一種抑制人肺癌細胞增殖轉移的siRNA的結構及用途的製作方法

2023-05-06 23:29:46

專利名稱：一種抑制人肺癌細胞增殖轉移的siRNA的結構及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程藥物領域，具體地說是一種針對血管內皮生長因子 (vascular endothelial growthfactor, VEGF)基因的小幹擾 RNA(small interference RNA, siRNA)的序列結構及其成為治療肺癌等惡性腫瘤細胞增殖及侵襲轉移的新型藥物。
背景技術：
肺癌已成為引起人類死亡的常見疾病之一，在我國大中城市的發病率與死亡率均 居各種惡性舯瘤首位。儘管採用多種治療方法，但患者3年及5年生存率仍很低，導致患者 死亡的主要原因與腫瘤的復發與轉移直接相關。癌細胞的增殖和侵襲轉移是一個多因素調控的複雜過程。癌細胞的增殖是腫瘤 細胞通過細胞分裂增加細胞數量和增大腫瘤體積的過程，腫瘤體積的增大會破壞所在組織 器官的結構與功能。癌細胞的侵襲轉移是指腫瘤細胞脫離原發部位，侵入並穿過周圍基質 (此階段為侵襲)，經血液或淋巴循環向遠處擴散(該階段為轉移)的過程。研究顯示，腫瘤細胞分泌的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在新血管形成和癌細胞的增殖及侵襲轉移中發揮著重要作用，VEGF無論是 在體外培養的肺癌細胞中，還是在荷瘤動物的腫瘤細胞中，或是在人體肺癌組織中均有高 表達，且VEGF表達水平與肺癌預後密切相關。Ohta等[OhtaY，et al. Chest, 2002,121 1624-1627]對肺癌研究發現，有淋巴結轉移的原發灶VEGF表達水平高於無轉移者，在 轉移淋巴結中VEGF的表達高於原發灶。VEGF是肺癌預後的獨立因子，VEGF表達高的患 者預後較差[Seto T, et al. Lung Cancer, 2006, 53 (1) 91-96 ；SadasiwanC, et al. ASCO MeetingAbstract,2007，25 7696]。因此，利用相關技術手段降低VEGF表達就有可能降低肺癌增殖及轉移的發生率， 延長患者生命，提高患者生存率和生活質量。RNAi是1998年建立的一種簡便快速的轉錄後基因幹預技術，通過20 23個鹼 基對的小分子雙鏈RNA片段特異性地與同源序列基因結合，從而沉默靶基因，可代替傳統 DNA水平的基因敲除技術。與傳統反義技術相比，RNAi具有作用特異性強，效果好、持續時 間長、細胞內表達穩定、可遺傳等優勢，可廣泛用於目的基因的沉默[Liu G，et al. Histol Histopathol. 2007,22(2) 211-217 ；Fuchs U，et al. Adv cancer Res. 2007，96 :75_102·]。 2003年以來，RNAi在代謝性疾病、病毒感染性疾病、多種惡性腫瘤、神經系統疾病和藥物篩 選等領域的研究應用日益廣泛。鑑於RNAi技術的巨大價值與廣闊應用前景，2002年美國 《SCIENCE》雜誌將其評為全球年度十大科學進展之首。而RNAi的發現者美國科學家Craig Mello和Andrew Fire也因此榮獲2006年諾貝爾生理學及醫學獎。本發明的目的在於尋找能特異高效抑制肺癌細胞增殖的新型基因藥物，即能明顯 降低VEGF基因表達的小分子幹擾RNA(SiRNA)及能改善其生物活性的化學修飾衍生物。

發明內容
本發明的內容是根據VEGF mRNA的序列信息和生物信息學技術設計若干靶向VEGF mRNA的siRNA序列，分別構建VEGF_siRNA質粒載體，轉染A549細胞，建立轉染細胞穩定株， 以螢光定量PCR檢測VEGF-siRNA對VEGF mRNA表達的抑制效果。結果顯示有1條siRNA 序列具有較為理想的抑制VEGF mRNA表達並在體外細胞學實驗中能明顯抑制A549細胞增 殖和轉移，提示可用於肺癌細胞增殖轉移的預防與治療。根據本發明，針對美國國立生物技術信息中心NCBI資料庫中人VEGF mRNA的序列 全長(序列號:NM001033756, CDS =492-1607)中1220 1238位點設計的siRNA能能抑制 VEGF基因表達，有可能成為預防和治療肺癌等惡性腫瘤侵襲轉移的新型生物工程藥物。根據本發明，為增強siRNA的核酸酶抗性、生物利用度、組織靶向性等，本發明包 含了 VEGF-siRNA的各種化學修飾。根據本發明，發明的VEGF-SiRNA及其修飾物可按本領域已知方法配成非腸道給 藥的試劑。根據本發明，本發明的VEGF-siRNA及其修飾物治療組成可應用單獨的有效成分 或組合物形式包括聯合其它反義核酸及其衍生物。根據本發明，本發明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動力學、藥代動 力學、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態、疾病的性質、程度及治療時限 等，以適量的劑量給藥。根據本發明，本發明的實施對嚴重危害人類健康的肺癌等惡性腫瘤增殖轉移的預 防與治療具有重要的社會和經濟效益。
具體實施例方式實驗設計、方法與實驗結果如下1、siRNA設計合成及質粒載體構建在美國國立生物技術信息中心NCBI資料庫中獲取人VEGF mRNA的序列全長(序 列號匪001033756，⑶S =492-1607)。依據siRNA設計原則，結合設計軟體和文獻報導，分 別設計了 12條VEGF-siRNA靶序列。各siRNA靶序列長度19bp，均行BLAST比對檢查，以保 證和其它基因沒有同源性，合成的siRNA轉錄模板長度為64bp，在序列中間為加入9bp莖環 序列分隔的正反向靶序列，尾端插入5個T作為終止序列。上遊和下遊分別加了 BamHI和 HindllI酶切位點。質粒(經HindIII和BamHI酶切後與合成的表達模板DNA片段用T4DNA 連接酶連接，反應條件16°C，8h)改造可表達GFP，轉化DH5ci菌株，塗卡那黴素瓊脂平板， 挑選陽性克隆，擴增並提取質粒，用BamHI和Hind IlI雙酶切鑑定。酶切鑑定正確的克隆 送生物公司測序。pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi載體由上海吉凱基因化學公司合成。2、篩選轉染VEGF-siRNA肺癌A549細胞穩定株2. 1瞬時轉染①取復甦後第三代處於對數生長期的A549細胞，臺盼藍染色，存活 率> 95 %，顯微鏡下計數，以2 X 105個細胞/孔接種於24孔板內。細胞匯合度60 % 80 % 進行轉染。②質粒DNA 1 μ g加入50 μ IOPTI-MEM中混勻；Lipofectamine 20002 μ 1加入 50 μ 1 OPTI-MEM中混合均勻，室溫靜置5min。Lipofectamine2000稀釋液加入質粒DNA稀 釋液中混勻，室溫靜置20min。吸棄細胞培養板內培養液，OPTI洗細胞兩次，加入500 μ 1
40ΡΤΙ-ΜΕΜ。將混合液100 μ 1緩慢加入細胞培養板內，同時輕輕晃動培養板。37°C、5% C02 培養箱中培養，5h後換含10% FBS的1640培養液。2. 2 G418篩選轉染穩定株瞬時轉染後24h細胞按1 3傳代，繼續培養48h，吸棄培養液，加入含 G418500yg/ml的含10% FBS1640培養液。隔日換液，6d後大量細胞死亡，G418濃度調整 至200 μ g/ml，繼續培養至單克隆形成。螢光顯微鏡下挑選出表達GFP的陽性克隆，轉至培 養瓶內擴增。以GFP為報告子，螢光顯微鏡下觀察細胞轉染率。3、螢光定量PCR檢測轉染VEGF-siRNA對A549細胞VEGF mRNA表達影響。4、Western印跡檢測轉染VEGF-siRNA對A549細胞VEGF蛋白表達影響。5、MTT比色法檢測各組細胞增殖能力改變。6、Transwell模型檢測各組A549細胞體外侵襲能力結果1在設計的12條VEGF-siRNA中發現靶向VEGF mRNA 1220 1238位點(序列為 「GATCCGCAGACGTGTAAAT」)的siRNA有較為理想的抑制VEGF mRNA表達的效果，其抑制效率 為73%，經文獻檢索尚未發現有該位點被用於設計siRNA的文獻報導，因此，本專利所發現 的VEGF基因位點和基於該位點所設計的VEGF-siRNA具有自主智慧財產權。2ffestern blot檢測轉染前後A549細胞內源性VEGF蛋白表達結果顯示與對 照組(0. 73士0.01)相比，轉染VEGF-siRNA後A549細胞內源性VEGF蛋白表達明顯降低 (0. 38 士 0. 01，P 0. 05)，5 6d明顯低於對照組水平(P < 0.01)4細胞體外侵襲實驗顯示在Transwe 11小室中接種細胞後20h，與對照組 (108士9)比較，VEGF-siRNA組穿膜細胞數明顯減少(56士9，P < 0. 01)，表明所設計的 VEGF-siRNA可降低A549細胞侵襲能力。
權利要求
一種可特異性結合人血管內皮生長因子(VEGF)基因的小幹擾RNA(siRNA)，其沉默的VEGF mRNA(序列號NM 001033756；CDS492 1607)位點(1220～1238)序列為「GATCCGCAGACGTGTAAAT」。
2.含有權利要求1中的siRNA序列及可藥用載體的藥物組合物。
3.權利要求1中的siRNA用於製備抗肺癌及其它惡性腫瘤細胞增殖轉移藥物的用途。
全文摘要
本發明提供一種抑制人肺癌細胞增殖轉移的siRNA的結構及用途。本發明涉及生物工程藥物領域，具體地說是根據人血管內皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)基因序列信息，設計、合成、篩選小幹擾RNA(small interference RNA，siRNA)，用於抑制(沉默)人VEGF基因表達從而抑制肺癌等惡性腫瘤細胞增殖及侵襲轉移。本發明設計、發現了互補於VEGF mRNA特定區域的siRNA體外對培養的人肺癌A549細胞的增殖轉移有抑制效應。故本發明涉及到針對VEGF基因的siRNA序列、結構及其成為預防和治療肺癌等惡性腫瘤細胞增殖轉移的新型藥物。
文檔編號A61P35/00GK101942441SQ20101011937
公開日2011年1月12日 申請日期2010年3月8日 優先權日2010年3月8日
發明者江其生 申請人:江其生