備的交聯酶聚集體，屬於生物化工領域。
【背景技術】
[0002]固定化酶與游離酶相比穩定性高、易從反應系統中分離、能重複使用、利於實現自動化生產，獲得性能優異的固定化酶對實現工業環境下酶的高效利用，促進生物催化產業的快速發展具有重要意義。
[0003]酶的固定化方法根據是否需要載體可分為載體固定化法和無載體固定化法。載體固定化法由於惰性載體的引入，「稀釋」了酶的活性(在整個固定化酶重量中，載體一般佔90%以上)，並且載體通常會影響底物和產物的擴散，所得固定化酶的單位酶活低。其次，有些載體比酶更昂貴，如Eupergit系列、碳納米管等，製備費用高。還有，一些載體穩定性差或具有毒性，易汙染產品。因此，儘管研究人員在載體固定化方法的改進及新型載體的開發上作了許多工作，但真正投入工業化應用的尚不多。
[0004]近年來，出現了一種無載體固定化酶的方法-交聯酶聚集體(cross-linkedenzyme aggregates)技術，該法最先由荷蘭Delft理工大學的Sheldon小組提出[CaoL，van Rantwijk F，Sheldon R A.Cross-linked enzyme aggregates:A simple andeffective method for the immobilization of penicillin acylase.0rganic Letters，2000,2(10):1361-1364.]，其原理為:向酶液中添加鹽、有機溶劑、非離子聚合物等沉澱劑，可以使酶蛋白通過非共價鍵形成超分子結構-不溶性的物理聚集體，然後再利用交聯劑對聚集體進行共價捆綁，就得到交聯酶聚集體，其結構和活性在反應體系中不易被破壞，可被回收重複使用。利用交聯酶聚集體技術可以提高酶對有機溶劑的耐受性，調控酶的功能，並且可同時對多種酶聯合固定化。與載體固定化法相比，交聯酶聚集體技術所得固定化酶單位酶活高，這樣應用時使用較小的反應器即可，投資和操作費用低。
[0005]在製備交聯酶聚集體時，需選擇合適的沉澱劑和沉澱條件，這樣才能取得好的沉澱效果，制出高活性的交聯酶聚集體[Schoevaart R, Wolbers M ff, Golubovic M, OttensM, Kieboom A P, van Rantwijk F, van der Wielen L A, Sheldon R A.Preparation,optimization, and structures of cross-1 inked enzyme aggregates (CLEAs).Biotechnology and Bioengineering,2004,87(6):754-762.]。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種添加殼聚糖製備交聯酶聚集體的方法，還提供按照本發明方法製備的交聯酶聚集體。用本發明方法製備交聯酶聚集體時，酶蛋白的聚集沉澱效果好，所得交聯酶聚集體的活性高。
[0007]為了達到上述目的，本發明採用的技術方案是:一種添加殼聚糖製備交聯酶聚集體的方法，該方法包括以下步驟:[0008]步驟1:配製酶溶液；
[0009]步驟2:使酶溶液中的酶蛋白聚集沉澱；
[0010]步驟3:用交聯劑交聯形成的酶聚集體；
[0011]步驟4:回收形成的交聯酶聚集體。
[0012]其特徵是在步驟2中通過添加殼聚糖和至少一種其它蛋白沉澱劑使酶溶液中的酶蛋白聚集沉澱。
[0013]其中所述的酶可以是任何酶或不同酶的組合物。例如蛋白酶、脂酶、青黴素醯化酶、脲酶、果膠酶、乳糖酶、海藻糖合酶、葡萄糖異構酶、半乳糖苷酶、β -澱粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖澱粉酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、漆酶、植酸酶、有機磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、擬除蟲菊酯水解酶和它們的組合物。
[0014]所述的蛋白沉澱劑是指可以使酶通過非共價鍵形成聚集體而沉澱的物質。例如硫酸銨、硫酸鈉等鹽類，丙酮、乙醇、異丙醇、叔丁醇、乳酸乙酯等有機溶劑，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖等非離子型聚合物。殼聚糖能夠通過吸附、橋連等作用使蛋白絮凝沉澱，也可以看作是一種蛋白沉澱劑。
[0015]所述的交聯劑是能與所選的酶共價交聯的試劑。例如戊二醛、乙二醛、丁二醛、葡聚糖聚醒(dextran aldehyde)、雙醒澱粉等醒類物質,三輕甲基膦、京尼平、1-乙基-(3_ 二甲基氨基丙基)_碳二亞胺(EDC)、異氰酸鹽(或酯)、環氧化物、酸酐、偶氮化合物等。可以只用一種交聯劑，也可以用兩種或多種不同類型的交聯劑。
[0016]在步驟I所述的酶溶液中加入酶的保護劑。保護劑通常可以選自酶的底物、底物類似物、酶反應的產物、酶活抑制劑、聚乙二醇(PEG)等，也可以添加其它的蛋白質，例如牛血清白蛋白(BSA)。
[0017]在步驟4後還可包括乾燥所得交聯酶聚集體的步驟，以便能夠長期貯存交聯酶聚集體。
[0018]本發明的優點和積極效果是:
[0019]1、添加殼聚糖可以提高其它蛋白沉澱劑對酶蛋白的沉澱效果，即使酶濃度較低時，也能使酶充分聚集沉澱。
[0020]2、當使用可與氨基反應的交聯劑(例如戊二醛)進行交聯時，殼聚糖能夠和酶共交聯，降低交聯劑對酶活性的影響，提高所得交聯酶聚集體的活性。
【具體實施方式】
[0021]結合實施例對本發明進一步說明。應理解這些實施例僅用於說明本發明而不是限制本發明的範圍。
[0022]按照下述步驟添加殼聚糖製備交聯酶聚集體:
[0023]步驟1:配製酶溶液。
[0024]所述的酶可以是一種酶，也可以是一種以上的酶組成的複合酶。當所述的酶是海藻糖合酶時，可以通過脂肪桿菌(Pimelobacter sp.)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、棲熱菌(Thermus sp.)、亞棲熱菌(Meiothermus sp.)或含有海藻糖合酶基因的工程菌發酵而得。當酶是固體形式的酶時，將酶以適宜的緩衝液或蒸餾水溶解，配成所需的濃度，如果有不溶物，再採用離心或 過濾的方法予以去除即可。當酶是液體酶時，可以直接使用，也可以用適宜的緩衝液或蒸餾水稀釋至所需的濃度後使用。
[0025]步驟2:於酶溶液中添加殼聚糖和至少一種其它蛋白沉澱劑使酶溶液中的酶蛋白聚集沉澱。
[0026]可以按照文獻(SchoevaartR, Wolbers M ff, Golubovic M, Ottens M, KieboomA P，van Rantwijk F，van der Wielen L A，Sheldon R A.Preparation, optimization,and structures of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs).Biotechnology andBioengineering, 2004,87 (6):754-762.)方法針對不同的酶選擇合適的沉澱劑。
[0027]可以用不同脫乙醯度的殼聚糖，例如較低脫乙醯度殼聚糖(脫乙醯度≥70% )、中等脫乙醯度殼聚糖(脫乙醯度70~85% )和較高脫乙醯度殼聚糖(脫乙醯度85%以上)。對於殼聚糖的相對分子質量沒有限制，通常可由殼聚糖溶液粘度的高低反映出殼聚糖相對分子質量的大小。根據所用殼聚糖的溶解性，選擇適當的溶液，例如0.1~5% (v / v)濃度的醋酸、甲酸、鹽酸或檸檬酸等酸溶液或者水，將其溶解，配成所需濃度的殼聚糖溶液後使用。
[0028]對殼聚糖和其它蛋白沉澱劑的添加順序沒有要求，殼聚糖和其它蛋白沉澱劑的適宜添加量通過試驗確定。
[0029]步驟3:用交聯劑交聯形成的酶聚集體。
[0030]添加完殼聚糖和其它蛋白沉澱劑並混勻後的酶溶液可以馬上加入交聯劑，也可以聚集沉澱一定時間後(通常2h以內)再加入交聯劑。
[0031]交聯劑與酶分子發生反應，通常會影響酶的高級結構，從而使酶的活性降低甚至喪失。因此為了降低交聯反應引起的酶活損失，可以在步驟I所述的酶溶液中加入酶的保護劑。交聯劑的種類和添加量，交聯反應時間、溫度和PH值，以及是否添加保護劑等都會影響所得交聯酶聚集體的酶活，可通過試驗確定。對於海藻糖合酶，保護劑可選為麥芽糖、海藻糖或葡萄糖，可以只加入一種保護劑，也可以加入兩種或兩種以上的保護劑。
[0032]步驟4:回收形成的交聯酶聚集體。
[0033]步驟3結束後，可以採用離心或過濾的方法分離形成的交聯酶聚集體，將交聯酶聚集體充分清洗後即可貯存備用。如果需要的話，還可以採用冷凍乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥或其它乾燥方法將交聯酶聚集體乾燥後備用。
[0034]由此獲得的本發明的交聯酶聚集體可用於相應的酶催化反應中。例如，當酶為海藻糖合酶時，用本發明方法製備的交聯酶聚集體可用於轉化麥芽糖製備海藻糖。
[0035]在下述實施例1~實施例5中，均以海藻糖合酶為例。按下述方法測定海藻糖合酶的活性:將ImL酶液或酶懸浮液加入到ImL以IOmmol / L、pH7.0的磷酸緩衝液配製的20% (w / v)的麥芽糖溶液中，混勻後，將該混合物溶液於60°C保溫60min，然後於100°C加熱IOmin中止酶促反應。反應混合物冷卻後,8000r / min離心15min,取上清液,用高效液相色譜法測定生成的海藻糖含量。酶活力單位定義為:在上述反應條件下，每分鐘轉化麥芽糖生成1 μ mol海藻糖所需的酶量為I單位。
[0036]高效液相色譜法測定海藻糖的條件如下:
[0037]色譜柱:Hypersil NH2,4.6mm X 250mm,填料粒徑5μηι ;檢測器:示差折光檢測器；流動相:乙腈/水=75 / 25(ν / V);柱溫:室溫；進樣量:20μ L ;流速:1.0mL / min。
[0038]實施例1:僅用殼聚糖與協同使用殼聚糖比較[0039]在本實施例中，使用的殼聚糖記為殼聚糖A，其脫乙醯度為90 %，預先用0.5 %(V / v)的醋酸將其配成濃度為1% (w / V)的溶液，所得溶液粘度約320cP(25°C )。
[0040]用50mmol / L、pH7.0的磷酸緩衝液配製海藻糖合酶溶液，其蛋白含量為2mg/mL。取ImL海藻糖合酶溶液,加入0.lmL>l% (w / v)的殼聚糖A溶液,混勻,聚集沉澱lh,8000r / min離心lOmin，收集上清液，測酶活，計算上清酶活損失。另取ImL海藻糖合酶溶液，加入0.1mLU % (w / v)的殼聚糖A溶液，混勻，然後加入0.2g的PEG6000，振蕩或攪拌，使PEG溶解，聚集沉澱lh，8000r / min離心lOmin，收集上清液，測酶活，計算上清酶活損失。結果見表1。上清酶活損失定義為上清液中海藻糖合酶活性與起始酶液中海藻糖合酶活性的百分比。
[0041]表1隻用與協同使用殼聚糖比較
【權利要求】
1.一種添加殼聚糖製備交聯酶聚集體的方法，該方法包括以下步驟: 步驟1:配製酶溶液； 步驟2:使酶溶液中的酶蛋白聚集沉澱； 步驟3:用交聯劑交聯形成的酶聚集體； 步驟4:回收形成的交聯酶聚集體。 其特徵是在步驟2中通過添加殼聚糖和至少一種其它蛋白沉澱劑使酶溶液中的酶蛋白聚集沉澱。
2.權利要求1所述的製備交聯酶聚集體的方法，其特徵是在步驟I所述的酶溶液中加入酶的保護劑。
3.根據權利要求1和2中任一權利要求所述的方法製備的交聯酶聚集體。
4.權利要求3所述的交聯酶聚集體，其中所述的酶為海藻糖合酶。
【文檔編號】C12N11/10GK103642786SQ201310680404
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】張峻, 陳穎, 鄭劍峰, 楊麗維, 陳曉雲, 齊欣 申請人:天津市林業果樹研究所