含低劑量阻斷VEGF信號通路的抗體的組合物及其用途的製作方法

2023-04-23 11:42:46 1

本發明涉及醫藥領域，更具體地涉及一種含低劑量vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體的組合物及其用途。

背景技術：

1971年folkman首次報導，實體腫瘤的體積超過2-3mm3時，單純的氧氣擴散就已經無法支撐瘤體的生長，必須有新生血管形成才能支持其繼續生長。這些腫瘤新生血管與正常血管相比，有血管擴張、迂曲、囊狀結構形成的現象、產生無規則連接的分支，血管密度分布不均勻；管徑調節機制喪失導致異常分流，血管通透性和血管間隙均顯著增加。異常的腫瘤新生血管最終會導致血管分布不均勻，部分區域血流停滯，加重腫瘤缺氧微環境的形成，繼而影響腫瘤基因表型，激活新生血管生成因子，包括血管內皮生長因子(vegf)，促進腫瘤新生血管的生成，並造成腫瘤細胞基因的不穩定性，激活一些腫瘤細胞生存因子，導致腫瘤細胞對放療和化療的耐受，進一步促進腫瘤轉移。更重要的是，腫瘤血管缺乏高內皮小靜脈(hev)，因此t細胞侵潤不足，使得免疫治療策略無法得到有效實施。

嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，car)基因修飾的t淋巴細胞(以下簡稱car-t細胞)治療惡性腫瘤技術被推選為2013年科學發明成就之首，在復發、難治的急性淋巴性白血病治療中達到了超過90％的完全緩解率，現在這一代表國際最前沿和最新發展趨勢的技術正在被推廣到包括實體腫瘤在內的各種癌症治療試驗中。然而，由於功能異常的腫瘤血管和免疫抑制性的腫瘤微環境的存在，嚴重阻礙了靜脈回輸的car-t細胞歸巢到腫瘤病灶部位和損害了car-t細胞在腫瘤內部的生存，使得這一革命性的技術在實體腫瘤治療上的效果至今仍然十分不理想，car-t細胞應用於實體腫瘤的治療在國際上仍然面臨嚴重挑戰。因此，本目前領域迫切需要開發新的、有效的利用car-t細胞治療實體腫瘤的方法。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種基於腫瘤血管正常化和介入策略的car-t細胞治療實體腫瘤的藥物組合物。

在本發明的第一方面，提供了一種用於治療實體腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含第一活性成分和第二活性成分，其中，第一活性成分為vegf信號通路阻斷劑，第二活性成分為腫瘤免疫治療劑，

並且所述藥物組合物為單元劑型，每個單元劑型中所述第一活性成分的含量為常規劑量的0.1至0.5(較佳地0.15-0.4，或0.2-0.25)，其中，所述常規劑量為200-400mg/50kg體重。

在另一優選例中，所述常規劑量為每次給藥的第一活性成分的總常規劑量，如200-400mg/50kg體重。

在另一優選例中，所述的一個單元劑型中第一活性成分的含量對應於每次給藥的第一活性成分的總常規劑量的0.1至0.5。

在另一優選例中，所述的n個單元劑型中第一活性成分的總含量對應於每次給藥的第一活性成分的總常規劑量的0.1至0.5，其中n為2、3、4或5。

在另一優選例中，所述的n個單元劑型是相同或不同的。

在另一優選例中，所述的單元劑型中所述第一活性成分的含量為10-160mg/劑，較佳地10-100mg/劑，更佳地10-80mg/劑，如10、20、30、40、50、60、70、80mg/劑。

在另一優選例中，所述的單元劑型給藥劑量為20-160mg/50kg體重，較佳地為30-100mg/50kg體重，按所述第一活性成分計。

在另一優選例中，所述的單元劑型是包含單元劑量的活性成分的劑型。

在另一優選例中，所述的單元劑量是指活性成分的單次施用劑量。

在另一優選例中，所述的第一活性成分為抗體或小分子化合物。

在另一優選例中，所述的vegf信號通路阻斷劑包括阻斷vegf信號通路的抗體和酪氨酸激酶抑制劑(tki)。

在另一優選例中，所述的阻斷vegf信號通路的抗體包括：雷莫蘆單抗(dc101/ramucirumab)、貝伐單抗(avastin)、或其組合。

在另一優選例中，所述的酪氨酸激酶抑制劑包括：舒尼替尼(sunitinib)、多吉美(sorafinib)、或其組合。

在另一優選例中，所述阻斷vegf信號通路的抗體的給藥劑量為0.1-4mg/kg，較佳地0.2-2.5mg/kg，更佳地0.5-1mg/kg。

在另一優選例中，所述腫瘤免疫治療劑包括car-t細胞、car-nk細胞、腫瘤疫苗、和免疫檢查點抑制劑。

在另一優選例中，所述car-t細胞的給藥劑量為1x107-5x108car-t細胞/kg。

在另一優選例中，所述第一活性成分和第二活性成分是混合或單獨存在的。

在另一優選例中，所述的第一活性成分和第二活性成分的總含量為70～100wt％，較佳地為80～100wt％，更佳地為90～100wt％，按所述藥物組合物中活性成分的總重量計。

在另一優選例中，所述的實體腫瘤選自下組：乳腺腫瘤、肝腫瘤、肺腫瘤、精囊腺腫瘤、胰腺癌、胃癌、結直腸癌、食管癌、腦膠質瘤、或其組合。

在另一優選例中，所述的腫瘤免疫治療包括car-t細胞治療、car-nk細胞治療、腫瘤疫苗治療、免疫檢驗點抑制劑治療、或其組合。

在另一優選例中，所述的免疫檢驗點抑制劑包括pd-1抗體和ctla-4抗體。

在另一優選例中，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的載體。

在另一優選例中，所述藥物組合物的劑型包括注射劑和口服劑。

在本發明的第二方面，提供了一種低劑量的vegf信號通路阻斷劑的用途，用於製備一藥物組合物或藥盒，所述藥物組合物或藥盒用於提高腫瘤免疫治療的療效，

其中，低劑量是指所述vegf信號通路阻斷劑的給藥劑量a1與常規給藥劑量a0相比，a1≤1/2a0，較佳地a1≤1/4a0。

在另一優選例中，所述的vegf信號通路阻斷劑包括阻斷vegf信號通路的抗體。

在另一優選例中，所述阻斷vegf信號通路的抗體的給藥劑量為0.1-4mg/kg，較佳地0.2-2.5mg/kg，更佳地0.5-1mg/kg。

在另一優選例中，所述的藥盒包括2-4個單元劑型，所述各單元劑型中的vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體的含量為常規劑量的0.1至0.5(較 佳地0.15-0.4，或0.2-0.25)，其中，所述常規劑量為200-400mg/50kg體重。

在另一優選例中，所述的藥物組合物為單元劑型，所述單元劑型中的vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體的含量為常規劑量的0.1至0.5(較佳地0.15-0.4，或0.2-0.25)，其中，所述常規劑量為200-400mg/50kg體重。

在本發明的第三方面，提供了一種用於提高腫瘤免疫治療效果的藥盒，所述藥盒包括：

(a)第一藥物組合物，所述第一藥物組合物包含vegf信號通路阻斷劑，和藥學上可接受的載體，並且所述第一藥物組合物為單元劑型，並且所述藥盒包括2-4個單元劑型，其中所述單元劑型中的vegf信號通路阻斷劑的含量為常規劑量的0.1至0.5(較佳地0.15-0.4，或0.2-0.25)，其中，所述常規劑量為200-400mg/50kg體重；

(b)任選的第二藥物組合物，所述的第二藥物組合物為腫瘤免疫治療劑；

(c)說明書。

在另一優選例中，所述的第二藥物組合物為細胞製劑。

在另一優選例中，所述的第二藥物組合物為car-t製劑。

在另一優選例中，所述的car-t製劑包括自體的或異體的car-t製劑。

在另一優選例中，所述的第一藥物組合物和第二藥物組合物是各自獨立的。

在另一優選例中，所述的第一藥物組合物和第二藥物組合物分別位於不同的包裝或容器中。

在另一優選例中，所述說明書中記載了本發明第四方面中所述的治療方法。

在本發明的第四方面，提供了一種提高腫瘤免疫治療的效果的方法，包括步驟：

(i)給需要的對象施用低劑量的vegf信號通路阻斷劑；

(ii)對所述對象進行腫瘤免疫治療，

其中，所述低劑量是指所述vegf信號通路阻斷劑的給藥劑量a1與常規給藥劑量a0相比，a1≤1/2a0，較佳地a1≤1/4a0。

在另一優選例中，所述的vegf信號通路阻斷劑包括阻斷vegf信號通路的抗體。

在另一優選例中，在步驟(i)中，包括兩次或三次給所述對象施用阻斷vegf信 號通路的抗體，連續兩次施用之間的間隔時間為t1。

在另一優選例中，所述的t1為3-21天，較佳地4-15，更佳地為7-14天。

在另一優選例中，在步驟(i)中末次施用後，間隔一段時間t2進行所述步驟(ii)。

在另一優選例中，所述的t2為3-21天，較佳地4-15，更佳地為7-14天。

在另一優選例中，所述的對象包括人和非人哺乳動物(如齧齒動物和靈長動物)。

在另一優選例中，在步驟(ii)之後還包括步驟：

(iii)給所述對象施用低劑量的阻斷vegf信號通路的抗體。

在另一優選例中，在步驟(ii)中末次施用後，間隔一段時間t3進行所述步驟(iii)。

在另一優選例中，所述的t3為3-21天，較佳地4-15，更佳地為7-14天。

應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了低劑量的抗血管生成藥物能夠誘導腫瘤血管正常化。其中，圖1a顯示了代表性的免疫組化染色圖，內皮細胞標記物cd31分子顯示紅色螢光，周皮細胞標記物ng2分子顯示綠色螢光；圖1b顯示了腫瘤血管密度的統計結果，圖1c顯示了周細胞覆蓋率的統計結果。

圖2顯示了低劑量的抗血管生成藥物治療能夠增強腫瘤疫苗的抑癌作用。圖中，d13、d16、d19、d22分別表示首次接種後第13、16、19、22天，d10表示注射10mg/kg的抗血管生成藥物dc101。

圖3顯示了低劑量的抗血管生成藥物治療能夠促進t細胞的腫瘤浸潤。其中，圖3a顯示了cd4+t細胞的腫瘤浸潤情況；圖3b顯示了cd8+t細胞的腫瘤浸潤情況。

圖4顯示了常規劑量的抗血管生成藥物治療對腫瘤疫苗治療的影響。圖中，d7、d10、d13、d16分別表示首次接種後第7、10、13、16天，d40表示注射40mg/kg的抗血管生成藥物dc101。

圖5顯示了經過低劑量阻斷vegf信號通路藥物預處理的腫瘤患者接受car-t細胞介入治療的病理切片分析結果。

具體實施方式

本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，低劑量的vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體可以顯著提高腫瘤免疫治療的效果、促進t淋巴細胞對腫瘤組織的浸潤。實驗表明，利用介入策略將car-t細胞注射到實體腫瘤組織內部，同時配合低劑量的阻斷vegf信號通路的抗體，誘導腫瘤血管的正常化，注射部位腫瘤出現明顯壞死。在此基礎上，完成了本發明。

vegf

血管內皮生長因子(英文：vascularendothelialgrowthfactor，簡稱：vegf)，早期亦稱作血管通透因子(英文：vascularpermeabilityfactor，簡稱：vpf)，是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子(heparin-bindinggrowthfactor)，可在體內誘導血管新生(induceangiogenesisinvivo)。

研究表明，實體腫瘤的體積超過2-3mm3時，單純的氧氣擴散就已經無法支撐瘤體的生長，必須有新生血管形成才能支持其繼續生長。這些腫瘤新生血管與正常血管相比，有血管擴張、迂曲、囊狀結構形成的現象、產生無規則連接的分支，血管密度分布不均勻；管徑調節機制喪失導致異常分流，血管通透性和血管間隙均顯著增加。異常的腫瘤新生血管最終會導致血管分布不均勻，部分區域血流停滯，加重腫瘤缺氧微環境的形成，繼而影響腫瘤基因表型，激活新生血管生成因子，包括血管內皮生長因子(vegf)，促進腫瘤新生血管的生成，並造成腫瘤細胞基因的不穩定性，激活一些腫瘤細胞生存因子，導致腫瘤細胞對放療和化療的耐受，進一步促進腫瘤轉移。

vegf信號通路阻斷劑

如本文所用，「vegf信號通路阻斷劑」是指通過阻斷vegf的信號通路來抑制vegf的血管調控功能。vegf信號通路阻斷劑包括阻斷vegf信號通路的抗體和酪氨酸激酶抑制劑(tki)。

「阻斷vegf信號通路的抗體」是指特異性結合血管內皮生長因子的受體或其 配體，是一種典型的抗血管生成藥物。

目前臨床上用的阻斷vegf信號通路的抗體藥物有2種：雷莫蘆單抗(ramucirumab)和貝伐單抗(avastin)。

雷莫蘆單抗(ramucirumab)是一種完全的人源性單克隆抗體，其對應的鼠源單克隆抗體是dc101。它可特異性地與血管內皮生長因子受體2(vegfr2/kdr)結合，從而阻止受體被活化，所以它是一種vegfr2的抑制劑。雷莫蘆單抗已被美國食品藥品監督管理局(fda)批准用於治療一些實體瘤，包括胃癌和轉移性非小細胞肺癌(nsclc)。

貝伐單抗(avastin)是一種重組的人源化單克隆igg1抗體，通過結合vegf配體來阻斷其與內皮細胞表面的受體(flt-1和kdr)結合，從而抑制血管內皮生長因子的生物學活性而起作用。貝伐單抗已被美國食品藥品監督管理局批准用於治療一系列癌症，包括結腸癌、肺癌、腎癌和腦癌等。

在臨床上，ramucirumab的常規劑量是8mg/kg；avastin的常規劑量是5mg/kg。根據實施例中的小鼠實驗結果，申請人認為1/5至1/10是較佳的劑量，但不排除在不同腫瘤和腫瘤的不同階段及其與不同的腫瘤免疫治療手段結合時會有不同的劑量範圍。

複方藥物組合物和藥盒

本發明提供了含有第一活性成分vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體，和第二活性成分腫瘤免疫治療劑；以及藥學上可接受的載體的複方藥物組合物。這類載體包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉劑、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。本發明的藥物組合也可以被製成粉劑用於霧化吸入。一種優選的劑型是注射製劑。此外，本發明藥物組合物還可與其他治療劑一起使用。

本發明還提供了一種用於提高腫瘤免疫治療效果的藥盒，所述藥盒包括：

(a)第一藥物組合物，所述第一藥物組合物包含vegf信號通路阻斷劑，較佳地 包含阻斷vegf信號通路的抗體，和藥學上可接受的載體，並且所述第一藥物組合物為單元劑型，並且所述藥盒包括2-4個單元劑型，其中所述單元劑型中的vegf信號通路阻斷劑的含量為常規劑量的0.1至0.5(較佳地0.15-0.4，或0.2-0.25)，其中，所述常規劑量為200-400mg/50kg體重；

(b)任選的第二藥物組合物，所述的第二藥物組合物為腫瘤免疫治療劑；

(c)說明書。

本發明的藥物組合物或藥盒適用於治療腫瘤，尤其適用於治療實體腫瘤。

需要注意的是，本發明的藥物組合物或藥盒含有低劑量的vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體，其中，低劑量是指所述阻斷vegf信號通路的抗體的給藥劑量a1與常規給藥劑量a0相比，a1≤1/2a0，較佳地a1≤1/4a0。

在另一優選例中，本發明的藥物組合物為單元劑型，每個單元劑型中所述活性成分的含量為日劑量的0.1至1(或0.25-1，或0.5-1)，其中所述第一活性成分的日劑量為20-100mg(對於50kg的人而言)。

在另一優選例中，所述阻斷vegf信號通路的抗體的給藥劑量為0.1-4mg/kg，較佳地0.2-2.5mg/kg，更佳地0.5-1mg/kg。

當然，所用的活性成分的有效劑量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而有所變化。

治療方法

本發明還提供了用本發明的兩種活性成分或相應的藥物對實體腫瘤進行治療的方法，它包括給哺乳動物施用低劑量的第一活性成分阻斷vegf信號通路的抗體以及第二活性成分腫瘤免疫治療劑，或者施用含有所述第一活性成分和第二活性成分的藥物組合物。

當本發明兩種活性成分被用於上述用途時，可與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合，如溶劑、稀釋劑等，而且可以用無菌可注射溶液或懸浮液形式(在等滲介質中含有約0.05-5％懸浮劑)進行非腸胃給藥。例如，這些藥物製劑可含有與載體混合的約0.01-99％，更佳地約為0.1％-90％(重量)的活性成分。

本發明的兩種活性成分或藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包 括(但並不限於)：肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、口服、瘤內或局部給藥。優選的給藥途徑包括瘤內給藥或靜脈內給藥。

從易於給藥的立場看，優選的藥物組合物是液態組合物。

此外，本發明的兩種活性成分或藥物還可與其他治療癌症的藥物(如順鉑、紫杉醇等)聯用。

本發明的主要優點包括：

(a)低劑量的vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體，可以顯著提高腫瘤免疫治療的效果。

(b)低劑量的vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體可以促進t淋巴細胞對腫瘤組織的浸潤。

(c)低劑量的vegf信號通路阻斷劑，如阻斷vegf信號通路的抗體，還可促進其他腫瘤治療方法的效果，如化療和放療。

(d)本發明的藥物組合適用於實體腫瘤的治療。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。

通用材料

下述實施例中，阻斷vegf信號通路藥物dc101購自bioxcell公司，用作對照的兔抗鼠igg單抗購自jacksonimmunoresearch公司。mcap0008腫瘤細胞疫苗即絲裂黴素處理的mcap0008腫瘤細胞，該腫瘤疫苗通過體內的抗原遞呈細胞來誘導mcap0008腫瘤抗原特異的免疫反應。抗血管生成藥物貝伐單抗由醫院提供；用於細胞免疫治療的car-t細胞由博生吉公司生產。

實施例1

低劑量的抗血管生成藥物對腫瘤血管的影響

構建原位mcap0008乳腺癌模型，當mcap0008乳腺癌小鼠腫瘤直徑達到 4-5mm時，給小鼠進行第一次低劑量(小鼠通用劑量的1/4)的阻斷vegf信號通路藥物(dc101)以及兔抗鼠igg單抗(對照)的治療處理(設為0天)，藥物注射頻率為每三天一次，劑量為10mg/kg(僅為小鼠通用劑量的1/4)，共給藥4次。在第11天對小鼠進行4％的多聚甲醛灌注，製備腫瘤組織冰凍切片(20μm)，並對該組織切片進行內皮細胞標記物cd31分子以及周皮細胞標記物ng2分子的標記染色。利用共聚焦雷射掃描顯微鏡隨機選取腫瘤區域進行免疫組化圖像採集(每個腫瘤組織4-6個區域，每組6-8個腫瘤)，放大倍數20×。統計分析腫瘤血管密度，周細胞覆蓋率。

結果如圖1所示，在低劑量抗血管生成藥物dc101(10mg/kg)治療後的第11天，仍可觀察到腫瘤血管的密度顯著減少(圖1a和圖1b)，和周細胞覆蓋率顯著增加(圖1a和圖1c)。結果表明低劑量抗血管生成藥物可以誘導長效腫瘤血管正常化。

實施例2

低劑量的抗血管生成藥物聯合疫苗治療對小鼠腫瘤的影響

為了研究腫瘤血管正常化對腫瘤免疫治療的影響，進行了低劑量的抗血管生成藥物聯合疫苗治療實驗。當乳腺癌小鼠腫瘤模型mcap0008的腫瘤直徑達到3mm時，隨機分組，腹腔注射5×106絲裂黴素預處理的mcap0008腫瘤細胞疫苗或是等體積pbs(對照)，注射時間分別為第7，9，12，14天。分別在第13，16，19，20天注射抗血管生成藥物dc101(10mg/kg)或兔抗鼠igg(10mg/kg)。從第13天開始測量腫瘤大小，每三天測量一次。繪製腫瘤生長曲線。每組10隻小鼠。

結果如圖2所示，單獨的疫苗治療對小鼠腫瘤生長的抑制效果不明顯，而低劑量的抗血管生成藥物誘導的腫瘤血管正常化可以顯著增強腫瘤免疫治療的效果。結果表明，與單獨的疫苗治療和低劑量的抗血管生成藥物治療相比，低劑量的抗血管生成藥物聯合疫苗治療可以顯著抑制小鼠腫瘤生長。

實施例3

低劑量的抗血管生成藥物治療對t細胞的腫瘤浸潤的影響

為了研究腫瘤血管正常化增強免疫治療的機制，對腫瘤組織中浸潤的cd8+ 和cd4+t淋巴細胞進行分析。當mcap0008乳腺癌小鼠腫瘤直徑達到4-5mm時，給小鼠進行低劑量的dc101以及腫瘤細胞疫苗的治療處理，dc101及對照兔抗鼠igg的藥物注射頻率為每三天一次，劑量為10mg/kg，共給藥4次。然後收集腫瘤組織，製備單細胞懸液，進而利用流式細胞分析儀分析腫瘤浸潤cd4+t細胞和cd8+t細胞。

結果如圖3所示，單獨的低劑量阻斷vegf信號通路藥物(組別：pbs/d10)可以顯著提高cd8+和cd4+淋巴細胞的浸潤能力，而低劑量阻斷vegf信號通路藥物聯合疫苗治療(組別：疫苗/d10)後，cd4+淋巴細胞的浸潤能力進一步顯著增強。結果表明，低劑量的抗血管生成藥物治療可以促進t細胞的腫瘤浸潤。

實施例4

常規劑量的抗血管生成藥物對腫瘤疫苗治療的影響

實驗條件與實施例2相同，區別在於施用的抗血管生成藥物的劑量為40mg/kg，即施用常規劑量的抗血管生成藥物，研究其對腫瘤免疫治療的影響。

結果如圖4所示，單獨的疫苗治療對小鼠腫瘤生長的抑制效果不明顯。同時，常規劑量的抗血管生成藥物與疫苗的聯合治療對小鼠腫瘤生長的抑制效果與單獨的常規劑量抗血管生成藥物的治療效果沒有明顯差異。上述結果表明常規劑量(高劑量)的抗血管生成藥物，不能提高腫瘤疫苗的治療效果。

實施例5

血管正常化預處理結合介入治療的car-t臨床治療

car-t細胞治療是一項十分有前景的能夠有效治療腫瘤的新的細胞免疫療法。接受cd19car-t治療的復發或難治急性淋巴細胞白血病患者的完全緩解率達到90％。但是，car-t細胞在實體瘤治療中的表現卻並不能令人滿意，國際上針對實體瘤car-t細胞治療的嘗試也並未成功。腫瘤組織內部血管分布不均勻、腫瘤內部供氧不足等因素嚴重阻礙car-t細胞系統回輸方案針對實體瘤的治療有效性，造成系統回輸的car-t細胞不能完全有效的浸潤到腫瘤組織內部，並造成car-t細胞不能在腫瘤內部被完全有效的活化、增殖、以及長時間的存留。因此，為了改善上述三點實體瘤的特殊性對car-t細胞治療造成的不利影響，選擇介入策略將car-t細胞注射到腫瘤組織內部，同時配合低劑量(1/5和1/10 正常劑量)的avastin(貝伐單抗，抗血管生成藥物)，誘導腫瘤血管正常化。

在通過臨床醫院倫理委員會審批同意後，對1名籤署了知情同意書的muc1+晚期實體瘤患者(晚期精囊腺癌)進行了臨床科研試驗。患者首先靜脈注射1mg/kg(正常劑量的1/5，該劑量根據上述小鼠試驗結果推測得到)劑量的阻斷vegf信號通路藥物avastin(貝伐單抗，靶向配體vegf)，2周後重複注射同等劑量阻斷vegf信號通路藥物，然後1周後對該患者轉移的腫瘤病灶在彩超指導下進行了muc1car-t細胞的瘤內注射。car-t細胞注射1周後，再次注射阻斷vegf信號通路藥物，但劑量減少為0.5mg/kg(正常劑量的1/10，該劑量根據以上小鼠試驗結果推測得到)。car-t細胞注射3周後，手術摘取腫瘤組織，製作成石蠟切片，進行he染色。

結果如圖5所示，圖中顏色粉紅的橢圓組織是新鮮壞死的腫瘤細胞，可以看到壞死後的腫瘤細胞與周邊組織形成的裂縫。結果表明，低劑量的阻斷vegf信號通路藥物與muc1car-t聯合car-t細胞注射的腫瘤部位出血腫瘤明顯壞死，表現出良好的治療效果。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。