蒎胺作為m2抑制劑在製藥中的新應用的製作方法
2023-05-18 01:43:56
專利名稱：蒎胺作為m2抑制劑在製藥中的新應用的製作方法
技術領域：
本發明專利屬於藥物化學領域，涉及蒎胺作為M2抑制劑在製藥中的新應用。
背景技術：
流行性感冒(以下簡稱流感)是一種嚴重危害人類健康的急性呼吸道傳染病，由流感病毒 引發，具有高患病率、流行廣泛、傳播迅速的特點。歷史上曾發生過多次世界範圍的流感大 流行，其中以1918年的西班牙流感流行最為嚴重，有2000多萬人被流感奪去了生命。2009年 ，由墨西哥爆發的"豬流感"目前正嚴重威脅全球人類的生命，給人類生命及社會經濟帶來極 大的損失。
目前預防和治療流感的主要手段是M2離子通道蛋白抑制劑、神經氨酸酶抑制劑和流感疫 苗(JohnBeigel, Mike Bray. Antiviral Research. 2008,78, 91-102)，研究中的抗流感病毒手段有反 義寡核苷酸、核酶和脫氧核酶抑制流感病毒複製或RNA表達等(Christopher F. Basler. Infectious Disorders - Drug Targets. 2007， 7, 282-293)。目前臨床上只有兩類抗流感病毒藥物可供選擇 (Erik De Clercq. Nat Rev Drug Discov. 2006， 5(12):1015-25): M2離子通道蛋白抑制劑，包括金 剛烷胺(Amantadine)和金剛乙胺(rimantadine);和神經氨酸苷酶抑制劑，包括奧司他韋 (oseltamivir)禾口扎那米韋(zanamivir)。
M2抑制劑類藥物以流感病毒基質蛋白M2為作用靶點，通過阻斷質子通道來抑制流感病 毒的複製(Lawrence H. Pinto, and Robert A. Lamb. J Biol Chem. 2006, 281(14):8997-9000)，抑制病毒的脫殼和核酸釋放，從而起到抑制病毒複製和繁殖的作用，進而達到抗流感病毒的目的。 目前市面上僅有的兩個藥物都是金剛烷胺衍生物，其中，金剛烷胺在1966年被FDA批准在美 國上市(束梅英,等.中國醫藥情報,2000, 6, 6:39-40)，用於治療A型流感病毒性感染。金剛乙 胺由Roche公司研發，1987年被批准上市，金剛乙胺口服製劑的藥效比金剛垸胺強4 6倍。這 兩個藥物的主要優點是價格低廉、口服生物利用度高，可以明顯減輕A型流感的症狀，且金 剛乙胺在兒童中的耐受性較好。
但是，該類藥物存在以下明顯缺點(SchnellJR,ChouJJ. Nature. 2008， 451(7178): 591-5): (1)對B型流感病毒無效；(2)存在明顯副作用，引起明顯的胃腸道不良反應；產生中樞神 經毒副作用，主要表現為失眠、注意力分散和神經質；(3)治療過程中易產生耐藥株。儘管 從這兩個單一骨架的藥物上市至今已過去了幾十年，但並沒有任何新型結構的藥物出現，研 究中的藥物絕大部分抑制劑仍以金剛垸作為骨架，因此急需尋找新型結構的抑制劑。本發明 首次鑑定出一個新型的抑制劑，為研發新型的抗流感藥物，解決部分上述的缺點可供了可能。
蒎胺作為已知化合物， 一直作為普通的化學試劑使用，目前還沒有發現任何生物活性的 報導，特別作為抗病毒藥物使用的報導。
發明內容
本發明的目的之一是提供蒎胺作為M2抑制劑在製藥中的新應用。
具體技術方案如下
式I的蒎胺或其藥學上可接受的鹽或其立體異構體作為M2抑制劑在製備預防和治療流 感藥物中的應用。NH5
I
本發明所涉及的蒎胺或其藥學上可接受的鹽或其立體異構體可以作為M2抑制劑，即阻斷 流感病毒的M2離子通道蛋白，抑制流感病毒的複製，達到殺死病毒的作用。因此，該類化合 物可為臨床上抗流感藥物提供新的選擇。
本發明的另一個目的是提供一種用於預防和治療流感的藥物組合物。
具體技術方案如下
一種用於預防和治療流感的藥物組合物，包括有作為M2抑制劑的、具有式I結構的蒎胺 或其藥學上可接受的鹽或其立體異構體，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
本發明通過對大量胺基化合物的體外活性篩選，發現了蒎胺對A型流感病毒具有明顯的 抑制作用，其抑制活性與金剛烷胺接近。研究表明(Anti-viral compounds, US6180816B1): 對流感病毒具有體外抑制作用的化合物，可以預期產生相應體內藥效。蒎胺作為已知化合物， 一直作為普通的化學試劑使用，沒有發現任何生物活性的報導，因此本發明首次發現該化合 物對M2蛋白具有抑制作用，有助於在臨床上產生對流感的治療作用。
式I液胺化合物可以作為藥物組合物中的活性成分，製成藥學上可接受的載體材料或賦 形劑或稀釋劑混合，作為單元劑給藥。適當的單元劑包括口服劑型、注射劑型、直腸劑型 等，每日的劑量依賴於疾病的嚴重性、用藥方式和化合物本身。
說明書附l是蒎胺化合物對流感病毒的抑制作用的結果示意圖2是化合物對流感病毒的M2離子通道蛋白的抑制作用結果示意圖。
具體實施例方式
下面通過製備例和實施例對本發明作進一步說明。這些實施例僅用於說明本發明，但不 以任何方式限制本發明，在本發明的構思前提下對本發明的簡單改進都屬於本發明要求保護 的範圍。除非另有說明，本發明中的百分數是重量百分數。
化合物信息及相關性質如下
1)化合物S-蒎胺
a.商品信息
結構I ; 中文名稱(1S,2S,3S,5R)-(+)-3-蒎胺； 英文名稱(1 S,2S,3S，5R)-(+)-isopinocampheylamine; 其他英文名稱(+)-isopinocampheylamine, (lS,2S，3S,5R)-3-Pinanamine; CAS號13293-47-5;
分子式C10H19N; 分子量153.26;
MDL號MFCD00192239; 供應商Sigma-Aldrich;貨號391662;
b.性質
Asssy: 95%;
Optical activity: [a]22/D +44。， neat;
Refractive index: "20/D 1.481 (lit);
b.p.: 90°CC/18mmHg(lit.);
Density: 0.909 g/mL at 25 °C (lit);
Hazard Codes: Xi;
Risk Statements: 3 6/3 7/3 8;
Safety Statements: 26-36;
WGK Germany: 3;
Flash Point(F): 162 。F;
Flash Point(C): 72。C。
2)化合物R-蒎胺
a.商品信息
結構II ; 中文名稱(1凡2凡3及,55>(-)-3-蒎胺；
英文名稱(li ，27 ,3i ,55>(-Hsopinocampheylainine;
其他英文名稱(-)-isopinocampheylamine, (li ,2i ,3i ，55)-3-Pinanamine;CAS號:69460-11-3; 分子式C1GH19N;
分子量153.26;
MDL號MFCDOO192238; 供應商Sigma-Aldrich; 貨號391654; b.性質
Asssy: 95%;
Optical activity: [a]21/D -42。， neat; Refractive index: n20/D 1.48(lit.); b.p.: 90°C/18mmHg(lit.); Density: 0.909 g/mL at 25°C(lit.); Hazard Codes: Xi; Risk Statements: 3 6/3 7/3 8; Safety Statements: 26-36; WGK Germany: 3; Flash Point(F): 162 。F; Flash Point(C): 72°C。
其對映異構體均由Sigma Aldrich等試劑公司購得。
本發明所述的蒎胺的藥學上可接受的鹽，本領域的技術人員可以根據商業的蒎胺、相應酸結合本領域的常識，藉助於實施例3或4的方法可製備到相應的被胺鹽。
本發明所述的蒎胺的藥學上可接受的鹽，包括合適的酸所成的鹽，有鹽酸、氫溴酸、硫 酸、硝酸、過氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯酸磺 酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、苯磺酸或萘磺酸等。
藉助於實施例1和2的方法可以測定通式I化合物對流感病毒和M2離子通道蛋白的抑制活 性。化合物對病毒的抑制作用依據原理(SidwellRW. Antiviral Research ，2000;48: 1-16):流 感病毒感染MDCK細胞可以引起病變，並導致細胞的死亡。化合物通過阻斷M2離子通道進而 抑制病毒的複製，從而抑制細胞病變的發生和細胞死亡。通過CCK-8試劑測定細胞的活力可 以反映化合物阻斷M2離子通道的活性及其抗流感病毒活性。化合物對M2離子通道的阻斷作 用依據原理根據M2離子通道蛋白的特性，利用酵母和真核細胞表達系統，使M2離子通道 蛋白表達在細胞膜上，在一定的條件下形成離子通道。建立M2離子通道酵母細胞和哺乳動物 細胞模型，用於M2離子通道阻斷劑的篩選。 實施例1:化合物對流感病毒的抑制實驗 實驗材料
流感病毒A/WS/33(H1N1，金剛烷胺耐藥株)，RWSN病毒(H1N1，金剛垸胺耐藥株)， A/HongKong/8/68(H3N2,金剛烷胺敏感株)。細胞MDCK傳代細胞。標準化合物金剛垸胺， Sigma Aldrich。細胞培養10%FBS， DMEM，在37°C， 5%0)2下培養。其他試劑TPCK 胰酶(SigmaAldrich) ， Hanks緩衝液，7.5%BSA (Invitogen)， CCK-8 (Donjindo， Japan) 試驗方法
1.取狀態良好的MDCK細胞按每孔2xl04接種96孔板，於37。C、5。/。C02孵育24小時。準備兩塊96孔板， 一塊板A/WS/33(H1N1,金剛烷胺耐藥株)， 一塊板A/Hong Kong/8/68(H3N2，金剛烷胺敏感株)。
2. 化合物(分別為R-蒎胺和S-蒎胺)的準備化合物以100mmol/L溶於DMSO保存。 化合物用DMEM稀釋，從2mmol/L的濃度開始5倍比稀釋至1.28xl(^mmol/L，各 取5(Vl/孔化合物加入96孔板細胞中，每個濃度6個復孔。
3. 在細胞長滿單層的96孔板中，吸去培養上清用50pl/ L Hanks緩衝液洗細胞2次。加 入含待測化合物的培養基，孵育lh。
4. 病毒感染保存病毒按100倍TCID50稀釋於DMEM培養基(含l嗎/ml TPCK， 0.6% BSA)。每塊板用一種病毒，6個復孔中三個加病毒，三個不加病毒，加感染培養基
(DMEM含l嗎/mlTPCK， 0.6%BSA)，作為化合物毒性實驗孔。每孔加50^1/孔。
5. 72h後加入CCK-8試劑5pl/孔(詳細操作見說明書)，3h後測OD450。
6. 數據分析數據用GraphPad Prism軟體分析，計算化合物抑制病毒的IC50值。 結果見圖l，結果顯示R-蒎胺和S-蒎胺能與陽性對照物金剛烷胺有同等數量級的抑制活
性。R-蔽胺與其藥學上可接受的鹽、S-蒎胺與其藥學上可接受的鹽有相等的抑制活性。 實施例2:化合物對流感病毒M2離子通道蛋白的抑制實驗
1. 細胞的準備將生長狀態良好、穩定表達M2蛋白(野生型M2和耐藥突變型M2)的293Trex 細胞按每孔5X10A3接種96孔板，並同時用lpg/ml的Zeocin誘導，化合物對細胞的毒性 作用研究不用誘導。初篩時一般做兩個復孔，濃度梯度可減少，如四個。復篩時增加。
2. 配製相應濃度的待測化合物用pH5.4的PBS配製。
3. 抑制劑的處理細胞用四環素誘導24小時後加入相應的抑制劑，處理30分鐘。4. PBS處理細胞將孔中的培養基吸乾去掉，加入50jil的PBS (pH5.4或7.4)，處理3小 時(根據細胞狀態觀察結果確定處理時間)，37°C， 5%C02孵育。
5. 補充完全培養基50pl/孔。
6. XTT反應補充完全培養基24小時後，將每孔中的培養基去掉；每孔加入XTT試劑(5ml XTT標記試劑，力卩0.1 ml電子耦合試劑，混勻，再與10ml的完全培養基混勻)75^1/ 孑L。分別於2小時、4小時、8小時、12小時、24小時於490nm光源下測定吸光度。
7. 繪製結果圖。
結果見圖2，結果顯示R-蒎胺和S-蒎胺能與陽性對照物金剛烷胺有同等數量級的抑制活 性。R-蒎胺與其藥學上可接受的鹽、S-蒎胺與其藥學上可接受的鹽有相等的抑制活性。 實施例3: R-蒎胺鹽酸鹽的製備
冰浴下，R-蒎胺(0.25g， 1.6mmo1)慢慢滴加到鹽酸乙醚溶液中，室溫攪拌得白色固體 沉澱，過濾，乙醚洗滌，抽乾得白色固體R-蒎胺鹽酸鹽0.30g,收率97.4%。
麗R (400MHz, DMSO-d) 5: 0.92 (s, 3H), 1.12-1.14 (d, 3H， J=7Hz), 1.19 (s, 3H), 1.23-1,26 (d, 1H, J=7Hz)， 1.70-1.78 (m, 2H), 1.90-1.91 (m， 1H), 1.99-2.02 (m, 1H)， 2.26-2.38 (m, 2H), 3.34 (s, 1H)， 8.22 (s, 3H)。 MS: 154.2 [M+l]+ 。
實施例4: S-蒎胺苯甲酸酸鹽的製備
冰浴下，S-蒎胺(0.35g， 2.3mmo1)溶解於乙醚溶液中，加入苯甲酸(0.27g， 2.3mmo1)， 回流反應30分鐘，濃縮得白色固體沉澱，過濾抽千得米白色固體R-蒎胺鹽酸鹽0.61g，收率 98.3%。
i額MR (400MHz, CDC3) 5: 0.82 (s, 3H)， 1.10-1.12 (d, 3H， J=7Hz)' U3 (s, 3H), 156 (s， 1H),
111.71-1.73 (m, 1H)， 1.81-1.89 (m， 2H), 2.16-2.21 (m, 2H), 2.25-2.28 (m, 1H), 3,38-3.41 (m, 1H)， 7.31-7.35 (m, 2H), 7.39-7.43 (t, 1H, J=14Hz), 8.00-8.02 (t, 2H, J=8Hz)。 MS: 154,2 [M+l]+， 121.1 [M-l]-。
權利要求
1.式I的蒎胺或其藥學上可接受的鹽作為M2抑制劑在製備預防和治療流感藥物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵是，所述蒎胺為(lR,2R,3R,5S)-(-)-3-蒎胺，或為 (lS,2S,3S,5R)-(+)-3-蒎胺，或為(lR,2R，3R，5S)-(-)-3-蒎胺和(lS,2S,3S,5R)-(+)陽3-蒎胺的混合物。
3. —種用於預防和治療流感的藥物組合物，其特徵是，包括有權利要求1所述的作為M2 抑制劑的蒎胺或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
4.根據權利要求3所述的用於預防和治療流感的藥物組合物，其特徵是，蒎胺為 (lR，2R,3R,5S)-(-)-3-蒎胺，或為(1 S,2S，3S,5R)-(+)-3-蒎胺，或為(lR,2R,3R,5S)-(-)-3-蒎胺和 (1 S,2S，3S，5R)-(+)-3-蒎胺的混合物。
全文摘要
本發明公開了一種式I的蒎胺或其藥學上可接受的鹽作為M2抑制劑在製備預防和治療流感藥物中的應用，以及含有式I的蒎胺或其藥學上可接受的鹽的組合物。蒎胺或其藥學上可接受的鹽或其組合物，作為M2離子通道蛋白抑制劑，可以阻斷流感病毒的複製，用於治療流行性感冒，尤其是甲型流感。
文檔編號A61P31/00GK101564386SQ20091003989
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月1日 優先權日2009年6月1日
發明者曾少高, 李楚芳, 胡文輝, 凌 陳 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院