還原型輔酶q的穩定溶液的製作方法
2023-05-18 02:34:06 1
專利名稱：還原型輔酶q的穩定溶液的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有還原型輔酶Q作組分的溶液，具體來說涉及一種可穩定保存還原型輔酶Q防止氧化的溶液。
背景技術：
輔酶Q是一種從細菌到哺乳動物的生物體廣泛分布的必需組分，並且已知它還是生物體中細胞線粒體的電子轉運系統的組分。人們還知道輔酶Q在線粒體中進行著氧化/還原循環並在電子轉運系統中起著電子載體的作用，並且還原型輔酶Q還具有抗氧化作用。人的輔酶Q主要是由側鏈中有10個重複結構的輔酶Q10組成，並且通常在生物體中存在的大約40％到90％的輔酶Q是還原形式。輔酶Q的生理功能的例子包括通過激活線粒體的功能來激活能量的產生、激活心肺功能、穩定細胞膜、通過抗氧化作用生產細胞，等等。
輔酶Q可用於許多方面，例如，氧化的輔酶Q10因其對心臟的作用可用於治療充血性心力衰竭。除了治療作用外，輔酶Q還可以用作像維生素類口服的營養補充劑或營養佐劑。但是，由於輔酶Q的疏水性，它不溶於水，所以實際上只能用作口腔劑和皮膚劑。
近年來，有報導稱由於血液中的氧化應激的增加使得許多疾病惡化。這類疾病的典型例子包括動脈硬化、糖尿病綜合症等。這些疾病都是因為血液中各種類型的氧化應激使脂質變性所引起或惡化的。為了降低氧化應激的影響，服用可激活抗氧化力的抗氧化劑是有效的。被認為可有效抑制脂質過氧化的典型脂溶性抗氧化化合物維生素E可以廣泛用於防止疾病的抗氧化劑。最近有報導還原型輔酶Q10的共存對維生素E足以顯示抗氧化活性是很重要的(Bowry等，1993，J.American Chemical Society，115，6029-6044)，輔酶Q和維生素E的重要性已經被認為是一種脂溶性抗氧化劑。
由於還原型輔酶Q自身具有很強的抗氧化作用，提供足夠用量的可溶性還原型輔酶Q能夠有效增加血液中的抗氧化活性。通過增加血液中的抗氧化活性，能夠預期到對由活性氧物質惡化的許多疾病的有益作用如預防局部缺血再流通中的血管病和動脈硬化症的再狹窄、預防腦梗塞後的血管病、預防動脈硬化、預防糖尿病綜合症，等等。而且，使用還原型輔酶Q的新運送形式，可以通過滴注將還原型輔酶Q運送到體內，這樣對不能口服還原型輔酶Q的患有嚴重疾病的患者或患有腦病的患者是有用的。用這種方法，預期還原型輔酶Q的增溶作用對保持好的健康將會有許多優點。
過去人們對增溶氧化型輔酶Q10(癸烯醌或泛醌)的方法有過許多研究。現已報導過增溶氧化型輔酶Q10的許多方法如用脂質體包覆，用表面活性劑或脂肪或油懸浮等等(日本未審專利申請5-186340和7-69874和PCT日語翻譯的專利申請2000-510841)。但是，這些方法中沒有一種實際應用。原因之一是為了使氧化型輔酶Q10具有抗氧化活性，必須用還原酶將其轉化成它的還原形式，但是在血液中的還原型輔酶Q10的量不能由注射給藥增加，這是因為血液中不存在還原酶的緣故，所以通過增加抗氧化活性不能降低血液中的氧化應激。另一方面，還原型輔酶Q10本身具有抗氧化活性並且是上述疾病所希望的物質。但是，由於還原型輔酶Q10的進行氧化和不穩定的趨向，所以它並沒有實際應用。現在已有報導為研究氧化-還原酶製備了脂質體包覆的還原型輔酶(Kishi等，1999，BioFactors，10，131-138).但是，該報導僅僅公開了在使用前迅速製成脂質體的方法，穩定保持還原型輔酶Q的增溶方法還是未知的。
發明概述本發明的一個目的是提供一種能夠穩定地保持還原型輔酶Q不被氧化的水溶液。
由於對克服上述問題的研究，本發明人發現了一種含有適合於穩定地保持還原型輔酶Q不被氧化的組合物的溶液，從而完成了本發明。
本發明的輔酶Q溶液含有還原型輔酶Q，其中該輔酶Q用脂質體包覆或者用表面活性劑增溶或乳化從而穩定地保持還原型輔酶Q不被氧化。
本發明溶液可用於醫用品、食品、食品組合物、飲料、肥料、化妝品、動物飼料或抗氧化劑。醫用品的例子包括注射劑、體液替代品、液體藥物、滴眼劑、滴鼻劑、滴耳劑、口服藥、皮膚用藥劑、頭皮用藥劑和貯備溶液。這些醫用品除了用於人外還可用於動物，例如狗、貓、兔子、小鼠、大鼠、牛、馬、豬，等等。
本發明也提供了一種穩定還原型輔酶Q的方法，它包括用由磷脂和/或糖脂製備的脂質體包覆還原型輔酶Q。
本發明的詳細描述下面將詳細描述本發明。
輔酶Q用結構式(1)和(2)來表示 (其中n表示1到12的整數)； (其中n表示1到12的整數)。
還原型輔酶Q是用結構式(1)所表示的，而氧化型輔酶Q是用結構式(2)來表示的。
本發明中所用的輔酶Q包括用結構式(1)所表示的還原型輔酶Q，其中還原型輔酶Q在輔酶Q的總重中的最低含量優選是20％(重量)，更優選40％(重量)，而含量的上限可以是100％或更少，優選小於100％(重量)，更優選98％或更小。就還原型輔酶Q在輔酶Q中的比率來說，已經發現通過給藥含有還原型輔酶Q10的口服組合物增加血液中輔酶Q10含量的作用是隨著還原型輔酶Q10含量增加至20％(重量)或更大而增加的，並且在含量增加至40％(重量)或更多時有顯著性增加(日本未審專利申請公開號10-109933)。
獲得還原型輔酶Q的方法是沒有限制的，一種可用的方法例包括用通常公知的方法如合成、發酵、從天然來源中提取等得到輔酶Q，然後濃縮從色譜法洗液得到的還原型輔酶Q的餾分。在這種情況，如果需要的話，可以向輔酶Q中加入一般的還原劑如氫硼化鈉、連二亞硫酸鈉(sodiumhydrosulfite)等，用常規方法將輔酶Q中所含的氧化型輔酶Q還原成還原型輔酶Q，通過色譜法濃縮所獲得的還原型輔酶Q.還原型輔酶Q也能夠通過還原劑與高純度的現有輔酶的反應得到。
可使用結構式(1)和(2)所示的在其側鏈有1到12(各結構式中的n)重複單元的輔酶作為本發明所用的輔酶Q。具體來說，可優選使用有10個側鏈重複單元的輔酶即輔酶Q10。
獲得本發明溶液的方法沒有限制。例如，用脂質體包覆含有還原型輔酶Q的輔酶Q並用適當的基質增溶該輔酶Q。該溶液也能夠通過用適當的表面活性劑增溶或乳化得到。
作為脂質體基質的脂質優選使用磷脂或糖脂。
磷脂的例子包括蛋黃卵磷脂、純化的大豆卵磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、鞘磷脂、三十二烷基磷酸酯、硬脂胺、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯肌醇胺、雙磷脂醯甘油、神經醯胺磷醯基乙醇胺、神經醯胺磷醯基甘油或這些脂質的混合物。但是，優選高含量含有磷脂醯膽鹼的脂質，最優選純化的大豆卵磷脂。純化的大豆卵磷脂的磷脂醯膽鹼含量優選是0.01％(重量)或更多，更優選0.1％(重量)或更多。
糖脂的例子包括雙半乳糖甘油二酯、半乳糖甘油二酯硫酸酯、半乳糖神經醯胺、半乳糖神經醯胺硫酸酯、乳糖神經醯胺、神經節苷脂G7、神經節苷脂G6、神經節苷脂G4、雙半乳糖神經醯胺，或這些脂質的混合物。
就輔酶Q與磷脂或糖脂的組分比而言，相對於1摩爾的輔酶Q來說可以存在1摩爾或更多的磷脂或糖脂，但是優選10摩爾或更多的磷脂或糖脂。
基質中還可以加入甾醇。所加甾醇量的上限優選1/5，並且更優選1/10重量的磷脂或糖脂。最優選使用膽固醇作該甾醇，但是也可以使用其他甾醇。
儘管本發明溶液中的輔酶Q含量取決於所用的溶液，但是下限優選是0.0001％(重量)，並且上限優選是50％(重量)。更優選，下限是0.001％(重量)，上限是30％(重量)，最優選下限是0.01％(重量)，上限是15％(重量)。
用本領域熟練技術人員公知的方法進行脂質體的包覆。例如，將磷脂和還原型輔酶Q的混合物溶於溶劑如氯仿、乙醇等中的溶劑蒸乾，然後通過超聲處理等方式將剩餘物分散於適當的緩衝液中。上述操作最好是在低溫(例如4℃)氮氣等惰性氣體中進行，從而抑制還原型輔酶Q和脂質的氧化。
下面將描述用表面活性劑增溶或乳化。
可以使用常用產品作表面活性劑。表面活性劑的例子包括陰離子表面活性劑如羧酸鹽陰離子表面活性劑、磺酸鹽陰離子表面活性劑、硫酸鹽陰離子表面活性劑、磷酸鹽陰離子表面活性劑，等等；陽離子表面活性劑如胺鹽陽離子表面活性劑、季銨鹽陽離子表面活性劑，等等；兩性表面活性劑如氨基羧酸鹽兩性表面活性劑、羧基甜菜鹼兩性表面活性劑、硫酸鹽兩性表面活性劑、磺酸兩性表面活性劑，等等；非離子型表面活性劑如醚類非離子型表面活性劑、醚酯非離子型表面活性劑、酯類非離子型表面活性劑、嵌段聚合物非離子型表面活性劑、含氮非離子型表面活性劑，等等；其他表面活性劑如天然表面活性劑、源於蛋白水解物的表面活性劑、聚合物表面活性劑、含鈦和矽的表面活性劑以及碳氟化合物表面活性劑，等等。
表面活性劑優選非離子型表面活性劑，更優選聚山梨醇油酸酯(Poly-solvate)表面活性劑如吐溫80等，或者聚氧乙烯硬化的蓖麻油如HCO60等。
本發明溶液中表面活性劑的濃度一般是0.01到20％(重量)，從還原型輔酶Q抗氧化的角度看更優選小於1％(重量)，最優選0.1％(重量)或更小。但是，當表面活性劑溶液和還原型輔酶Q10粉末分別包裝從而在使用前配製所述溶液而不考慮儲存時的氧化，當儲存期非常短時，或者在密封容器中放有去氧劑的無氧條件下儲存時，可製備含有1％(重量)或更多表面活性劑的溶液或浮液。輔酶Q的含量與脂質體包衣的含量相同的。
上述製得的溶液還可以含有藥學上允許的藥劑原料，這些原料可以通過常規方法適當加入。可加入的藥劑原料是沒有限制的，例如可以加入乳化劑、增稠劑(tensing agent)、緩衝液、增溶劑、矯味劑、防腐劑、穩定劑、抗氧化劑，等等。
儲存本發明溶液組合物的方法也沒有限制，可以使用常規方法如低溫儲存、使用密封容器的無氧儲存、避光儲存，等等。
當按上述方法所製備的本發明溶液在低溫或室溫儲存時，還原型輔酶Q能夠穩定地保持不被氧化。術語「穩定地保持」是指還原型輔酶Q的殘餘量是開始儲存時的濃度的80％或更高。保持這種百分比的儲存時間最好是1周或更長，更優選1個月或更長，最優選1年或更長。
含有還原型輔酶Q的本發明溶液能夠廣泛用於醫療、化妝、食品、園藝、乳製品，等等。該溶液的應用實例包括注射液、輸注液、液體藥、滴眼液、內用液體藥、洗液、頭髮滋補劑、化妝乳劑、噴霧液體、氣霧劑、飲料、液體肥料、儲備溶液等。在醫療應用中，該溶液也可以用作器官移植的儲備溶液。而且，該溶液還可以用於動物、魚和海產食品以及動物飼料。該溶液也能夠用作儲存新鮮食品如肉、魚等的抗氧化溶液。
附圖簡述
圖1是表示用三種類型的卵磷脂中的每種製得的脂質體中還原型輔酶Q10在4℃時的氧化穩定性的圖，在縱坐標上用％表示還原型輔酶Q10的剩餘量與製備時的含量之比率，在橫坐標上表示了儲存天數，並且每個數值都是用n＝2的平均值。
圖2是表示用三種類型的卵磷脂中的每種製得的脂質體中還原型輔酶Q10在23℃時的氧化穩定性的圖，在縱坐標上用％顯示了還原型輔酶Q10的剩餘量與製備時的含量之比，在橫坐標上顯示了儲存天數，並且每個數值都是用n＝2的平均值。
圖3是表示用三種類型的卵磷脂中的每種製得的脂質體中還原型輔酶Q10在40℃時的氧化穩定性的圖，在縱坐標上用％表示還原型輔酶Q10的剩餘量與製備時的含量之比率，在橫坐標上表示儲存天數，並且每個數值都是用n＝2的平均值。
圖4是表示表面活性劑濃度對用兩種類型的表面活性劑的每種製備的還原型輔酶Q10在23℃時氧化穩定性的影響圖，其中縱座標表示還原型輔酶Q10的剩餘量與製備時的含量比率，橫坐標表示儲存天數，各數值都是用n＝2的平均值。
本發明實施的最佳方式儘管下面參考實施例和製備例進一步詳細描述本發明，但是本發明並不限定於這些實施例和製備例。
(實施例1)卵磷脂對含還原型輔酶Q10脂質體中還原型輔酶Q10氧化穩定性的影響使用蛋黃卵磷脂(由Wako Pure化學工業有限公司生產的)和純化的大豆卵磷脂Lecinol S10和Lecinol S10EX(由Nihon化學有限公司生產的)作卵磷脂。Lecinol S10含有25到30％(重量)的磷脂醯膽鹼，而Lecinol S10EX含有95％(重量)或更多的磷脂醯膽鹼。用下述卵磷脂製備含還原型輔酶Q10的脂質體。也就是說，向輔酶Q10的乙醇溶液(1mg/ml)(氧化型∶還原型＝5∶95(重量比))中加入卵磷脂-氯仿溶液(3.2mg/ml)，並溶解。用蒸發器減壓下完全除去溶劑後，向殘餘物中加入HEPES緩衝液(50mM，pH7.4)，並且通過振搖分散脂質膜而製成乳白色懸浮液。在4℃氮氣流下將該懸浮液進行超聲處理30分鐘以製備脂質體，並通過離心分離法除去大分子。為了防止操作中還原型輔酶Q10的氧化，儘可能快速地進行操作。
用高效液相色譜法(HPLC)評估脂質體中還原型輔酶Q10的氧化穩定性。
用蛋黃卵磷脂剛剛製備後含有0.05％還原型輔酶Q10的脂質體中還原型輔酶Q10的的量大約是90％(重量)，而用純化的大豆卵磷脂(Lecinol S10和Lecinol S10EX)製備的大約是95％(重量)。這樣發現在用蛋黃卵磷脂製備脂質體過程中還原型輔酶Q10被輕微氧化，而用純化的大豆卵磷脂製備脂質體過程中還原型輔酶Q10被氧化的更小。
通過在空氣中存放脂質體也檢查儲存溫度對還原型輔酶Q10氧化的影響。結果如圖1到3所示，其中各數值是n＝2的平均值。
在冷藏(4℃)30天後，90％或更多的還原型輔酶Q10保留在用三種類型的卵磷脂中的每種所製備的脂質體中。儲存60天後，在用Lecinol S10或Lecinol S10EX製得的脂質體中還原型輔酶Q10很少被氧化，而在用蛋黃卵磷脂所製備的脂質體中大約25％的還原型輔酶Q10被氧化(圖1)。
在23℃儲存30天後，90％或更多的還原型輔酶Q10還以還原態保留在用Lecinol S10或Lecinol S10EX製得的脂質體中，而80％或更多的還原型輔酶Q10還以還原態保留在用蛋黃卵磷脂製得的脂質體中。但是，儲存60天後，含Lecinol S10脂質體中保留了90％或更多的還原型輔酶Q10，而含Lecinol S10EX和蛋黃卵磷脂的脂質體中分別大約35％和大約55％的還原型輔酶Q10被氧化(圖2)。
含蛋黃卵磷脂的脂質體在40℃加熱後，大多數還原型輔酶Q10都被氧化。而含Lecinol S10的脂質體，在儲存2周後還原型輔酶Q10減少大約50％，並且30天後所保留的還原型輔酶Q10的量大約是20％。就含有LecinolS10EX的脂質體而言，大約70％的還原型輔酶Q10在30天後還以還原型保留著(圖3)。
結果，發現了純化的大豆卵磷脂Lecinol比蛋黃卵磷脂更適合作為還原型輔酶Q10的脂質體基質。具體來說，含有高含量的磷脂醯膽鹼的純化的大豆卵磷脂Lecinol S10EX在40℃是穩定的。但是，Lecinol S10在25℃具有更高的穩定性，這樣按照所用產品的儲存條件適當選擇純化的大豆卵磷脂能夠獲得穩定的儲存期。在需要長期儲存的使用中，將純化的大豆卵磷脂尤其是含有高含量的磷脂醯膽鹼的卵磷脂作為基質是非常好的。但是，對於短期儲存，也可以使用含蛋黃卵磷脂的脂質體。
(實施例2)用表面活性劑增溶的還原型輔酶Q10的溶液的穩定性用下述方法製備含表面活性劑的還原型輔酶Q10的溶液，並且評估儲存時的氧化穩定性。用聚山梨醇油酸酯(polysolvate)80(吐溫80)或聚氧乙烯硬化的蓖麻油(HCO 60)作表面活性劑，並且製備1％(重量)或0.1％(重量)的表面活性劑的水溶液。然後，向水溶液中加入還原型輔酶Q10從而使該溶液的最終濃度為0.05％(重量)。圖4表示在23℃所述溶液空氣儲存期間表面活性劑的濃度對還原型輔酶Q10的氧化穩定性的影響。在圖4中，各數值都是n＝2的平均值。已發現還原型輔酶Q10的氧化穩定性受表面活性劑濃度的劇烈影響，並且用低濃度的表面活性劑所製得的溶液穩定性高。該試驗的結果表明用0.1％(重量)的表面活性劑濃度，還原型輔酶Q10能夠在23℃下穩定存放大約1個月。而用1％(重量)的表面活性劑濃度，還原型輔酶Q10能夠穩定存放1周，之後迅速被氧化。所以，當用表面活性劑製備溶液或乳液時，為了製備能夠長期儲存的溶液降低所用的表面活性劑的濃度。可以在使用前配製該溶液或懸浮液的條件下，或者溶液或懸浮液短期存放或存放在密封條件如完全無氧條件下，能夠使用含1％(重量)或更多表面活性劑的溶液或懸浮液。
(製備實施例1)注射劑純化的大豆卵磷脂 0.3％(重量)乙醇 6.5％(重量)Macrogol 400 5.0％重量)山梨醇 4.5％(重量)還原型輔酶Q100.1％(重量)注射用蒸餾水 至100.0％(重量)(製備實施例2)乳液吐溫80 1.0％(重量)甘油 12.5％(重量)磷脂醯膽鹼 1.2％(重量)還原型輔酶Q100.1％(重量)純化水 至100.0％(重量)(製備實施例3)洗面乳純化的大豆卵磷脂 0.2％(重量)角鯊烷 0.1％(重量)乙醇 14.0％(重量)甘油 4.0％(重量)還原型輔酶Q100.1％(重量)純化水 至100.0％(重量)工業實用性按照本發明，作為抗氧化劑或藥學成分的具有廣泛用途的還原型輔酶Q能夠以液體藥物形式提供，可在各種領域廣泛使用。
權利要求
1.一種含有結構式(1)所表示的還原型輔酶Q的輔酶Q溶液，其中該輔酶Q用脂質體包覆或者用表面活性劑增溶或乳化從而穩定地保持還原型輔酶Q不被氧化， (其中n是1到12的整數)。
2.按照權利要求1的溶液，其中還原型輔酶Q的含量是輔酶Q總重量的20％或更多。
3.按照權利要求1的溶液，其中還原型輔酶Q的含量是輔酶Q總重量的40％或更多。
4.按照權利要求1的溶液，其中還原型輔酶Q的濃度是0.0001到50％(重量)。
5.按照權利要求1的溶液，其中輔酶Q是輔酶Q10。
6.按照權利要求1到5中任意一項的溶液，其中輔酶Q是用脂質體包覆的。
7.按照權利要求6的溶液，其中脂質體是由磷脂和/或糖脂製成的。
8.按照權利要求7的溶液，其中的磷脂是磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、鞘磷脂、三十二烷基磷酸酯、硬脂胺、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯肌醇胺、雙磷脂醯甘油、神經醯胺磷醯基乙醇胺、神經醯胺磷醯基甘油或這些脂質的混合物。
9.按照權利要求7的溶液，其中的磷脂是純化的大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂。
10.按照權利要求7的溶液，其中的糖脂是雙半乳糖甘油二酯、半乳糖甘油二酯硫酸酯、半乳糖神經醯胺、半乳糖神經醯胺硫酸酯、乳糖神經醯胺、神經節苷脂G7、神經節苷脂G6、神經節苷脂G4、雙半乳糖神經醯胺，或這些脂質的混合物。
11.按照權利要求6的溶液，還含有甾醇作脂質體膜的組分。
12.按照權利要求1到5中任何一項的溶液，其中該輔酶Q是用表面活性劑增溶或乳化的。
13.按照權利要求12的溶液，其中的表面活性劑是選自於下組中的至少一種羧酸鹽陰離子表面活性劑、磺酸鹽陰離子表面活性劑、硫酸鹽陰離子表面活性劑、磷酸鹽陰離子表面活性劑、胺鹽陽離子表面活性劑、季銨鹽陽離子表面活性劑、氨基羧酸鹽兩性表面活性劑、羧基甜菜鹼兩性表面活性劑、硫酸鹽兩性表面活性劑、磺酸兩性表面活性劑、醚類非離子型表面活性劑、醚酯非離子型表面活性劑、酯類非離子型表面活性劑、嵌段聚合物非離子型表面活性劑、含氮非離子型表面活性劑、天然表面活性劑、源於蛋白水解物的表面活性劑、聚合物表面活性劑、含鈦和矽的表面活性劑以及碳氟化合物表面活性劑。
14.按照權利要求13的溶液，其中的表面活性劑是聚山梨醇油酸酯或聚氧乙烯硬化的蓖麻油。
15.按照權利要求13的溶液，其中表面活性劑的濃度小於1％(重量)。
16.按照權利要求13的溶液，其中表面活性劑的濃度是1到20％(重量)。
17.按照權利要求1到16中任何一項的溶液，其中該溶液可用於醫用品、食品、食品組分、飲料、肥料、化妝品、動物飼料或抗氧化劑。
18.按照權利要求1到16中任何一項的溶液，其中該溶液可用於注射液、體液替換品、液體藥物、滴眼劑、滴鼻劑、滴耳劑、口服劑、皮膚劑、頭皮劑或儲備溶液。
19.一種穩定還原型輔酶Q的方法，它包括用磷脂和/或糖脂製成的脂質體包覆還原型輔酶Q。
20.按照權利要求19的方法，其中磷脂是純化的大豆卵磷脂。
全文摘要
本發明提供了一種實際應用的可穩定地保存還原型輔酶Q不被氧化的溶液的組合物，還原型輔酶Q由於其易於氧化和疏水性至今沒有在實際中應用。本發明還提供了製備該溶液的方法和儲存該溶液的方法。用精製的大豆卵磷脂等製備的脂質體包覆還原型輔酶Q，並在低溫下用表面活性劑增溶或乳化還原型輔酶Q就能夠製備成在低溫或室溫下可長期儲存的還原型輔酶Q的溶液。
文檔編號C07C50/28GK1501903SQ0280730
公開日2004年6月2日 申請日期2002年5月9日 優先權日2001年5月9日
發明者藤井健志, 三, 川辺泰三, 典, 細江和典, 義, 日高隆義 申請人:鍾淵化學工業株式會社