融合肽治療組合物的製作方法

2023-09-20 18:26:10 1

專利名稱：融合肽治療組合物的製作方法
技術領域：
本發明提供摻入了包含彈性蛋白樣肽(elastin-like peptides, ELPs)和肽活性治療劑的融合蛋白(fusion proteins,FPs)的新一代治療組合物。本發明的治療組合物與含有相同肽活性治療劑但不含與之結合的ELPs的相應組合物相比，能使所給予的肽活性治療劑的溶解度、生物利用度或生物不可利用度(bio-unavailability)和半壽期的提高得以實現。
背景技術：
為所有目的，將2005年2月8日授權的、Ashutosh Chilkoti名下的題為「FUSIONPEPTIDES ISOLATABLE BY PHASE TRANSITION」(可通過相轉變分離的融合肽)」的美國專利第6，852，834號和2005年2月8日提交的Ashutosh Chilkoti名下的題為「FUSIONPEPTIDES ISOLATABLE BY PHASE TRANSITION」(可通過相轉變分離的融合肽)」的美國專利申請第11/053，100號的公開內容各自通過引用整體結合到本文中。上述Chilkot i的專利和專利申請公開了包含ELP肽的遺傳上可編碼的環境響應性融合蛋白。這種融合蛋白顯示出獨特的物理化學特性和功能特性，這些特性可隨溶液環境變化來進行調節。

發明內容
本發明主要涉及包含彈性蛋白樣肽和肽活性治療劑的融合蛋白治療組合物。在本發明的FP治療組合物中，有至少一個肽活性治療劑與一個或多個ELPs偶聯(coupled)，例如在其N末端或C末端共價鍵合，以實現肽活性治療劑的功效的增強，這一增強是相對於相應的單獨治療劑而言。肽活性治療劑-ELP構建物功效的增強表現在多個特性的任何一個，如所給予的肽活性治療劑的溶解度、生物利用度、生物不可利用度、治療劑量、對蛋白水解的抗性、半壽期等。在另一個方面，本發明涉及包含與表達控制元件如適當類型的啟動子可操作地連接(operably linked)的異源核苷酸序列的融合基因構建物,其中異源核苷酸序列編碼包含與至少一個ELP偶聯的至少一種肽活性治療劑的融合蛋白。在又一個方面，本發明涉及增強肽活性治療劑的功效的方法。所述方法包括將肽活性治療劑與至少一個ELP偶聯以形成FP治療組合物，其中這種FP治療組合物中的肽活性治療劑相對於單獨的肽活性治療劑來說具有增強的功效。在一個方面，增強的功效是體內功效。本發明的另一個方面涉及治療需要肽活性治療劑的受試者的方法，所述方法包括給予該患者包含以下的治療組合物:(i)與至少一個ELP偶聯的肽活性治療劑，或(ii)編碼包含肽活性治療劑和至少一個ELP的融合蛋白的核苷酸序列，這個序列可操作地連接到其表達控制元件。在還另一個方面，本發明涉及其中治療劑與ELP綴合(conjugate)的治療劑劑型。由下續的公開內容和所附的權利要求書，可更加清楚地了解本發明各個其他的方面、特徵和實施方案。


圖1是SDS-PAGE凝膠圖，顯示了使用實施例1的表達和純化方法進行的37個胺基酸的肽的表達情況。圖例:M =分子量標記；S =超聲處理後的裂解物；P =離心所得的沉澱(轉變前);L =可溶性裂解物；Tn =第η次轉變所得的沉澱圖2是 曲線圖，證實了實施例1的方法所得的肽的純化。圖3是SDS-PAGE凝膠圖，顯示了實施例6所述的BFP、CAT和Κ1-3的ITC純化的結果。圖4Α和4Β是曲線圖，顯示了實施例8的每個融合構建物在PBS緩衝液中作為溫度函數的濁度的增加。圖5是曲線圖，說明了實施例9所述的14C標記ELP的血液濃度與時間的變化關
系O圖6是柱圖，顯示了實施例10所述的14C標記ELP1-150和ELP2-160在裸鼠中的生物分布。圖7是柱圖，顯示了實施例10所述的14C標記ELP2-[V1A8G7-WO]在裸鼠中的生物分布。
具體實施例方式本發明提供摻入了包含彈性蛋白樣肽和肽活性治療劑的融合蛋白的治療組合物。本發明的治療組合物與含有相同肽活性治療劑但不含與之結合的ELPs的相應組合物相比，能使所給予的肽活性治療劑的功效的提高得以實現，所述功效的提高例如溶解度、生物利用度、生物不可利用度(在需要避免出現蓄積和/或毒性如心臟毒性的情況下)、半壽期等的改進。為在後續的說明中便於查考，以下給出在其中出現的具體術語的定義。術語「蛋白(質)」在本文中以一般性含義使用，包括任何長度的多肽。本文所用的術語「肽」要作廣義解釋，包括分子量最高達約10，000的多肽本身，以及分子量超過約10，000的蛋白質，其中分子量是數均分子量。在一個具體的方面，具有約2至約100個胺基酸殘基的肽特別優選作為本發明的肽活性治療劑。
本文所用的術語「偶聯」意指各指定部分(specified moieties)相互間直接發生共價鍵合，或者它們相互間通過一個或多個間插部分(intervening moiety)例如橋(bridge)、間隔序列(spacer)或鍵(linkage)部分間接發生共價連接,或者它們相互間通過例如氫鍵鍵合、離子鍵合、範德華力等發生非共價偶聯。本文所用的術語「半壽期」意指活性劑的生物活性出現50%減低所需的時間。這個術語要與「持續期」和「清除率」區別開來，持續期是活性劑在身體內的總持續時間，清除率是一個動態變化的變量，可與半壽期和持續期的數值有關聯或沒有關聯。詞語「轉化」在本文中作廣義使用，指通過任何本領域公知的方法(包括例如來自細胞或病毒顆粒的多核苷酸序列的直接傳導及通過感染性病毒顆粒的傳導)將外源多核苷酸序列導入到原核生物或真核生物細胞中，導致無限增殖化或非無限增值化細胞系的基因型的永久或暫時改變。術語「功能等同物」在本文中用來指作為天然蛋白質的活性類似物、衍生物、片段、截短同種型等的蛋白質。某多肽當它保持了相應天然多肽的一些或全部生物活性時是有活性的。本文所用的本發明製劑的「藥物可接受」成分(如鹽、載體、賦形劑或稀釋劑)是這樣的成分，它(I) 與製劑的其他成分相容，表現在它能與本發明的FPs結合在一起又不會消除FPs的生物活性；和(2)適合在動物(包括人)中使用而不會產生過度的不利副作用(如毒性、刺激和過敏反應)。副作用在藥物組合物的風險大於它們所提供的好處時是「過度」的。藥物可接受成分的實例包括但不限於任何標準的藥物載體如磷酸緩衝鹽溶液、水、乳液如油/水乳液、微乳液和各種類型的溼潤劑。本文所用的涉及蛋白質的術語「天然」表示該蛋白質具有自然界中所存在的相應蛋白質的胺基酸序列。本文所用的術語「間隔序列」指任何可插入在給定的ELP/肽活性治療劑構建物中的ELP和肽活性治療劑之間的部分。例如，間隔序列可以是在一個末端與ELP共價鍵合、在另一個末端與肽活性治療劑共價鍵合的二價基團。因此，ELP/肽活性治療劑構建物能納入任何另外的不會妨礙ELP/肽活性治療劑構建物用於其預定用途的功效的化學結構。間隔序列例如可以是提供來控制ELP/肽活性治療劑構建物的藥代動力學的蛋白酶敏感性間隔序列部分，或者它可以是蛋白酶不敏感性ELP/肽活性治療劑構建物。本發明的融合蛋白(FP)治療組合物包含與至少一個肽活性治療劑偶聯的至少一個彈性蛋白樣肽(ELP)。組合物的ELP成分和肽活性治療劑成分可以以任何合適的方式互相偶聯，包括共價鍵合、離子鍵合、締合鍵合(associative bonding)、複合或者任何其他的能有效地使ELP成分和肽活性治療劑成分聚集在一起的偶聯方式，使得肽活性治療劑對其預定用途是有效的，並使得偶聯的ELP的存在能在一些功能上的、治療上的或生理上的方面對組合物中的肽活性治療劑進行增強，以使它比單獨的肽活性治療劑更加有效。因此，FP治療組合物中的ELP偶聯肽活性治療劑可在任何其他的特性方面得到增強，例如它的生物利用度、生物不可利用度、治療劑量、製劑相容性、對蛋白水解或其他降解方式的抗性、溶解度、給予後在身體內的半壽期或持續期的其他量度方式、給予後從身體的清除率等。在本發明的FP治療組合物中，有至少一個肽活性治療劑與一個或多個ELPs偶聯，例如在其N末端或C末端共價鍵合，以實現肽活性治療劑的功效的增強，這一增強是相對於相應的單獨治療劑而言。本發明的FP治療組合物可直接進行治療給予，或者在體內從相應的融合基因構建物產生，所述融合基因構建物包含與表達控制元件如適當類型的啟動子可操作地連接的異源核苷酸序列的融合基因構建物，其中異源核苷酸序列編碼包含與至少一個ELP偶聯的至少一種肽活性治療劑的融合蛋白。本發明例如通過將肽活性治療劑與至少一個ELP偶聯形成FP治療組合物，來使肽活性治療劑的功效得到增強，其中這種FP治療組合物中的肽活性治療劑相對於單獨的肽活性治療劑而言具有增強的功效。本發明可用任何合適的包含與至少一個ELP偶聯的至少一種肽活性治療劑的治療劑型來實施。本發明通過將肽活性治療劑與至少一個ELP偶聯形成FP治療組合物，來使肽活性治療劑能對蛋白水解降解保持穩定。本發明的FP治療組合物可包含一個或多個ELP種類和一種或多種肽活性治療劑。如上所述，各個ELP種類和肽活性治療劑可直接相互偶聯，或者這種偶聯可通過構建物中包含間插在ELP和肽活性治療劑之間的間隔序列部分來實現。本發明的FP治療組合物中所用的ELP種類可以是任何合適的類型。ELPs是已被發現存在於彈性蛋白中的重複肽序列。這些重複肽序列包括聚四肽、聚五肽、聚六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽。

ELPs會發生可逆的反溫度轉變(inverse temperature transition)。在低於轉變溫度(Tt)下它們在水中是結構上無序的和高度可溶的，但當溫度升高到Tt以上時會顯示急劇的(2-3°C範圍)從無序到有序的相轉變(phase transition),導致多肽的去溶劑化和聚集。ELP聚集體當達到足夠的大小時，可容易地通過離心從溶液中移取和分離。這種相轉變是可逆的，分離的ELP聚合物當在溫度恢復到ELPs的Tt以下時可完全重溶於緩衝溶液中。在本發明的實施中，ELPs種類起到穩定或以別的方式改進治療組合物中的肽活性治療劑的作用。在將偶聯的肽活性治療劑-ELP構建物給予需要肽治療劑的患者之後，肽活性治療劑和ELP保持互相偶聯，同時肽活性治療劑具有治療活性，例如具有治療或預防疾病狀態或生理狀況的活性或者具有其他治療幹預活性。例如，本發明的治療組合物中的ELPs可包含這樣的ELPs，它們由包括但不限於以下的各種特徵性四肽、五肽、六肽、七肽、八肽和九肽的多聚或寡聚重複單元(repeats)所形成:(a)四肽 Val-Pro-Gly-Gly，或者 VPGG(SEQ ID NO:1)；(b)四肽 IIe-Pro-Gly-Gly，或者 IPGG (SEQ ID NO:2)；(c)五肽 Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO:3),或者 VPGXG，其中 X 為任何天然或非天然胺基酸殘基，且其中X任選在各個多聚或寡聚重複單元之間不相同；(d)五肽 Ala-Val-Gly-Val-Pro，或者 AVGVP (SEQ ID NO:4)；(e)五肽 IIe-Pro-Gly-Val-Gly，或者 IPGVG (SEQ ID NO:5)；(f)五肽 Leu-Pro-Gly-Val-Gly，或者 LPGVG(SEQ ID NO:6)；
(g)六肽 Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly，或者 VAPGVG (SEQ ID NO:7)；(h)八肽 Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly,或者 GVGVPGVG(SEQ ID NO:8)；(i)九肽 Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly，或者 VPGFGVGAG(SEQ ID NO:
9);和j)九肽 Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly，或者 VPGVGVPGG(SEQ ID NO:10)。其他大小和構造的任何其他多聚或寡聚重複單元，也可有效地應用於本發明的廣泛實施中。在一個實施方案中，肽活性治療劑-ELP構建物的中的ELP包括五肽Val-Pro-Gly-X-Gly的重複單元，其中X如上定義，且其中Val-Pro-Gly-X-Gly五肽單元與ELP的其他胺基酸殘基的比例大於約75%，更優選大於約85%，還更優選大於約95%。本發明的肽活性治療劑-ELP構建物可用合成法(例如重組法)產生。在肽活性治療劑-ELP構建物中，ELP可在肽活性治療劑的C末端和/或N末端連接，且任選可有間隔序列存在，將ELP與肽活性治療劑隔開。在一個方面，本發明構思了包含編碼肽活性治療劑-ELP融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，所述融合蛋白任選包含如上所述的將ELP與肽活性治療劑隔開的間隔序列。該多核苷酸可作為表達載體的成分提供。本發明還構思了被這種表達載體轉化以表達融合蛋白的宿主細胞(原核細胞或真核細胞)。肽活性治療劑-ELP構建物在合成或表達後，可通過涉及產生相轉變的方法來進行分離，相轉變例如是通過提高溫度或通過其他方式來進行，從而造成在介質(medium)中以非分離形式存在的融合蛋白的相轉變。例如，肽活性治療劑-ELP構建物可通過如下步驟來合成和回收:構建包含編碼能顯示相轉變的肽活性治療劑-ELP融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，在培養物中表達融合蛋白，和使培養物的含有融合蛋白的材料進行包括分離(例如通過離心、膜分離等進行分離)和反轉變循環(inverse transition cycling, ITC)的處理以回收肽活性治療劑-ELP融合蛋白。在一個具體的實施方案中，肽活性治療劑-ELP融合蛋白包括這樣的ELP部分，它包含選自 VPGG、IPGG、AVGVP, IPGVG、LPGVG, VAPGVG, GVGVPGVG、VPGFGVGAG 和 VPGVGVPGG 的
多肽的多聚或寡聚重複單元。在另一個具體的實施方案中，肽活性治療劑-ELP融合蛋白包括這樣的ELP部分，它包含選自LPGXG(SEQ ID NO: 11)、IPGXG(SEQ ID NO:12)和它們的組合的多聚或寡聚重複單元，其中X為不會妨礙ELP融合蛋白的相轉變的胺基酸殘基。本發明的肽活性治療劑-ELP構建物包含能給構建物賦予相轉變特徵的胺基酸序列。肽活性治療劑-ELP構建物中的ELP可包含β -轉角成分。適合用作β _轉角成分的多肽的實例在Urry等人的國際專利申請PCT/US96/05186中有描述。或者，肽活性治療劑-ELP中的ELP可以是缺乏β -轉角成分或另外具有不同的構象和/或摺疊特性的成分。如所述，ELPs可包括各種四肽、五肽、六肽、七肽、八肽和九肽的多聚或寡聚重複單元，這些肽包括但不限於 VPGG、IPGG、VPGXG, AVGVP, IPGVG、LPGVG, VAPGVG, GVGVPGVG、VPGFGVGAG和VPGVGVPGG (SEQ NO:1至SEQ NO:10)。本領域技術人員會認識到，ELPs並不需要僅由以上所列的多聚或寡聚序列組成，以顯示相轉變或另外構成適用於本發明肽活性治療劑-ELP構建物的ELPs種類。在一個實施方案中，肽活性治療劑-ELP構建物包括這樣的ELPs，它是五肽VPGXG(SEQ ID NO:3)的多聚或寡聚重複單元，其中客體殘基(guest residue)X為任何不會消除ELP的相轉變特徵的胺基酸。X可以是天然胺基酸或非天然胺基酸。例如，X可選自以下:丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。在一個具體的實施方案中，X不是脯氨酸。X可以是非傳統胺基酸。非傳統胺基酸的實例包括:普通胺基酸的D-異構體、2，4- 二氨基丁酸、α -氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2_氨基丁酸、Y -Abu, ε -Ahx,6-氨基己酸、Aib,2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環己基丙氨酸、丙氨酸、氟胺基酸、設計胺基酸(designer amino acid)如β _甲基胺基酸、C α -甲基胺基酸、Na-甲基胺基酸和全體胺基酸類似物。在每次ELP重複中，X的身份的選擇是獨立的。選擇可基於任何所需的特徵，如考慮到X位置中的帶正電荷殘基或帶負電荷殘基。可以認為，在X位置中具有中性值(neutralvalue)的ELPs可具有較長的半壽期。

在另一個實施方案中，肽活性治療劑-ELP構建物包括這樣的ELPs，它是五肽IPGXG(SEQ ID NO:11)或LPGXG(SEQ ID NO:12)的多聚或寡聚重複單元，其中X如上所定義。ELP序列的多聚或寡聚重複單元可被一個或多個不會消除肽活性治療劑-ELP構建物的總體相轉變特徵的胺基酸殘基隔開。在一個具體的實施方案中，當肽活性治療劑-ELP構建物的ELP成分包含五肽VPGXG的多聚或寡聚重複單元時，VPGXG重複單元與ELP的其他胺基酸殘基的比例大於約75%，更優選大於約85%，還更優選大於約95 %，最優選大於約99%。在每個重複單元中，X為獨立進行選擇。所產生的不同的ELPs種類在本文中用代號ELPk[X&-n]來區別，其中k表示ELP重複單元的具體類型，括號中的大寫字母是單字母胺基酸代碼，它們相應的下標表示每個客體殘基X在重複單元中的相對比例，η以五肽重複單元的數目描述ELP的總長度。例如，ELPl [V5A2G3-1O]表示含有10個五肽VPGXG重複單元的多肽，其中X為纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸，它們相對比例為5: 2: 3 ^LPUK1V2F1I]表示含有4個五肽VPGXG重複單元的多肽，其中X為賴氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，它們相對比例為1: 2:1 ；ELP1 [K1V7F1-Q]表示含有9個五肽VPGXG重複單元的多肽，其中X為賴氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，它們相對比例為1: 7: I ;ELPl[V-5]表示含有5個五肽VPGXG重複單元的多肽，其中X全部是纈氨酸；ELP1 [V-20]表示含有20個五肽VPGXG重複單元的多肽，其中X全部是纈氨酸；ELP2[5]表示含有5個五肽AVGVP重複單元的多肽；ELP3[V_5]表示含有5個五肽IPGXG重複單元的多肽，其中X全部是纈氨酸；ELP4[V-5]表示含有5個五肽LPGXG重複單元的多肽，其中X全部是纈氨酸。
Urry及其同事之前進行的研究證實，彈性蛋白五肽序列VPGXG中的第四個殘基(X)可進行改變而又不消除β-轉角的形成。這些研究還證實Tt是客體殘基的疏水性的函數。通過改變客體殘基的身份和它們的摩爾分數，可合成出在o-1oo°c範圍內顯示反轉變的ELPs0在給定ELP長度下，可通過在ELP序列中摻入較大比例的疏水客體殘基來降低Tt。合適的疏水客體殘基的實例包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。也可使用中等疏水的酪氨酸。相反，可通過摻入選自以下的殘基來提高Tt:穀氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸和穀氨醯胺，優選丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和穀氨酸。在一個實施方案中，選擇ELP以提供在如下範圍內的Tt:約10至約80°C，更優選約35至約60°C，最優選約38至約45°C。Tt還可通過改變ELP鏈長度來改變。Tt隨著分子量的下降而提高。對於分子量大於100，000的多肽，優選用Urry等人(PCT/US96/05186)開發的疏水性尺度來預測特定ELP序列的大約Tt。對於分子量小於100，000的多肽，優選用以下二次函數來確定Tt:Tt = Μο+Μ^+Μ^2其中X 為 FP 的分子量，且 M。= 116.21 !M1 = -1.7499 ；M2 = 0.010349。ELP的Tt和因 此ELP與肽活性治療劑連接所成的構建物的Tt，受到客體殘基X的身份和疏水性的影響，構建物的另外的特性也可能受到影響。這種特性包括但不限於ELP本身和構建物的溶解度、生物利用度或生物不可利用度和半壽期。在下文的實施例部分可知道，ELP偶聯的肽活性治療劑與游離蛋白質形式的這種治療劑相比，保持了大部分 的治療劑生物活性。另外，還證實ELPs顯示長的半壽期。因此，可按照本發明將ELPs用來綴合治療劑而極大地增加它的半壽期(相比於游離(未綴合)形式的治療劑的半壽期，例如在具體的實施方案中增加10%、20%、30%、50%、100%、200%以上)。此外，還證實ELPs當進行體內給予時能靶向高血液含量的器官，因此可在身體中進行分配，以提供治療劑在身體各個不同器官或區域當中的預定所需身體分布，或者提供治療劑的所需選擇性或靶向性。總之，本發明所構思的活性ELP-治療劑綴合物，是作為具有長半壽期的位點特異性活性組合物來給予或在體內產生。在本發明的一個實施方案中，ELP長度為5至約500個胺基酸殘基，更優選約10至約450個胺基酸殘基，還更優選約15至約150個胺基酸殘基。可通過在ELP序列中摻入較大比例的疏水客體殘基，來減少ELP長度而同時又保持目標Tt。肽活性治療劑-ELP構建物中的活性治療劑可以是任何合適的類型。合適的肽包括在醫學、農業及其他科學和工業領域中有意義的肽，特別包括治療性蛋白質如促紅細胞生成素、爪蟾抗菌肽、防禦素、幹擾素、胰島素、單克隆抗體、血液因子、集落刺激因子、生長激素、白細胞介素、生長因子、治療性疫苗、降鈣素、腫瘤壞死因子(TNF)、受體拮抗齊U、皮質類固醇和酶類。這種肽的具體實例包括但不限於用於替代療法的酶類；抗細菌肽；用於促進生長的激素和用於各種應用的活性蛋白質物質。具體的實例包括但不限於超氧化物歧化酶、幹擾素、天冬醯胺酶、穀氨醯胺酶(glutamase)、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chromotrypsin)、木瓜蛋白酶(papin)、胰島素、降鈣素、ACTH、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)、somatosin、生長激素(somatropin)、生長調節素、甲狀旁腺激素、促紅細胞生成素(erthyropoietin)、下丘腦釋放因子、催乳素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽和血管升壓素。在本發明的一個實施方案中，肽活性治療劑是硫氧還蛋白。在另一個實施方案中，肽活性治療劑是澱粉酶抑肽。澱粉酶抑肽-ELP融合蛋白提供了作為α-澱粉酶抑制劑例如用於治療胰腺炎的澱粉酶抑肽的容易分離的活性形式(version)。這個融合蛋白適於作為藥物製劑的成分提供,它在藥物製劑中與藥物可接受載體相結合。澱粉酶抑肽-ELP融合蛋白保持了游離澱粉酶抑肽的大部分α-澱粉酶抑制活性，是穩定的構建物。在一個具體的實施方案中，肽活性治療劑包括選自以下的生理活性肽:胰島素、降鈣素、ACTH、胰高血糖素、促生長素抑制素、促生長素、生長調節素、甲狀旁腺激素、促紅細胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽、血管升壓素、非天然的阿片樣物質(opiods)、超氧化物歧化酶、幹擾素、天冬醯胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。本發明因此涵蓋各種用於(體內)治療應用的組合物，其中肽活性治療劑-ELP構建物的肽成分是生理活性肽或生物活性肽。在這種含肽組合物的優選形式中，肽成分與ELP種類的偶聯是通過直接共價鍵合或間接(通過適當的間隔基團)鍵合來實現的，肽部分和ELP部分可相互間以任何合適的涉及這種直接或間接共價鍵合的方式進行結構上的安排。因此，在本發明的廣泛實施中有很多種肽可適用，在給定的治療應用中可按要求或按需要選用。用作本發明肽活性治療劑-ELP構建物中的肽活性治療劑的肽，在一個實施方案中包括用於替代療法的酶類和用於促進生長的激素。這種酶類包括超氧化物歧化酶、幹擾素、天冬醯胺酶、穀氨醯胺酶(glutamase)、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶、胞嘧啶脫氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。在肽激素當中，適用於本發明肽活性治療劑-ELP構建物的具體種類包括但不限於胰島素、降鈣素、ACTH、胰高血糖素、somatosin、生長激素 、生長調節素、甲狀旁腺激素、促紅細胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、甲狀腺刺激激素、內啡肽、腦啡肽和血管升壓素。在另一個具體的方面，ELPs/肽活性治療劑構建物中的肽活性治療劑選自以下種類和它們所有的變體、片段和衍生物:刺鼠蛋白相關肽(agouti related peptide)、支鏈澱粉、血管緊張素、天蠶殺菌肽、鈴蟾肽、胃泌素(包括胃泌素釋放肽)、乳鐵蛋白、抗微生物肽(包括但不限於爪蟾抗菌肽)、尿擴張素(urodilatin)、核定位信號(NLS)、膠原肽、存活蛋白、澱粉樣肽(包括β_澱粉樣肽)、利尿鈉肽、肽YY、神經退行性肽和神經肽(包括但不限於神經肽Y)、強啡肽、內啡素、內皮素、腦啡肽、毒蜥外泌肽、纖連蛋白、神經肽W和神經肽S、肽Τ、黑皮質素、澱粉樣蛋白前體蛋白、片層形成阻斷肽(sheet breaker peptide)、CART肽、澱粉樣蛋白抑制肽、朊病毒抑制肽、氯毒素、促腎上腺皮質激素釋放因子、催產素、血管升壓素、縮膽囊素、分泌素、胸腺素、表皮生長因子(EGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(aFGF，bFGF)、胰抑制素、黑素細胞刺激激素、骨1丐蛋白、緩激肽、腎上腺髓質素、perinerin、metastatin、抑肽酶(apiOtinin)、甘丙肽(包括甘丙肽樣肽)、瘦蛋白、防禦素(包括但不限於α-防禦素和β -防禦素)、salusin和各種毒液(包括但不限於芋螺毒素、抗栓肽、kurtoxin、anenomae毒液和鳥蛛毒液)、利尿鈉肽(包括腦利尿鈉肽(B-型利尿鈉肽或BNP)、心房利尿鈉肽和血管鈉肽)、神經激肽A、神經激肽B、神經調節肽、神經降壓肽、食慾肽、胰多肽、垂體腺苷酸環化酶激活肽(PACAP)、催乳素釋放肽、蛋白脂質蛋白質(PLP)、促生長素抑制素、TNF-α、Grehlin、蛋白質C(Xigris)、SSl (dsFv) -PE38和假單胞菌外毒素蛋白、凝血因子(包括抗凝血酶III和凝血因子VIIA、因子VII1、因子IX)、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活齊U、尿激酶、葡糖腦苷脂酶和a-D-半乳糖苷酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、α_1，4_葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖-2-硫酸酯酶、脫氧核糖核酸酶1、人激活蛋白、卵泡刺激激素、絨毛膜促性腺激素、促黃體生成激素、生長激素、骨形態發生蛋白、奈西立肽、甲狀旁腺激素、促紅細胞生成素、角化細胞生長因子、人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、α-幹擾素、幹擾素、Y-幹擾素、白細胞介素(包括IL-1、IL-1Ra, IL-2、ll-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-1U IL-12)、糖蛋白 ΙΙΒ/ΙΙΙΑ、免疫球蛋白(包括B型肝炎球蛋白、Y -球蛋白、venoglobulin)、水蛭素、抑肽酶、抗凝血酶II1、α -1-蛋白酶抑制劑、非格司亭和依那西普。在另一個實施方案中，本發明的肽活性治療劑-ELP構建物的肽成分可以是涉及免疫療法或其他治療幹 預的抗體或抗原。還將如下的各種其他的蛋白質和肽與不同的ELP多肽進行融合以形成能顯示反相轉變行為的FPs:胰島素A肽、Τ20肽、幹擾素ci2B肽、菸草蝕紋病毒蛋白酶、小異型二聚體伴侶孤兒受體、雄激素受體配體結合結構域、糖皮質類固醇受體配體結合結構域、雌激素受體配體結合結構域、G蛋白a Q、l-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構酶肽、G蛋白α S、血管生長抑素(Κ1-3)、藍色螢光蛋白(BFP)、鈣調蛋白(CalM)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、綠色螢光蛋白(GFP)、白細胞介素I受體拮抗劑(IL-1Ra)、螢光素酶、組織轉穀氨醯胺酶(tTg)、嗎啡調節神經肽(MMN)、神經肽Y(NPY)、食慾肽-B、瘦蛋白、ACTH、降鈣素、腎上腺髓質素(AM)、甲狀旁腺激素(PTH)、防禦素和生長激素。作為活性治療劑應用的各種蛋白質和肽，可在它們的一級結構、二級結構、三級結構、大小、分子量、溶解度、電荷分布、粘度和生物功能上有很大的不同。包含FPs的衍生物也包括在本發明的範圍內，這些衍生物是在FPs合成過程中或合成後例如通過以下方法進行差異修飾得到的:苄基化、糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、PEG化、通過已知的保護基團/封閉基團進行的衍生化、蛋白水解切割、與抗體分子或其他細胞配體的鍵合等。在一個實施方案中，FPs在N末端進行乙醯化和/或在C末端進行醯胺化。在另一個實施方案中，將FPs與聚合物綴合，所述聚合物例如本領域公知能促進多肽的口服遞藥、降低多肽的酶促降解、增加多肽的溶解度或者以別的方式改進治療性多肽的化學特性以便給予人或其他動物的聚合物。本發明的肽活性治療劑-ELP構建物可通過公知的重組表達技術獲得。為重組產生肽活性治療劑-ELP構建物，將編碼該構建物的核酸序列操作性地連接到合適的啟動子序列，使得編碼這種融合肽的核酸序列會在宿主細胞中被轉錄和/或翻譯成所需的融合肽。優選的啟動子是可用於在大腸桿菌中表達的啟動子，如T7啟動子。可以使用任何常用的表達系統，例如真核生物系統或原核生物系統。具體的實例包括酵母、畢赤酵母屬、杆狀病毒、哺乳動物和細菌系統，如大腸桿菌和柄桿菌屬(Caulobacter)。
可將包含核酸序列的載體導入細胞中以表達肽活性治療劑-ELP構建物。載體可以保持游離型，或者可整合到染色體中，只要它所攜帶的基因能被轉錄產生所需的RNA。載體可用標準的重組DNA技術方法來構建。載體可以是質粒、噬菌體、黏粒(cosmid)、噬菌粒(phagemid)、病毒，或者本領域公知的用以在原核細胞或真核細胞中進行複製和表達的任何其他類型載體。本領域技術人員會認識到，有多種本領域公知的成分可包括在這種載體中，它們包括多種轉錄信號，如啟動子和其他能調節RNA聚合酶向啟動子上的結合的序列。任何已知在要表達載體的細胞中有效的啟動子，都可用來引發肽活性治療劑-ELP構建物的表達。合適的啟動子可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。合適的啟動子的實例包括SV40早期啟動子區、包含在Rous肉瘤病毒的3'長末端重複序列中的啟動子、HSV-1 (單純皰疹病毒-1)胸苷激酶啟動子、金屬硫蛋白基因的調節序列等，以及以下能顯示組織特異性和已被應用在轉基因動物中的動物轉錄控制區:在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區；在淋巴樣細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區；在睪丸、乳腺、淋巴樣細胞和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區；在肝臟中有活性的清蛋白基因控制區；在肝臟中有活性的α-胎蛋白基因控制區；在肝臟中有活性的α 1-抗胰蛋白酶基因控制區；在類紅細胞中有活性的β-球蛋白基因控制區；在大腦的少突神經膠質細胞中有活性的髓鞘鹼性蛋白基因控制區；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區和在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區。在一個實施方案中，對哺乳動物進行遺傳修飾以在其乳汁中產生肽活性治療劑-ELP構建物。進行這種遺傳修飾的技術在2000年I月11日授權的美國專利6，013，857 (標題:「Transgenic Bovines and Milk from Transgenic Bovines (轉基因牛和轉基因牛產生的牛奶)」)中有描述。將轉基因動物的基因組進行修飾以包含這樣的轉基因，它包含與乳腺啟動子可操作地連接的編碼肽活性治療劑-ELP構建物的DNA序列。該DNA序列的表達導致在乳汁中產生肽活性治療劑-ELP構建物。肽活性治療劑-ELP構建物然後可通過相轉變從獲自轉基因哺乳動物的乳汁中分離得到。轉基因哺乳動物優選是牛。本發明的肽活性治療劑-ELP構建物可用相轉變循環程序使之與其他汙染性蛋白質分離開來而獲得高純度，操作方法是利用肽活性治療劑-ELP構建物的溫度依賴性溶解度，或者將鹽加到含有該構建物的介質中。可使用連續的反相轉變循環來獲得高度純度。除了溫度和離子強度外，其他可用於調節肽活性治療劑-ELP構建物的反轉變的環境變量包括pH、無機和有機溶質和溶劑的加入、側鏈離子化或化學修飾及壓力。在本發明一個具體的示例性實施方案中，構建了 10聚五肽ELP (ELP10聚體)。該ELPlO聚體可進行寡聚化或多聚化達18倍，以產生出具有精確指定分子質量的一文庫的(alibrary of) ELPs (10-、20-、30-、60-、90_、120-、150-和 180 聚體)。然後可將 ELP 聚合物或寡聚物融合到肽活性治療劑的C末端或N末端，以形成肽活性治療劑-ELP構建物。可將第二肽活性治療劑融合到該融合蛋白構建物的ELP成分，產生出三元融合體。任選地，可使用一個或多個間隔序列來將ELP成分與肽活性治療劑隔開。本發明 因此提供了這樣的肽活性治療劑-ELP構建物，其中的肽活性治療劑可以是多種內源分子的任何一種的天然或合成形式，或者是非天然的肽物質，或者任何前述肽的功能等同物。
本發明的肽活性治療劑-ELP構建物克服了肽活性治療劑當進行胃腸外給予時的主要缺陷，即這種肽容易被血漿蛋白酶代謝掉。肽活性治療劑的口服給予途徑更成問題，因為除了胃中的蛋白水解外，胃的高酸性還會在這種肽活性治療劑到達它們預定的靶標組織之前就把它們破壞掉。通過胃和胰腺酶類的作用所產生的肽和肽片段，被腸刷狀緣膜中的外肽酶和內肽酶切割產生二肽和三肽，即使能避免胰酶類的蛋白水解，多肽還會受到刷狀緣肽酶的降解。任何能通過胃部又倖存下來的肽活性治療劑在胃黏膜中又受到代謝作用，黏膜有穿透屏障阻止它們進入細胞。本發明的肽活性治療劑-ELP構建物克服了這種缺陷，提供了在生物利用度、生物不可利用度、治療半壽期、降解抗性等方面具有增強的功效的組合物形式的肽活性治療劑。本發明的肽活性治療劑-ELP構建物因此使得可以採用口服和胃腸外劑型以及各種其他的可使肽活性治療劑以高效的方式得到利用的劑型。例如，這種構建物使得可以使用能實現高度黏膜吸收的劑型，同時還可以用較低的劑量產生最佳的療效。ELP/肽活性治療劑構建物還可包括間隔序列作為構建物的一個部分。間隔序列可以是任何合適的類型，可以是肽間隔序列，或者是非肽化學部分。肽間隔序列可以被蛋白酶切割，或者不被蛋白酶切割。舉例說，可切割的肽間隔序列包括但不限於被各種類型的蛋白酶所識別的肽序列，所述蛋白酶例如凝血酶、因子Xa、纖溶酶(血液蛋白酶)、金屬蛋白酶、組織蛋白酶(例如GFLG等)和在其他身體區室(corporeal compartment)中存在的蛋白酶。不可切割的間隔序列同樣可以是任何合適的類型，包括例如式[(Gly)n-Ser]mK示的不可切割間隔序列部分，其中η為1-4，包括I和4 ;m為1-4,包括I和4。另外，非肽化學間隔序列也可以是任何合適的類型，包括例如在BioconjugateTechniques, Greg Τ.Hermanson,出版 Academic Press, Inc., 1995 中描述的功能接頭(functional linker)和 Cross-Linking Reagents Technical Handbook,獲自 PierceBiotechnology, Inc.(Rockford, Illinois)中指定的功能接頭，兩個參考文獻通過引用結合到本文中。示例性的化學間隔序列包括能連接到Lys的胺基團的同雙功能接頭(homobifunctional linker)及能在一個末端連接Cys和在另一個末端連接Lys的異雙功能接頭(heterobifunctional linker),還有其他能將蛋白質與抗體的Fe區連接的雙功能接頭，其中抗體中的糖首先被氧化成二醇或醛。本發明的肽活性治療劑-ELP構建物可應用於預防或治療病症(condition)或疾病狀態(disease state)。雖然這種構建物在本文中是針對在動物受試者上有用的肽活性治療劑進行描述的，但本發明還構思了對植物系統的病症或疾病狀態的預防或治療有用的肽活性治療劑-ELP構建物。舉例說，在植物上有用的肽活性治療劑-ELP構建物的肽成分可具有殺昆蟲、除草、殺真菌和/或殺害蟲功效。本發明的又一個方面涉及這樣的基因療法，它採用本發明的融合基因治療組合物和相關聯的任何合適類型的載體，例如AAV、牛痘、痘病毒、HSV、反轉錄病毒、脂質轉染、RNA轉移等。

在治療使用中，本發明構思了治療已遭受或潛在易遭受這種病症或疾病狀態且需要這種治療的動物受試者的方法，所述方法包括將對所述病症或疾病狀態有療效的有效量的本發明肽活性治療劑-ELP構建物給予該動物。
要用本發明的肽活性治療劑-ELP構建物治療的動物受試者包括人和非人動物(例如鳥、狗、貓、牛、馬)受試者，優選哺乳動物受試者，最優選人受試者。可將本發明的肽活性治療劑-ELP構建物以任何合適的治療上有效和安全的劑量給予動物受試者，這視所要治療的具體病症或疾病狀態而定，這個劑量可由本領域技術人員根據本文的公開內容無需過多的實驗就容易確定出。一般來說，為實現療效肽活性治療劑-ELP構建物中的肽活性治療劑的合適劑量可例如為I微克(yg)至100毫克(mg)每公斤接受者體重每天，優選10微克(yg)至50毫克(mg)每公斤體重每天，最優選10微克(μ g)至50毫克(mg)每公斤接受者體重每天。所需的劑量可以作為兩個、三個、四個、五個、六個或更多個分劑量來給出，在一天中的適當間隔時間給予。這些分劑量可以以單位劑量形式給予，每個單位劑量形式例如含有10μ g-1000mg、優選50μ g-500mg、更優選50μ g-250mg活性成分。或者，如果接受者的病況需要的話，可以以連續輸注的形式給予劑量。給予方式和劑型當然會影響到對特定治療應用所要求的和有效的肽活性治療劑
治療量。
例如，對於同一肽活性治療劑，口服給予的劑量可以是胃腸外給予方法所用的劑量水平的至少兩倍，例如2-10倍。本發明的肽活性治療劑-ELP構建物可以原樣給予，也可以以其藥物可接受酯、鹽和其他生理上功能衍生物的形式給予。本發明還構思了包含本發明肽活性治療劑-ELP構建物的獸醫用和人醫療用藥物製劑。在這種藥物製劑中·，肽活性治療劑-ELP構建物可以與它的一種或多種藥物可接受載體和任選與任何其他的治療成分一起使用。載體必須在與製劑的其他成分相容和不會對其接受者過度有害的意義上來說是藥物可接受的。肽活性治療劑-ELP構建物是以能有效實現如上所述的所需藥理學作用的量和以適於實現達到所需的日劑量的數量來提供。肽活性治療劑-ELP構建物的製劑既包括適於胃腸外給予的製劑，也包括適於非胃腸外給予的製劑，具體的給予方式包括口服、直腸內、口腔、局部、鼻內、眼內、皮下、肌肉內、靜脈內、透皮、鞘內、關節內、動脈內、蛛網膜下、支氣管內、淋巴、陰道和子宮內給予。優選適合口服給予和胃腸外給予的製劑。當肽活性治療劑-ELP構建物在包括液體溶液的製劑中使用時，該製劑可方便地進行口服給予或胃腸外給予。當肽活性治療劑-ELP構建物在液體混懸劑製劑中使用或者作為散劑在生物相容性載體製劑中使用時，該製劑可以方便地進行口服給予、直腸內給予或支氣管內給予。當肽活性治療劑-ELP構建物以粉末固體的形式直接使用時，活性劑可方便地進行口服給予。或者，它可進行支氣管內給予，這是這樣進行:將粉末在載氣中霧化以形式粉末的氣體分散體，患者從包括合適的噴霧裝置的呼吸管路吸入該氣體分散體。包含本發明肽活性治療劑-ELP構建物的製劑可便利地以單位劑量形式呈現，且可通過藥學領域公知的任何方法來製備。這種方法通常包括將肽活性治療劑-ELP構建物與構成一種或多種輔助成分的載體結合在一起的步驟。通常，製劑是這樣製備的:將肽活性治療劑-ELP構建物與液體載體、微細固體載體或這兩種載體均勻地和緊密地結合在一起，然後如有需要，將產品成形為所需製劑的劑型。適合口服給予的本發明製劑可作為不連續單元(discrete unit)呈現，如膠囊劑、扁囊劑(cachet)、片劑或錠劑，每個不連續單元含有預定量的粉末或顆粒形式的活性成分；或者作為在含水液體或非水液體中的混懸劑呈現，如糖漿劑、酏劑、乳劑或飲劑(draught)片劑可通過壓制或模製來製備，任選加有一種或多種輔助成分。壓製片劑可通過在合適的機器中進行壓制來製備，其中肽活性治療劑-ELP構建物為自由流動形式，如粉末或顆粒，任選與粘合劑、崩解劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或脫模劑(dischargingagent)混合。包含粉末狀肽活性治療劑-ELP構建物和合適載體的混合物的模製片劑，可通過在合適的機器中進行模製來製備。糖漿劑可通過將肽活性治療劑-ELP構建物加到糖(例如蔗糖)的濃縮水溶液中來製備，在該水溶液中還可加入任何輔助成分。這種輔助成分可包括矯味劑、合適的防腐齊U、防止糖結晶的物質和增加任何其他成分的溶解度的物質如多元醇(例如甘油或山梨糖醇)。適合胃腸外給予的製劑便利地包含肽活性治療劑-ELP構建物的無菌含水製品(preparation),該製品優選與接受者的血液等滲(例如生理鹽水溶液)。這種製劑可包含懸浮劑和增稠劑或者其他設計來將肽活性治療劑靶向血液成分或者一個或多個器官的微顆粒系統。這些製劑可以以單位劑量形式或多劑量形式呈現。鼻腔噴霧劑包含純化的肽活性治療劑-ELP構建物水溶液與防腐劑和等滲劑。優選將這種製劑調節到與鼻腔黏膜相容的pH和等滲狀態。供直腸內給予的製劑可作為與合適載體如可可脂、氫化脂肪或氫化脂肪羧酸所成的栓劑呈現。眼用製劑的製備 方法類似於鼻腔噴霧劑，例外的是優選對pH和等滲因素加以調整以與眼睛相匹配。局部用製劑包含溶於或懸浮於一種或多種介質，如礦物油、石油、多元醇或其他用於局部用藥物製劑的基料的肽活性治療劑-ELP構建物。除了上述成分外，本發明的製劑還可包含一種或多種選自以下的輔助成分:稀釋齊 、緩衝劑、矯味劑、崩解劑、表面活性劑、增稠劑、潤滑劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等。以下非限制性實施例更加充分地說明本發明的特徵和優點。實施例以下示例性地給出一些涉及到融合蛋白的實驗對本發明的特徵作更加充分的說明，這些融合蛋白含有與各種不同的ELP序列融合的各種不同的重組蛋白質，如硫氧還蛋白、澱粉酶抑肽、胰島素、Τ20蛋白、幹擾素、菸草蝕紋病毒蛋白酶、小異型二聚體伴侶孤兒受體、雄激素受體配體結合結構域、糖皮質類固醇受體配體結合結構域、雌激素受體配體結合結構域、G蛋白、1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構酶肽、血管生長抑素(Κ1-3)、藍色螢光蛋白(BFP)、鈣調蛋白(CalM)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、綠色螢光蛋白(GFP)、白細胞介素I受體拮抗劑(IL-1Ra)、螢光素酶、組織轉穀氨醯胺酶(tTg)、嗎啡調節神經肽(MMN)、神經肽Y(NPY)、食慾肽-B、瘦蛋白、ACTH、降鈣素、腎上腺髓質素(AM)、甲狀旁腺激素(PTH)、防禦素和生長激素。實施例1:
蛋白質和長肽的產生和純化在所給出的案例研究中，使含有ELP-(TEV)-肽/蛋白質構建物的大腸桿菌菌株BL21star (Invitrogen)在補加有抗生素的培養基中37°C生長24小時，不作誘導。收穫培養物，重懸在50mM Tris-HCL pH8.0和ImM EDTA中。細胞通過在冰上超聲破碎進行裂解。細胞碎片通過在20，OOOg下4°C離心30分鐘進行去除。通過在25°C下向裂解物中加入NaCl至最終濃度1.5M，然後在25°C下20，OOOg離心15分鐘，誘導反溫度轉變。所得的沉澱含有ELP-(TEV)-肽/蛋白質融合體和非特異性NaCl沉澱蛋白質。將沉澱重懸於40ml用冰預冷的緩衝液中，20，000g，4°C下離心15分鐘，以除去非特異性的不溶性蛋白質。將溫度轉變循環再反覆進行三次，以提高ELP-TEV融合蛋白的純度和將最終體積減少到小於5ml。肽/蛋白質與ELP的分離是通過加入ELP-TEV蛋白酶並在25°C下溫育18小時來實現。在0.5M NaCl存在下用最終溫度轉變，然後在室溫下10，OOOg離心，以進一步將被切割的肽/蛋白質從ELP和ELP-TEV蛋白酶純化出來。經NaCl轉變的ELP、ELP-TEV蛋白酶和不被切割的ELP-肽/蛋白質存在於不可溶部分，而肽/蛋白質則保留在可溶部分中。進行HPLC和液相色譜質譜(LC-MS)分析，以檢驗TEV切割的ELP- (TEV)-肽/蛋白質的準確性和肽/蛋白質的最終純度。用通過ExPASy tools ProtParam計算得到的消光係數,分光光度法測定ELP-(TEV)-肽/蛋白質、ELP和純化的肽/蛋白質的濃度。(19th AnnualAmericanPeptide Symposium, 2005 年 6 月；展板展示)。37胺基酸肽的產生用以上(deltaPhase )系統表達和純化37胺基酸肽。表達的ELP-肽融合體通過幾輪轉變來純化。純化的融合體與TEV蛋白酶溫育以將肽切割。在單獨的實驗中將TEV蛋白酶製備成ELP融合體，這使得TEV蛋白酶在溫育後隨同被切割的ELP —起從溶液中分離出來。結果在圖1中顯示，其中M是分子量標記，S是超聲處理後的裂解物，P是離心所得的沉澱(轉變前)，L是可溶性裂解物，Tn是第η次轉變所得的沉澱。圖2顯示分子量和純度的LC-MS驗證結果，由圖可見所得的肽純度大於90%，同時有微量的脫醯胺所產生的雜質。一系列肽變體的快速產生然後測定對於一系列的肽可能實現的通量和純度。表I所示的結果證明在一系列的肽中能夠產生一致的結果。之前，化學合成的局限使肽的產生限制在每3-6星期產生一個肽，這限制了進行肽優化的速度。使用如上所述的deltaPhase 系統，可在不到兩星期時間裡產生出以下六個肽。由於這個系統能夠進行平行運行，其實本應能夠容易地使通量在幾個星期內增加到數百個。表1:一系列肽 變體的產率和純度。
權利要求
1.一種融合蛋白(FP)治療組合物，所述FP治療組合物包含與至少一個肽活性治療劑偶聯的至少一個彈性蛋白樣肽(ELP)。
2.權利要求1的FP治療組合物，其中所述ELP與肽活性治療劑在其N末端或C末端共價鍵合。
3.權利要求1的FP治療組合物，所述FP治療組合物包含至少兩個肽活性治療劑，其中一個肽活性治療劑在N末端與ELP共價鍵合，另一個肽活性治療劑在C末端與ELP共價鍵
4.權利要求1的FP治療組合物，其中所述肽活性治療劑相對於相應的不與ELP偶聯的肽活性治療劑來說其特徵在於增強的體內功效。
5.權利要求4的FP治療組合物，其中所述增強的體內功效包括選自以下的增強的特徵:溶解性、生物利用度、生物不可利用度、有效治療劑量、製劑相容性、蛋白水解抗性、給予的肽活性治療劑的半壽期、給予後在身體內的持續性和給予後從身體的清除率。
6.權利要求1的FP治療組合物，所述治療組合物還包括在ELP和肽活性治療劑之間的間隔序列部分。
7.權利要求6的FP治療組合物，其中所述間隔序列部分選自:控制組合物的藥代動力學的部分、蛋白酶不敏感性部分、非肽化學部分、凝血酶、Xa因子、血液蛋白酶、金屬蛋白酶、組織蛋白酶、可連接到Lys的胺基團的同型雙功能接頭；可在一個末端與Cys連接、在另一個末端與Lys連接的異型雙功能接頭；和可將蛋白質連接到抗體的Fe區的雙功能接頭。
8.權利要求6的FP治療組合物，其中所述間隔序列部分包含選自具有式[(Gly)n-Ser]m的非可切割間隔序列部分的部分，其中η為1-4，包括I和4 ;m為1_4，包括I和4。
9.權利要求1的FP治療組合物，其中所述ELP包括重複肽序列，其中所述重複肽序列選自聚四肽、聚五肽、聚六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽。
10.權利要求1的FP治療組合物，其中所述ELP包括多聚或寡聚重複單元，其中所述重複單元選自 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:ll 和 SEQID NO:12o
11.權利要求1的FP治療組合物，其中所述肽活性治療劑包括選自以下的蛋白質:胰島素A肽、T20肽、幹擾素α 2Β肽、菸草蝕紋病毒蛋白酶、小異型二聚體伴侶孤兒受體、雄激素受體配體結合結構域、糖皮質類固醇受體配體結合結構域、雌激素受體配體結合結構域、G蛋白a Q、l-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構酶肽、G蛋白α S、血管生長抑素、藍色螢光蛋白、鈣調蛋白、氯黴素乙醯轉移酶、綠色螢光蛋白、白細胞介素I受體拮抗劑、螢光素酶、組織轉穀氨醯胺酶、嗎啡調節神經肽、神經肽Y、食慾肽-B、瘦蛋白、ACTH、降鈣素、腎上腺髓質素、甲狀旁腺激素、防禦素和生長激素。
12.權利要求1的FP治療組合物，其中所述ELP包含五肽Ile-Pro-Gly-X-Gly或Leu-Pro-Gly-X-Gly的寡聚重複單元，其中X為任何天然或非天然胺基酸殘基，且其中X任選在各多聚或寡聚重複單元之間有變化。
13.權利要求12的融合蛋白，其中所述多聚或寡聚重複單元的X成分包含一個或多個選自以下的胺基酸殘基:丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸殘基。
14.一種融合基因治療組合物，所述融合基因治療組合物包括編碼包含與至少一個彈性蛋白樣肽(ELP)偶聯的至少一個肽活性治療劑的融合蛋白的核苷酸序列。
15.權利要求14的融合基因治療組合物，其中所述核苷酸序列可操作地連接到表達控制兀件。
16.權利要求15的融合基因治療組合物，其中所述表達控制元件包含啟動子。
17.一種增強肽活性治療劑的體內功效的方法，所述方法包括將所述肽活性治療劑與至少一個彈性蛋白樣肽(ELP)偶聯以形成融合肽治療組合物，其中所述肽活性治療劑相對於相應的不與ELP偶聯的肽活性治療劑來說其特徵在於增強的體內功效。
18.權利要求17的方法，其中所述增強的體內功效是所述肽活性治療劑對抗蛋白水解降解的穩定化作用。
19.權利要求17的方法，其中所述增強的體內功效是所述肽活性治療劑的提高的生物利用度。
20.一種治療需要肽活性治療劑的受試者的方法，所述方法包括給予所述患者包括以下的治療組合物:(i)所述與至少一個ELP偶聯的肽活性治療劑，或者(ii)編碼包含所述肽活性治療劑和至少一個ELP的融合蛋白的、可操作地連接到其表達控制元件的核苷酸序列。
21.一種治療劑劑型，其中所述治療劑與ELP綴合。
22.權利要求20的治 療劑劑型，所述劑型適於口服或胃腸外給予。
全文摘要
本發明涉及融合肽治療組合物。具體地，本發明提供含有包含彈性蛋白樣肽(ELPs)和肽活性治療劑的融合蛋白(FPs)的治療組合物，及製備和使用這種組合物和融合蛋白的方法。這類治療組合物與單獨的肽活性治療劑相比，使得肽活性治療劑的改進功效得以實現。與相應的含有相同肽活性治療劑但不含相關ELPs的組合物相比，本發明治療組合物中的肽活性治療劑的增強的功效可包括改進的溶解性、生物利用度、生物不可利用度和半壽期等。
文檔編號C07K14/78GK103230598SQ201310127490
公開日2013年8月7日 申請日期2007年9月6日 優先權日2006年9月6日
發明者A.基爾科蒂 申請人:費斯生物製藥公司