一種廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑及其應用的製作方法
2023-05-06 05:48:06 2
一種廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑及其應用，所述生物殺菌劑包括沙門氏菌噬菌體和輔劑，沙門氏菌噬菌體至少包括沙門氏菌噬菌體PSA-6、雞白痢沙門氏菌噬菌體PSPu-4-116以及保藏號為CCTCC NO:M2014429的腸炎沙門氏菌噬菌體、保藏號為CCTCC NO:M2014433的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體、保藏號為CCTCC NO:M2014431的德爾卑沙門氏菌噬菌體或保藏號為CCTCC NO:M2014432的倫敦沙門氏菌噬菌體中三種以上的噬菌體；該生物殺菌劑通過多種裂解性沙門氏菌噬菌體的復配作為有效殺菌成分，大大拓寬了殺菌範圍，增加殺菌活性。CCTCC NO:M201443220140919CCTCC NO:M201443120140919CCTCC NO:M201443320140919CCTCC NO:M201442920140919
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物工程領域，具體為一種廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑及其應 用。
【背景技術】
[0002] 沙門氏菌是畜禽養殖中危害嚴重的致病菌，也是引起食物中毒的 重要人畜共患病原菌，在全球範圍內，沙門氏菌感染及汙染問題已引起養禽業、食品安全和 公共衛生界的高度重視，其不僅威脅人畜健康，而且嚴重阻礙了養禽業的發展，成為畜牧生 產和食品安全的重要關注點，目前，由於抗生素藥物的廣泛使用及濫用，整個沙門氏菌屬的 多重耐藥性也從20世紀90年代的20% -30%增加到了本世紀初的70%，隨著抗生素耐藥 性的進一步加劇，沙門氏菌在長期的進化過程中產生了嚴重的多重耐藥現象，目前，對防治 其危害和傳播，尚無有效且安全的措施。
[0003] 裂解性噬菌體作為一種新型的"生物殺菌劑"，正受到國內外專家的廣泛關注和 高度認可，裂解性噬菌體是細菌的天然"殺手"，在殺滅其特異性細菌時非常快速、對人體 和哺乳動物無害、不易產生耐藥和殘留，在應對多重耐藥菌株、食品加工衛生及建立新型畜 牧業等方面有著無限的應用潛力，早在2006年8月，美國食品藥品監督局（FDA)首次批准 了噬菌體（LISTEXTMP100)產品作為食品添加劑，用於防控即食性食品及家禽類製品中李 斯特菌（Zkiteria)汙染，2010年3月，韓國希傑飼料公司又首次使用裂解性沙門氏菌噬 菌體作為飼料添加劑用於殺滅飼料中的雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌，這兩個實例已充 分證實噬菌體作為有效的天然殺菌劑有著極大的應用價值及廣闊的應用前景。專利號為 "ZL201010508259. 9"的中國專利公開了一種保藏號為CCTCCM2010226的沙門氏菌噬菌 體PSA-6,專利號為"ZL201110053518. 8"的中國專利同樣公開了一種保藏號為CCTCCM 2011042的雞白痢沙門氏菌噬菌體PSPu-4-l16,其均對沙門氏菌有一定的殺滅作用。但在 目前的實際應用中，由於沙門氏菌血清型眾多，單一噬菌體由於其裂解特異性限制了其殺 菌範圍，研製一種廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑，拓寬噬菌體殺菌範圍、增加殺菌活性 一直是本領域亟待解決的技術難題。
【發明內容】
[0004] 針對上述問題，提供一種廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑，以多種裂解性沙門 氏菌噬菌體為主要成分，全面、快速、無殘留的殺滅沙門氏菌，有效控制養殖和食品加工過 程中的沙門氏菌的汙染和傳播，本發明是這樣實現的： 一種廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑，包括沙門氏菌噬菌體和輔劑，其特徵在於，所 述沙門氏菌噬菌體至少包括沙門氏菌噬菌體PSA-6、雞白痢沙門氏菌噬菌體PSPU-4-116以 及保藏號為CCTCCN0:M2014429的腸炎沙門氏菌噬菌體（SahofleBaserovar Enteritidisphage)、保藏號為CCTCCN0:M2014433的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體 serovarTyphimuriumphage)、保藏號為CCTCCN0:M2014431 的德爾卑沙門氏菌 噬菌體serovarDerbyphage)或保藏號為CCTCCN0:M2014432 的 倫敦沙門氏菌噬菌體（SahofleBacaserovarLondonphage)中三種以上的噬菌 體。
[0005] 本發明中，所述沙門氏菌噬菌體的含量彡105pfu/mL。
[0006] 本發明所述沙門氏菌噬菌體的含量中，各組分的沙門氏菌噬菌體活噬菌體數量相 同。
[0007] 本發明中，所述輔劑為SM緩衝液。
[0008] -種如本發明所述廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑在殺滅沙門氏菌的應用。
[0009] 本發明中，所述殺滅沙門氏菌中的應用是指：將廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌 劑作為消殺劑，在屠宰場、畜禽產品加工車間及器具、養殖環境中噴灑，防止沙門氏菌汙染。
[0010] 本發明中，所述殺滅沙門氏菌中的應用是指：將廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌 劑作為添加劑添加到畜禽產品中，防止畜禽產品中沙門氏菌的汙染。
[0011] 本發明所述在殺滅沙門氏菌中的應用是指：將廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑 作為藥物添加到畜禽飼料中，或對畜禽體表噴霧，或給畜禽灌服，或給畜禽肌肉注射，預防 畜禽被沙門氏菌感染。本發明的有益效果在於： (1)該廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑是通過多種裂解性沙門氏菌噬菌體的復配作 為有效殺菌成分，與單一裂解性沙門氏菌噬菌體相比，大大拓寬了其殺菌範圍，增加其殺菌 活性。
[0012] (2)由於自然界中裂解性沙門氏菌噬菌體的數量龐大，來源廣，容易分離獲得，因 此，以多種裂解性沙門氏菌噬菌體為主要成分的生物殺菌劑成本低、綠色型、無刺激性氣 味、無環境汙染問題。
[0013] (3)該生物殺菌劑完全為水溶液，容易配置成噴灑液或製劑，可進行快速、徹底、安 全、無殘留的殺滅沙門氏菌乃至耐藥性沙門氏菌。
[0014]
【專利附圖】
【附圖說明】： 圖1為腸炎沙門氏菌噬菌體JN54KDE電鏡照片； 圖2為鼠傷寒沙門氏菌噬菌體JX178電鏡照片； 圖3為德爾卑沙門氏菌噬菌體JX067-2電鏡照片； 圖4為倫敦沙門氏菌噬菌體JSD9電鏡照片； 圖5為實施例噬菌體生物殺菌劑的OD值檢測結果。
【具體實施方式】
[0015] 實施例中過夜培養是指：挑取TSB平板上的單個菌落，將其接種於5mLLB培養基 中，37°C，150rpm震蕩過夜。 實施例中SM緩衝液的配製方法為：NaCl5. 8g，MgS04*7H20 2g，1mol/L的Tris*HCl50ML(pH=7.0)，5mL2%gelatin，加入CldH2O補足至 1000ML。
[0016] 實施例1沙門氏菌噬菌體的分離、擴增純化 本實施例中養雞場的糞尿汙水樣品來自於江蘇省南通市某養雞場；宿主菌為本實驗室 保存的腸炎沙門氏菌SM-54-KDE，分離自濟南市某雞場的病雞。
[0017] 噬菌體分離：採集養雞場的糞尿汙水樣品，將其經雙層濾紙過濾，12000Xg離心 20min，再分別用0. 45iim和0. 22iim濾膜過濾上清液；取IOmL過濾液，加入0. 5mL過夜培 養的宿主菌(含菌量為109cfu/mL)，再加入20mL4XLB培養基，放置於37°C培養12?16h， 次日，取上述培養物以12000Xg離心lOmin，取上清並加入佔上清體積0.3%的氯仿備用； 以點樣試驗，鑑定該上清是否含有腸炎沙門氏菌噬菌體，再對鑑定後含有腸炎沙門氏菌噬 菌體的水樣進行雙層平板法檢測噬菌體噬菌斑數目。
[0018] 擴增：將獲得的腸炎沙門氏菌噬菌體與宿主菌按數量比1:1混合，加入IOOmLLB 液體培養基，再加入CaCl2母液至終濃度lmM，37°C搖振培養12-16h，12000rpm，4°C，離心 lOmin，取上清，擴增得到腸炎沙門氏菌噬菌體裂解液。
[0019] 純化：在獲得的IOOmL腸炎沙門氏菌噬菌體裂解液中加入RNaseA至Iiig/mL、力口 入DNaseI至Iiig/mL，37°C溫育 30min後，加 10.OgPEG8000,5. 84gNaCl，搖勻至溶解， 冰浴Ih(實際操作中，也可以4°C過夜)，再於4°C離心IOOOOrpmIOmin,去上清液；加2mL SM緩衝液，充分洗滌管壁及沉澱，室溫反應Ih;再加入等體積的氯仿抽提，溫和振蕩30s， 再於4°C，5000rpm離心lOmin，分離有機相和親水相，回收含有腸炎沙門氏菌噬菌體顆粒的 親水相，獲得純化的腸炎沙門氏菌噬菌體，雙層平板檢測純化噬菌體，純化的腸炎沙門氏菌 噬菌體的效價為彡10 8pfu/mL。
[0020] 申請人:將該腸炎沙門氏菌噬菌體自命名為JN54KDE，其微生物學特徵為：如圖1所 示，該噬菌體具有呈多面體的頭部結構和可伸縮性的尾部，應屬於肌尾病毒科，該噬菌體屬 於裂解性噬菌體。
[0021] 申請人:將該純化的腸炎沙門氏菌噬菌體JN54KDE保藏於中國典型培養物保藏中 心（CCTCC)，保藏號為CCTCCN0:M2014429,保藏日期為：2014年9月19日，保藏地址為：中 國武漢市武漢大學，郵編：430072。
[0022] 實施例2 鼠傷寒沙門氏菌噬菌體的分離、擴增及純化 本實施例中雞場的糞尿汙水樣品來自於江蘇省南通市某養雞場；宿主菌為鼠傷寒沙門 氏菌HNER178,分離自江西省某養殖場的病死雞體內，本實驗室保存。
[0023] 鼠傷寒沙門氏菌噬菌體的分離、擴增和純化，除宿主菌為鼠傷寒沙門氏菌HNER178 夕卜，其餘步驟與實施例1相同，純化的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體的效價為彡108pfu/mL。
[0024] 申請人:將該鼠傷寒沙門氏菌噬菌體自命名為JX178,其微生物學特徵為：如圖2所 示，該噬菌體具有呈多面體的頭部結構和長尾，應屬於長尾病毒科，該噬菌體屬於裂解性噬 菌體。
[0025] 將純化的裂解性鼠傷寒沙門氏菌噬菌體JX178保藏於中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏號為CCTCCNO:M2014433,保藏日期為2014年9月19日，保藏地址為：中國 武漢市武漢大學，郵編：430072。
[0026] 實施例3德爾卑沙門氏菌噬菌體的分離、擴增及純化 本實施例中汙水樣品來自於江蘇省某農貿市場；宿主菌為德爾卑沙門氏菌HNER067-2,分離自江西某農貿市場，本實驗室保存。
[0027] 德爾卑沙門氏菌噬菌體的分離、擴增及純化，除宿主菌為德爾卑沙門氏菌外，其餘 操作步驟與實施例1相同，純化的德爾卑沙門氏菌噬菌體的效價為彡10 8pfu/mL。 申請人:將 德爾卑沙門氏菌噬菌體自命名為JX067-2,其微生物學特徵為：如圖3所示，該噬菌體具有 呈多面體的頭部結構和長尾，應屬於長尾病毒科，該噬菌體屬於裂解性噬菌體。
[0028] 申請人:將純化的德爾卑沙門氏菌噬菌體JX067-2保存於中國典型培養物保藏中 心（CCTCC)，保藏號為CCTCCNO:M2014431，保藏日期為：2014年9月19日，保藏地址為： 中國武漢市武漢大學，郵編：430072。
[0029] 實施例4倫敦沙門氏菌噬菌體的分離、擴增純化 本實施例中汙水樣品來自於江蘇省某雞場；宿主菌為倫敦沙門氏菌D9,分離自江蘇省 某雞場病雞體內，本實驗室保存。
[0030] 倫敦沙門氏菌噬菌體的分離、擴增及純化，除宿主菌為倫敦沙門氏菌外，其餘操作 步驟與實施例1相同，純化的倫敦沙門氏菌噬菌體的效價為彡10 8pfu/mL。 申請人:將該倫敦 沙門氏菌噬菌體自命名為JSD9,其微生物學特徵為：如圖4所示，該噬菌體具有呈多面體的 頭部結構和可收縮性的尾，應屬於肌尾病毒科，該噬菌體屬於裂解性噬菌體。
[0031] 將純化的倫敦沙門氏菌噬菌體的JSD9在中國典型培養物保藏中心（CCTCC)保藏， 保藏號為CCTCCNO:M2014432,保藏日期為：2014年9月19日，保藏地址為：中國武漢市武 漢大學，郵編：430072。
[0032] 實施例5製備廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑 分別取實施例1-4獲得的腸炎沙門氏菌噬菌體JN54KDE、鼠傷寒沙門氏菌噬菌體JX178、德爾卑沙門氏菌噬菌體JX067-2、倫敦沙門氏菌噬菌體JSD9,以及沙門氏菌噬菌體 PSA-6 (由ZL201010508259. 9公開，下同）和雞白痢沙門氏菌噬菌體PSPu-4-116 (由ZL 201110053518. 8公開，下同），上述6種噬菌體的效價均彡108pfu/mL，將上述6種噬菌體按 照噬菌體數量等比例進行充分混合，加入適量SM緩衝液，即獲得廣譜型沙門氏菌噬菌體生 物殺菌劑，其中沙門氏菌噬菌體數量彡105pfu/mL。
[0033] 實施例6廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑殺菌效果測試 過夜培養的腸炎沙門氏菌SM-54-KDE菌液I.OmL(含菌量為2X109Cfu/mL)用LB將其OD6cicilJt調整為1. 〇 (約為IX10 9cfu/mL)，分別加入實施例5獲得的廣譜型沙門氏菌噬菌 體生物殺菌劑(效價為IX105pfu/mL)和實施例1獲得腸炎沙門氏菌噬菌體JN54KDE，最後 分別用LB調整其OD6ticimiS0. 5左右，於37°C靜置培養，同時以不加噬菌體作為對照組，在培 養的 0、l、2、3、4、5、6、7h檢測OD6tltlmi值的變化。
[0034] 結果如圖5所示，與不加噬菌體的對照組相比，廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌 劑(生物殺菌劑)和腸炎沙門氏菌噬菌體JN54KDE(單株噬菌體）組，Ih後沙門氏菌數量均 增長緩慢，而且2h後，沙門氏菌數量均急劇下降，7小時後沙門氏菌數量將到最低值。從圖 5上可以看出，生物殺菌劑與單株噬菌體殺菌效果一樣迅速和徹底。
[0035] 實施例7廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑的裂菌作用範圍實驗 本實施例中所涉及的311株沙門氏菌菌株：其中腸炎沙門氏菌120株，佔67. 52% ;雞白 痢沙門氏菌27株，佔8. 68% ;鼠傷寒沙門氏菌25株，佔8. 04% ;印第安納沙門氏菌23株，佔 7. 40% ;德爾卑沙門氏菌15株，佔4. 82% ;其餘沙門氏菌共11株，佔15. 75%。
[0036] 實驗分為對照組與實驗組，其中： 對照組1為實施例1獲得的沙門氏菌噬菌體JN54KDE，效價彡105pfu/mL。
[0037] 對照組2為實施例2獲得的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體JX178,效價彡105pfu/mL。
[0038] 對照組3為實施例3獲得的德爾卑沙門氏菌噬菌體JX067-2,效價彡105pfu/mL。
[0039] 對照組4為實施例4獲得的倫敦沙門氏菌噬菌體JSD9,效價彡105pfu/mL。
[0040] 對照組5為沙門氏菌噬菌體PSA-6,效價彡105pfu/mL。
[0041] 對照組6為雞白痢沙門氏菌噬菌體PSPu-4-116效價彡105pfu/mL。
[0042] 對照組7為沙門氏菌噬菌體PSA-6、實施例3獲得的德爾卑沙門氏菌噬菌體 JX067-2和實施例4獲得的倫敦沙門氏菌噬菌體JSD9等量混合後，加入適量SM緩衝液，該 三種噬菌體的效價均彡105pfu/mL。
[0043] 對照組8為實施例1獲得的沙門氏菌噬菌體JN54KDE、實施例2獲得的鼠傷寒沙門 氏菌噬菌體JX178、實施例3獲得的德爾卑沙門氏菌噬菌體JX067-2和雞白痢沙門氏菌噬菌 體PSPu-4-116等量混合後，加入適量SM緩衝液，該4種噬菌體的效價均> 105pfu/mL。
[0044] 對照組9為沙門氏菌噬菌體PSA-6、實施例1獲得的沙門氏菌噬菌體JN54KDE、實 施例2獲得的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體JX178、雞白痢沙門氏菌噬菌體PSPu-4-116和實施例 4獲得的倫敦沙門氏菌噬菌體JSD9等量混合後，加入適量SM緩衝液，該5種噬菌體的效價 均 > 105pfu/mL。
[0045] 實驗組為實施例5獲得的廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑，效價為IXIO5Pfu/ mL〇
[0046] 實驗過程：分別取311株沙門氏菌過夜培養的菌液IOOul均勻塗布於LB平板，待 其乾燥後分別取IOul實驗組或對照組噬菌體點樣於菌苔表面，並以生理鹽水點樣作對照， 每個樣品做3個重複，待液滴乾燥後倒置於37°C培養箱，培養12~16h於第二天觀察效果。
[0047] 經點樣法測定了沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑和六株單獨噬菌體的裂菌作用範圍， 結果見表1，針對311株沙門氏菌流行株，對照組1-6的裂菌作用範圍在52. 41-66. 88%之 間，對照組7-9的裂菌作用範圍在80. 38-88. 42之間，而實驗組對286株沙門氏菌具有裂解 作用，裂菌作用範圍為91. 96%，結果表明，實驗組具有寬裂菌譜的特性，其裂菌作用範圍顯 著高於單株噬菌體(對照組1-6)。
[0048] 表1噬菌體的裂菌範圍測定結果
【權利要求】
1. 一種廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑，包括沙門氏菌噬菌體和輔劑，其特徵在於， 所述沙門氏菌噬菌體至少包括沙門氏菌噬菌體PSA-6、雞白痢沙門氏菌噬菌體PSPu-4-116 以及保藏號為CCTCC N0:M2014429的腸炎沙門氏菌噬菌體serovar Enteritidis phage)、保藏號為CCTCC N0:M2014433的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體 serovar Typhimurium phage)、保藏號為CCTCC N0:M2014431 的德爾卑沙門氏菌 噬菌體serovar Derby phage)或保藏號為 CCTCC N0:M2014432 的 倫敦沙門氏菌噬菌體serovar London phage)中三種以上的噬菌 體。
2. 根據權利要求1所述廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑，其特徵在於，所述沙門氏 菌噬菌體的含量彡105pfu/mL。
3. 根據權利要求2所述廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑，其特徵在於，所述沙門氏 菌噬菌體的含量中，各組分的沙門氏菌噬菌體活噬菌體數量相同。
4. 根據權利要求2所述廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑，其特徵在於，所述輔劑為 SM緩衝液。
5. 如權利要求1-4之一所述廣譜型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑在殺滅沙門氏菌的應 用。
6. 如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述殺滅沙門氏菌中的應用是指：將廣譜型 沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑作為消殺劑，在屠宰場、畜禽產品加工車間及器具、養殖環境中 噴灑，防止沙門氏菌汙染。
7. 如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述殺滅沙門氏菌中的應用是指：將廣譜型 沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑作為添加劑添加到畜禽產品中，防止畜禽產品中沙門氏菌的汙 染。
8. 如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述在殺滅沙門氏菌中的應用是指：將廣譜 型沙門氏菌噬菌體生物殺菌劑作為藥物添加到畜禽飼料中，或對畜禽體表噴霧，或給畜禽 灌服，或給畜禽肌肉注射，預防畜禽被沙門氏菌感染。
【文檔編號】A01P3/00GK104472550SQ201410717164
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月2日 優先權日:2014年12月2日
【發明者】包紅朵, 王冉, 張輝, 周豔, 張莉莉 申請人:江蘇省農業科學院