一種檢測鼠腺病毒的螢光定量pcr試劑盒及應用的製作方法
2023-05-16 07:46:41 2
專利名稱：一種檢測鼠腺病毒的螢光定量pcr試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體涉及一種檢測鼠腺病毒的SYBR Green I實時螢光定量PCR試劑盒，同時還涉及SYBR Green I實時螢光定量PCR試劑盒的應用，該SYBR Green I實時螢光定量PCR試劑盒可高效方便的對各種生物材料的小鼠源腺病毒進行定量檢測和質量監控，也可以進行鼠腺病毒的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。
背景技術：
鼠腺病毒(Murineadenovirusl, MAdV-1)屬腺病毒科(Adenoviridae)哺乳動物屬(Mastad enovirus)。腺病毒無囊膜，病毒粒子為二十面體，直徑為80 IlOnm,由252個殼粒組成。一般感染哺乳動物的腺病毒相對分子質量為20 25X 106，G+C含量為48% 61%。腺病毒分布十分廣泛，一般對 於人體沒有致癌性，但是腺病毒容易導致呼吸道感染，如急性發熱性咽喉炎、咽結膜熱和肺炎等。鼠腺病毒可損害人類心血管組織，被懷疑為人類心臟損害的一種病原。因此，對小鼠慢性持續性鼠腺病毒感染診斷，對控制鼠腺病毒蔓延、防治具有積極意義。目前檢測技術一般來說有血清學診斷技術、生物學試驗、分子生物學診斷技術三類:1、血清學診斷技術包括免疫螢光技術(IFA)、雙抗體夾心ELISA檢測等。但由於所有實驗均用到抗血清和抗原免疫反應，所以反應時間長、材料多、準備周期長，而且檢測具有明顯的滯後性，只能定性不能定量，而且重複性差。2、生物學試驗包括動物實驗、雞胚接種和細胞培養。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品存在抗補體活性，影響檢測效果。動物實驗成本較高、檢測周期長，耗費大量生物資源和人力物力。3、分子生物學診斷技術，即應用PCR技術檢測鼠腺病毒持續感染。相比之下，PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核算片段。但普通的PCR檢測方法測定的都是PCR的終產物，而不是起始的DNA或RNA拷貝數。由於PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關係，所以無法定量起始的DNA或RNA拷貝數。近年發展起來的突光定量PCR技術(Fluorogenetic Quantitative PCR, FQ-PCR)有靈敏度高、速度快、特異性好等優點。目前使用比較多的是SYBR Green I螢光染料法和Taqman法。兩種方法都具有靈敏度高、檢測速度快、特異性好的優點。在基因表達水平分析(N ellemann C, Vinggaard AM, Dalagaard M, et al.Quantification of AntiandrogenEffect Det ermined by Light Cycler Technology[J].Toxicology, 2001，163:29-38)、病原體的定性(Bhu devi B, Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classificatio n of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol., 2001, 83:1-10.)和定量檢測(Kathy F.J.Tang, Jun Wang, DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assay[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1m provedquantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucle ic Acids Res. , 2002, Vol. 30No. 17e89. Florence KP, Glaucia PB, Mireille S, etal. Quantit ation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J]. J. Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到廣泛應用，並且已成為當前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比較多的螢光定量PCR方法有SYBR Green I螢光染料法和TaqMan法，這兩種方法都具有靈敏度高、檢測速度快、特異性好的優點。本發明所採用的基於SYBR GreenI螢光染料技術的螢光定量PCR檢測方法其引物設計、合成更加簡便。
發明內容
本發明的目的是在於提供了一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用於目前市場上的所有類型螢光定量基因擴增儀，結果更加準確、可靠、穩定性好、重複性好。靈敏度高、定量快速準確、檢測範圍廣。本發明的另一個目的是在於提供了一種鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒在檢測(抗)鼠腺病毒藥物研究中的應用，可對小鼠、大鼠細胞製品進行定量檢測和質量監控，也可以進行鼠腺病毒引起的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施一種檢測鼠腺病毒的SYBR Green I實時螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)DNA提取液、b)引物、c)標準陽性模板、d) SYBR Green I實時螢光定量PCR反應液，其特徵在於從細胞樣品中提取DNA，進行螢光定量PCR反應，同時引入標準陽性模板，定量檢測未知樣品。引物序列分別為正義引物5』-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC-3』，反義弓 I 物5 』 -CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA-3 』，擴增子大小為170bp。標準陽性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒核心DNA連接蛋白編碼`區170bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5 α (本實驗室保存，大腸桿菌DH5ci為最常用於常規克隆應用的大腸桿菌菌株。除支持藍/白篩選外,DH5 α的recAl和endAl突變可增強嵌入穩定性並提高自minipreps製備的質粒DNA質量)，增殖後提取質粒，並於紫外分光光度計測A26tl定量並10倍梯度稀釋。所述的DNA 提取液是由 5mL100mM Tris-HCl (ρΗ=8· 5)、0· 5mL0. 5M EDTA,lmL10%SDS、2mL5M NaCl、0. 25mL0. 2mg/mL 蛋白酶 K 和 41. 25mL 滅菌的雙蒸水組成。所述的SYBR Green I實時螢光定量PCR反應液是由2XiTaq SYBR Green Supermix (with R0X)、10 μ M的正義引物和反義引物和滅菌的雙蒸水組成。所述的標準陽性DNA模板核苷酸序列為Ataagaaaggatgcggaaaaggaccgcatcgttgaagacataacaaattagtaaaaggtacaacataggatgtaaaatagccaatga ccatatgatcaccgcgcggacatgccgctcggagggttttgtgagctttttgcagaactttactctgttgcttctgttttggg。在本發明的一個優選方案中，標準陽性DNA模板由含有插入目的片段的pTA2 (購自Τ0Υ0Β0公司)載體轉化大腸桿菌DH5 α，增殖後提取質粒，並於紫外分光光度計測A26tl定量並10倍梯度稀釋。實驗所用的標準品製備過程為PCR反應後，取適量產物凝膠電泳檢測，擴增條帶單一，即可與ΙΟΧΑ-attachment Mix混合,於60°C反應30min ;再與pTA2載體連接。轉化感受態細胞，並將轉化產物塗平板培養，挑取白斑PCR鑑定陽性後送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。根據測序結果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨苄抗性的LB培養基過夜培養。次日提取質粒DNA，於紫外分光光度計測A26tl定量，並稀釋至梯度IO8-1O2拷貝/yL，-70°C保存。鼠腺病毒(Murine adenovirusl, MAdV-1),屬腺病毒科哺乳動物腺病毒屬。無囊膜，病毒粒子為二十面體，直徑為80 llOnm，由252個殼粒組成。整個病毒粒子含蛋白87%，核酸13%。病毒核酸為單分子線狀雙鏈DNA，大小約30 38kb。鼠腺病毒不耐熱，50 56°C易於滅活，36°C以下病毒較穩定。小鼠是鼠腺病毒的自然宿主，實驗小鼠在籠內主要經糞便和尿液接觸傳播。不同毒株MAdV，其毒力差異很大，MAdV對不同年齡小鼠的易感性也不相同，臨床表現多種多樣。自然流行多由於感染FL株引起，病鼠表現弓背、被毛粗糙、食慾下降等症狀，新生乳鼠可死亡。K87株感染新生乳鼠和成年鼠均不發病，只是經糞便不斷向外排毒並產生高滴度的抗體。裸鼠也可自然發生MAdV感染，但株型未定。用FL株接種乳裸鼠，可造成十二指腸出血和致死性消耗性疾病。MAdV的感染對實驗室小鼠和小鼠細胞生物工程製品具有潛在威脅，因此《中華人民共和國藥典》規定對鼠源性生物製品必須檢測鼠腺病毒。一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒中，有非特異性螢光染料SYBR Green I。S YBR Green I是一種能夠與雙鏈DNA小溝結合的染料。沒有與雙鏈DNA結合時，其螢光信號很弱，當其與雙鏈DNA結合後螢光信號大大增強並能夠被儀器檢測。利用SYBR Gre en I這種特點可以檢測PCR擴增產物。SYBR Green I的最大吸收波長約為497nm，發射波長最大約為520nm。SYBR Green I在核酸的實時檢測方面有很多優點。它能夠與體系中所有的雙鏈DNA相結合，無需為不同的模板特殊定製，因此價格相對較低。此外，由於一個PCR產物可以與多個SYBR Green I染料相結合，因此靈敏度很高。對鼠腺病毒的定量可通過與標準品的循環閾值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，螢光量的積累超過基底螢光量的循環數，Ct值與起始模板數的常用對數呈線性關係(log (起始模板數)=Ct值/斜率+X軸截距)，Ct值越小，起始模板數越多，相反，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值制 成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒中，針對鼠腺病毒的基因組的靶片段鹼基排列的特殊性，將反映體系(引物濃度、擴增程序等)優化，並將Q-PCR技術和定量檢測系統相結合，將其用於各種來源的鼠腺病毒樣品的定量檢測。通過優化方案，建立了定量檢測鼠腺病毒的方法，並研製出鼠腺病毒定量檢測試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出1000個以下的病毒基因拷貝數，檢測範圍可以達到七個數量級。在本發明的另外一個方面，本發明還提供了一種鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒在檢測鼠腺病毒藥物研究中的應用，其應用過程包括下列步驟:A.用c)標準陽性DNA模板由插入目的片段的pTA2 (購自Τ0Υ0Β0公司)載體轉化大腸桿菌DH5CI，增殖後提取質粒，並用紫外分光光度計定量；B.用a) DNA提取液從待測標本中提取DNA ；C.螢光定量PCR由b)引物，d) SYBR Green I實時螢光定量PCR反應液，c)標準陽性DNA模板或所提取的標本DNA組成，已加入了標準品及待測品的突光定量反應液PCR反應體系上機，用螢光定量檢測儀進行PCR檢測；D.通過比較待測樣品和標準品的循環閾值，根據擬合所得的標準曲線計算待測樣品的起始拷貝數，並以此判斷待測樣品中是否含有鼠腺病毒。在本發明中提供的檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒可對各種來源的鼠腺病毒樣品進行準確定量檢測，並可對小鼠製品和小鼠細胞進行定量檢測和質量監控，也可以進行鼠腺病毒引起的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。本發明與現有技術相比具有以下優點和效果:1.與傳統定量方法相比，此實時螢光定量PCR具有高靈敏性、高特異性和高準確性的特點，直接對PCR每循環一次就收集一個數據，建立實施擴增曲線，準確的確定Ct值，從而根據Ct值確定起始DNA拷貝數，做到了真正意義上的核算定量。2.與Taqman法相比,本實驗採用SYBR Green I染料,通過融解曲線的分析可以區分單一引物、引物二聚體、非特異性擴增等，使結果更加可靠。SYBR Green I染料也大大降低了實驗成本。3.檢測範圍廣，在108-102copies/reaction濃度範圍內有良好的線性關係(R=0.998)，檢測範圍可以達到七個數量級，其靈敏度可檢測lOOOcopies以下。4.該實時螢光定量PCR利用外標準曲線，是迄今為止定量最準確、重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認 ，廣泛用於基因表達研究、藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍，下列實施例中未註明的具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如:J.薩姆布魯克主編，科學出版社，2002，分子克隆實驗指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主編，科學出版社，2001，細胞實驗指南；F.M.奧斯伯等主編，科學出版社，2005，精編分子生物學實驗指南，或按照製造廠商建議的條件。實施例1:一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒組成及其反應條件是:A)試劑盒組成如下:(10次反應，檢測10份待測樣品)DNA提取液(IOmL/管)強陽性標準品(50 μ L/管)PCR反應管(無菌)陰性標準品(50 μ L/管)臨界陽性標準品(50 μ L/管)；強陽性標準品，即拷貝數為108c/r的標準陽性DNA模板；陰性標準品，即未感染鼠腺病毒的L929細胞(鼠腺病毒的宿主細胞)DNA ；臨界陽性標準品，即拷貝數為102c/r的標準陽性DNA模板。SYBR Green I 實時螢光定量 PCR 反應液(110 μ L/管)(d)SYBR Green I 實時螢光定量PCR反應液，購自Bio-rad公司)所述DNA 提取液(50mL)由 5mL100mM Tris-HCl (ρΗ=8.5)、0.5mL0.5M EDTA,lmL10%SDS、2mL5M NaCl、0.25mL0.2mg/mL 蛋白酶 K 和 41.25mL 滅菌的雙蒸水組成。B)突光定量反應液(反應總體積為 20 μ L):2X iTaq SYBR Green Supermix withROX,正義引物FP和反義引物RT各I μ L，待測樣品DNA或標準品I μ L，滅菌雙蒸水8 μ L。C)反應條件如下:FQ-PCR:95°C，3min95°C, 15s60 °C, 45s40cycles在每個循環的第二步結束時進行螢光檢測。對鼠腺病毒的定量可通過與標準品的循環閾值(Ct，Threshold Cycle)相比較並根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。D)螢光定量PCR試劑盒檢測鼠腺病毒的靈敏度、檢測範圍及穩定性:取c)標準陽性模板稀釋至108-102c/n共8個濃度梯度，每個濃度三個重複，力口SYBR Green I 實時螢光定量 PCR 反應液 2X iTaq SYBR Green Supermix with ROXlOu L，正義引物FP和反義引物RT各I μ L，待測樣品DNA或標準品I μ L，滅菌雙蒸水7 μ L0分別加入對應編號的PCR反應管，在螢光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環條件為:95°C 3min，95°C 15s，60°C45s，擴增40個循環。把螢光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行，檢測波長為518nm。循環結束後，運用儀器自帶的分析軟體，讀取待檢樣品拷貝數。結果為:
權利要求
1.一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a) DNA提取液、b)引物、c)標準陽性模板、d) SYBR Green I實時螢光定量PCR反應液，其特徵在於:從細胞樣品中提取DNA，進行螢光定量PCR反應，同時引入標準陽性模板，引物序列分別為正義引物:5，-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC _3 』，反義引物:5 』 -CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA _3 』，擴增子大小為170bp，標準陽性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA連接蛋白編碼區170bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5 α，增殖後提取質粒，並於紫外分光光度計測A26tl定量並10倍梯度稀釋。
2.根據權利要求1所述的一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:所述的 DNA 提取液是由 5mL IOOmM Tris_HClpH=8.5、0.5mL 0.5M EDTAUmL 10%SDS、2mL5MNaCl>0.25mL 0.2mg/mL蛋白酶K和41.25mL滅菌的雙蒸水組成。
3.根據權利要求1所述的一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:所述的 SYBR Green I 實時螢光定量 PCR 反應液是由 2X iTaq SYBR Green Supermix UOyM的正義引物和反義引物和滅菌的雙蒸水組成。
4.根據權利要求1所述的一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:所述的標準陽性DNA模板核苷酸序列為:Ataagaaaggatgcggaaaaggaccgcatcgttgaagacataacaaattagtaaaaggtacaacataggatgtaaaatagccaatgaccatatgatcaccgcgcggacatgccgctcggagggttttgtgagctttttgcagaactttactctgttgcttctgttttgggo
5.權利要求1所述 的一種鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒在檢測鼠腺病毒藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測鼠腺病毒的螢光定量PCR試劑盒及應用，該試劑盒含有a)DNA提取液、b)引物、c)標準陽性模板、d)SYBRGreenI實時螢光定量PCR反應液，其特徵在於從細胞樣品中提取DNA，進行螢光定量PCR反應，同時引入標準陽性模板，引物序列分別為正義引物5』-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC-3』，反義引物5』-CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA-3』，擴增子大小為170bp，標準陽性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA連接蛋白編碼區170bp的pTA2載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖後提取質粒，並於紫外分光光度計測A260定量並10倍梯度稀釋。結果更加準確、可靠、穩定性好、重複性好。靈敏度高、定量快速準確、檢測範圍廣。也可以進行鼠腺病毒引起的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。
文檔編號G01N21/64GK103215380SQ20131013159
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月16日 優先權日2013年4月16日
發明者肖庚富, 張哲 , 鄭從義 申請人:武漢珈創生物技術有限公司