一種葡萄糖的比色檢測方法
2023-05-18 17:10:36 1
一種葡萄糖的比色檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種葡萄糖的比色檢測方法，是將樣品經預處理、加緩衝液稀釋後與葡萄糖氧化酶混合，反應生成過氧化氫，然後加入二硫化鉬溶液、顯色劑和緩衝液，混合反應後，採用目視比色法或紫外-可見分光光度計測定得出樣品中葡萄糖的含量。本發明利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，再以二硫化鉬為催化劑催化過氧化氫與顯色劑的顯色反應，採用目視比色法半定量測定葡萄糖濃度，或通過紫外分光光度計定量測定葡萄糖濃度。本發明解決了現有技術中對葡萄糖檢測的操作要求高，檢測過程複雜，檢測成本高，檢測時間長，背景幹擾大等問題，本發明的方法成本低、操作簡便、能夠實現可視化快速檢測樣品中葡萄糖含量。
【專利說明】—種葡萄糖的比色檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於葡萄糖檢測【技術領域】，具體涉及一種葡萄糖的比色檢測方法。
【背景技術】
[0002]近年來由於飲食結構的改變、生活節奏的日趨緊張以及少動多坐的生活方式等諸多因素的影響，全球糖尿病的發病率增長迅速，使糖尿病成為繼腫瘤、心血管病變之後第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病。血清中葡萄糖含量的檢測是臨床檢驗和監控糖尿病的主要手段。目前用於血清葡萄糖含量檢測的國家衛生標準參考方法(標準號:WS/T 350-2011)是採用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶聯合的方法。這些天然酶在溫和條件下具有較高的底物特異性和催化效率，但是天然酶存在純化困難、易失活、不易保存、價格較高等缺點。在目前已經公布的葡萄糖含量檢測相關專利中，主要為電化學方法(專利號:200710176028.0 ;專利號:200910067282.6 ;專利號:201010617684.1 ；專利號:201110083906.0 ;專利號:201110391001.X ；專利號:201110343243.1 ；專利號:201110345081.5 ;專利號:201220071992.3 ;專利號:201210189645.5 ;專利號:201210416267.X ;專利號:201310087177.5 ;專利號:201310141232.4 ;專利號:201310290148.9 ;專利號:201310354574.4)。電化學檢測靈敏度高，但是容易受到血氧以及血液中其他電活性物質的幹擾，而且在檢測過程中需要消耗一定的能量，另外，電極的製備往往較為複雜且無法直觀判斷血清葡萄糖含量，需要專門的儀器。其他檢測葡萄糖的方法如共振散射光譜法(專利號:200810073470.5)、近紅外光譜法(專利號:98100787.2)、化學發光法(專利號:200910236714.1 ;專利號=201210509888.2)、螢光光譜法(專利號:200680029822.6 ;專利號:201310250093.9)等都需憑藉昂貴的專業儀器並且在專業技術人員的操作下才能完成對葡萄糖的檢測。而葡萄糖快速測定的相關試劑盒(專利號:201210459910.7)、試紙(專利號:200410033020.5 ;專利號:201210579953.9)等因其構造複雜，製作過程繁瑣，價格昂貴，在實際應用中也受到很大的限制。基於酶催化體系的比色檢測法是近年來較熱門的檢測方法，它利用反應過程中體系顏色及色度的變化實現對目標物的檢測，具有檢出限低，靈敏度高的優點，但是常需要使用過氧化物酶(HRP)，而過氧化物酶價格較高、易失活、不易保存。因此，又有人提出基於模擬酶檢測血清葡萄糖的方法。自中國科學院閻錫蘊課題組發現納米材料四氧化三鐵具有類過氧化物酶催化活性(NatureNanotechnology, 2007, 2, 577-583)以來，汪爾康等人利用該特性實現了對過氧化氫和葡萄糖的檢測(Analytical Chemistry, 2008,80, 2250-2254),氧化石墨烯也被發現具有類過氧化物酶活性，並已應用於過氧化氫和葡萄糖的檢測(Advanced Materials, 2010，20，2255-2262)。在申請的專利中，人們也提出基於模擬酶比色檢測葡萄糖的方法(專利號:201110275358.1 ;專利號:201310244132.4 ;專利號:201310260524.X)。然而這些方法成本高、顏色變化較為單一、不易保存攜帶。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在於提供一種葡萄糖的比色檢測方法，利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，再以二硫化鑰為催化劑催化過氧化氫與顯色劑的顯色反應來檢測葡萄糖，可解決現有技術中對葡萄糖檢測的操作要求高，檢測過程複雜，檢測成本高，檢測時間長，背景幹擾大等問題，本發明的方法成本低、操作簡便、能夠實現可視化快速檢測樣品中葡萄糖的含量。
[0004]為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
一種葡萄糖的比色檢測方法，是將樣品經預處理，加緩衝液稀釋後與葡萄糖氧化酶混合，反應生成過氧化氫，然後加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩衝液進行顯色反應，採用目視比色法，將反應後的溶液顏色與比色標準系列進行比較，或在顯色反應後加入硫酸溶液終止反應，再採用目視比色法半定量測定葡萄糖的濃度。
[0005]所述比色標準系列的製備是將葡萄糖標準品加緩衝液稀釋，配製成已知的不同濃度的葡萄糖標準溶液與葡萄糖氧化酶混合反應後，加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩衝液進行顯色反應即得比色標準系列，或在顯色反應後加入硫酸溶液終止反應得到比色標準系列。
[0006]一種葡萄糖的比色檢測方法，是將樣品經預處理，加緩衝液稀釋後與葡萄糖氧化酶混合，反應生成過氧化氫，然後加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩衝液，顯色反應後採用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，或在顯色反應後加入硫酸溶液終止反應，再採用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，並根據標準曲線方程計算葡萄糖的含量。
[0007]所述標準曲線方程的建立是將葡萄糖標準品加緩衝液稀釋，配製成已知的不同濃度的葡萄糖標準溶液與葡萄糖氧化酶混合反應後，加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩衝液，顯色反應後採用紫外-可見分光光度計測定在652 nm波長處的吸光度，或在顯色反應後加入硫酸溶液終止反應，再採用紫外-可見分光光度計在450 nm波長處測定吸光度，並以吸光度作為縱坐標，葡萄糖的濃度作為橫坐標，繪製標準曲線並得出標準曲線方程。
[0008]稀釋樣品和葡萄糖標準品所用緩衝液的pH值為3-9。
[0009]顯色反應中所用緩衝液的pH值為1-9。
[0010]顯色反應的溫度為30?60 °C。
[0011]所用的顯色劑為3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺、2，2-聯氮-二(3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸)二銨鹽或鄰苯二胺。
[0012]本發明的顯著優點是:
(I)本發明通過葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，再由二硫化鑰催化顯色劑與過氧化氫反應產生顏色變化，以指示葡萄糖的不同濃度。葡萄糖濃度不同，則溶液顏色及顏色深淺均不同；通過肉眼觀察即可判斷葡萄糖是否超標，而不必藉助任何儀器，因此檢測成本低，操作簡便。
[0013](2)本發明所使用的二硫化鑰無需修飾即可用於葡萄糖的檢測。
[0014](3)本發明中分光光度法檢測葡萄糖的檢測限可以達到I PM，線性範圍為5 UM到 150 uM (R2=0.9992)。
[0015](4)本發明的反應條件溫和，檢測速度快，重現性好，且無需昂貴的檢測儀器，操作簡便，可實現葡萄糖的可視化快速識別和檢測。【具體實施方式】
[0016]標準葡萄糖溶液的檢測:將20 μ L葡萄糖氧化酶溶液與180 μ L用緩衝液(pH3-9)配製的不同濃度的葡萄糖溶液混合,3(T60°C下反應30 min,然後加入0.05 mL的二硫化鑰溶液、0.05 mL顯色劑和0.2 mL緩衝溶液(pH 1_9)，混勻，放置30 min後，利用目視比色法進行半定量分析，或利用紫外-可見分光光度法在652 nm波長處測定吸光度，進行定量分析；或者加入10 μ L 20% (V/V)硫酸溶液終止反應後,利用目視比色法進行半定量分析或利用紫外-可見分光光度法在450 nm波長處測定吸光度，進行定量分析。
[0017]樣品中葡萄糖檢測:取30 μ L樣品，用水稀釋到50 μ L，然後加入500 μ LBa(OH)2溶液，混勻，再加入500 μ L ZnSO4溶液，混勻後在3880 rpm離心10 min。取200UL上清液，用緩衝液(pH 3-9)稀釋5倍，作為測試樣品。其他操作同標準葡萄糖溶液的測定。[0018]所用的顯色劑為3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺、2，2_聯氮-二(3_乙基-苯並噻唑-6-磺酸)二銨鹽或鄰苯二胺。
[0019]下面結合實施例對本發明作進一步說明:
實施例1
標準葡萄糖溶液的檢測:將20 UL葡萄糖氧化酶溶液(10 mg/mL)與180 yL用醋酸-醋酸鈉緩衝液(10 mM,pH 3)配製的不同濃度的葡萄糖溶液混合,30 °C下反應30 min,然後加入0.05 mL的二硫化鑰溶液(18 mg/L)、0.05 mL 2，2-聯氮-二(3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸)二銨鹽(20 mM)和0.2 mL醋酸-醋酸鈉緩衝溶液(10 mM,pH I)，混勻，放置30 min後，利用目視比色法進行半定量分析，或利用紫外-可見分光光度法在405 nm波長處測定吸光度，進行定量分析。
[0020]血清葡萄糖檢測:取30 μ L血清樣品，用水稀釋到50 μ L，然後加入500 μ LBa(OH)2 溶液(0.11 Μ)，混勻，再加入 500 μ L ZnSO4 溶液(0.0765 Μ)，混勻後在 3880 rpm離心10 min。取200 μ L上清液，用醋酸-醋酸鈉緩衝液(lOmM，pH 3)稀釋5倍，作為測試樣品。其他操作同標準葡萄糖溶液的測定。
[0021]實施例2
標準葡萄糖溶液的檢測:將20 UL葡萄糖氧化酶溶液(10 mg/mL)與180 yL用Tris-HCl緩衝液(10mM，pH 9)配製的不同濃度的葡萄糖溶液混合，60°C下反應30 min，然後加入 0.05 mL 的二硫化鑰溶液(18 mg/L)、0.05 mL 鄰苯二胺(0.3M)和 0.2 mL Tris-HCl緩衝溶液(10mM，pH 9)，混勻，放置30min後，利用目視比色法進行半定量分析，或利用紫外-可見分光光度法在450 nm波長處測定吸光度，進行定量分析。
[0022]血清葡萄糖檢測:取30 μ L血清樣品，用水稀釋到50 μ L，然後加入500 μ LBa(OH)2 溶液(0.11 Μ)，混勻，再加入 500 μ L ZnSO4 溶液(0.0765 Μ)，混勻後在 3880 rpm離心10 min。取200 μ L上清液，用Tris-HCl緩衝液(10mM，pH 9)稀釋5倍，作為測試樣品。其他操作同標準葡萄糖溶液的測定。
[0023]實施例3
標準葡萄糖溶液的檢測:將20 UL葡萄糖氧化酶溶液(10 mg/mL)與180 yL用Tris-HCl 緩衝液(10mM，pH 6.9)配製的濃度依次為 0μΜ、5μΜ、20μΜ、40μΜ、60 μ Μ、80 μ Μ、100 μ Μ、150 μ M的標準葡萄糖溶液分別混合，37--C下反應30 min,然後加入0.05mL 二硫化鑰溶液(18 mg/L)、0.05 mL 3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺溶液(12 mM)和0.2 mLTris-HCl緩衝溶液(10mM，pH 6.9)，混勻，在30°C下放置30 min後，利用目視比色法進行半定量分析，或利用紫外-可見分光光度法在652 nm波長處測定吸光度，進行定量分析；或者加入10 u L 20% (V/V)硫酸溶液終止反應後，利用目視比色法進行半定量分析或利用紫外-可見分光光度法在450 nm波長處測定吸光度，進行定量分析。
[0024]結果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，二硫化鑰催化3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺進行顯色反應的產物在652 nm左右的吸光度逐漸增大，相應溶液的顏色由黃色逐漸變為淺綠色，再由藍綠色變至藍色。加入硫酸終止反應後，隨著葡萄糖濃度的增加，二硫化鑰催化3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺進行顯色反應的產物在450 nm左右的吸光度逐漸增大，相應的溶液的顏色由淺黃色逐漸變為深黃色，線性方程為Y=0.234+0.0114X (R2=0.9992)。
[0025]血清葡萄糖檢測:取30 UL血清樣品用水稀釋到50 yL，然後加入500 U LBa(OH)2 溶液(0.11 M)，混勻，再加入 500 u L ZnSO4 溶液(0.0765 M)，混勻後在 3880 rpm離心10 min。取200 U L上清液，用Tris-HCl緩衝液(10 mM,pH 6.9)稀釋5倍作為測試樣品，其他操作同標準葡萄糖溶液的測定。
[0026]結果顯示，隨著血清中葡萄糖濃度的升高，測試樣品溶液顏色(藍色或深黃色)逐漸加深。
[0027]本發明利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，再以二硫化鑰為催化劑催化過氧化氫與顯色劑的顯色反應來檢測葡萄糖，隨著葡萄糖濃度不同，溶液顏色及顏色深淺均不同，通過肉眼觀察即可判斷葡萄糖是否超標，而不必憑藉任何儀器，因此檢測成本低，操作簡便。而分光光度法檢測葡萄糖的檢測限可以達到I PM，線性範圍為5 PM到150UM (R2=0.9992)。本發明反應條件溫和，檢測速度快，重現性好，可實現葡萄糖的可視化快速識別和檢測。
[0028]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
【權利要求】
1.一種葡萄糖的比色檢測方法，其特徵在於:將樣品經預處理，加緩衝液稀釋後與葡萄糖氧化酶混合，反應生成過氧化氫，然後加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩衝液進行顯色反應，採用目視比色法，將反應後的溶液顏色與比色標準系列進行比較，或在顯色反應後加入硫酸溶液終止反應，再採用目視比色法半定量測定葡萄糖的濃度。
2.根據權利要求1所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特徵在於:所述比色標準系列的製備是將葡萄糖標準品加緩衝液稀釋，配製成已知的不同濃度的葡萄糖標準溶液與葡萄糖氧化酶混合反應後，加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩衝液進行顯色反應即得比色標準系列，或在顯色反應後加入硫酸溶液終止反應得到比色標準系列。
3.—種葡萄糖的比色檢測方法，其特徵在於:將樣品經預處理、加緩衝液稀釋後與葡萄糖氧化酶混合，反應生成過氧化氫，然後加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩衝液，顯色反應後採用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，或在顯色反應後加入硫酸溶液終止反應，再採用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，並根據標準曲線方程計算葡萄糖的含量。
4.根據權利要求3所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特徵在於:所述標準曲線方程的建立是將葡萄糖標準品加緩衝液稀釋，配製成已知的不同濃度的葡萄糖標準溶液與葡萄糖氧化酶混合反應後，加入二硫化鑰溶液、顯色劑和緩衝液，顯色反應後採用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，或在顯色反應後加入硫酸溶液終止反應，再採用紫外-可見分光光度計測定溶液的吸光度，並以吸光度作為縱坐標，葡萄糖的濃度作為橫坐標，繪製標準曲線並得出標準曲線方程。
5.根據權利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特徵在於:稀釋樣品和葡萄糖標準品所用緩衝液的PH值為3-9。
6.根據權利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特徵在於:顯色反應中所用緩衝液的PH值為1-9。
7.根據權利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特徵在於:顯色反應的溫度為 3(T60°C。
8.根據權利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色檢測方法，其特徵在於:所用的顯色劑為3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺、2，2-聯氮-二(3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸)二銨鹽或鄰苯二胺。
【文檔編號】G01N21/78GK103760161SQ201410035356
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月25日 優先權日:2014年1月25日
【發明者】郭良洽, 林天然 申請人:福州大學