細氈毛忍冬中有效成分的分離純化方法
2023-05-01 23:15:11 1
專利名稱：細氈毛忍冬中有效成分的分離純化方法
技術領域：
本發明涉及一種細氈毛忍冬中有效成分的分離純化方法，主要涉及5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮、β_谷甾醇、β_胡蘿蔔苷的分離純化方法。
背景技術：
細租毛忍冬Lonicera similes Hemsl為川產金銀花的主流品種,分布廣，資源蘊藏量大，據調查，成都荷花池中藥材專業市場經銷的金銀花，四川省內中藥店及醫療單位使用的金銀花多為南江產金銀花(細氈毛忍冬)，並銷往全國各地。目前四川南江縣已建成了22個金銀花專業示範村，全縣金銀花種植總面積達到26萬畝，細氈毛忍冬佔了 95%以上，現有10. 2萬畝投產，年產幹銀花765萬公斤，實現總產值2億元，產區人均增收560元。金銀花產業已成為南江縣的主要經濟支柱產業。近年來，不少研究表明細氈毛忍冬綠原酸含量高，藥理作用與藥典收載品種相當。但目前川銀花優勢品種細氈毛忍冬仍未入選中國藥典，尤其是《中國藥典》2010年版，加強了對中藥材專屬性成分的鑑別及含量測定，而細氈毛忍冬尚缺乏相關的基礎研究。5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮對金葡球菌等具有抗菌作用(邢俊波，等，忍冬花蕾化學成分研究[J].中國新藥雜誌，2002，11(11) :856-859)。β-谷留醇，有降低血清膽固醇的作用，可用於II型高脂血症及預防動脈粥樣硬化；同時，該化合物還可以轉化成藥用維生素D3原料以及多種激素。β-胡蘿蔔苷，是神經鞘的主要成分之一，同時還具有抗氧化的藥理活性。目前，還未見從細氈毛忍冬中分離純化5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮等化合物的相關報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮的分離純化方法；本發明的另一目的在於提供β_谷甾醇、β_胡蘿蔔苷的分離純化方法。本發明提供了 5-羥基_7，3'，4'-三甲氧基黃酮的分離純化方法，它包括如下步驟(I)取細租毛忍冬Lonicera similes Hemsl的乾燥花蕾,加入70_90%V/V乙醇提取，合併提取液，回收溶劑，即得細氈毛忍冬總提取物浸膏；(2)取細氈毛忍冬總提取物浸膏，加水配製上柱液，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、80%/V乙醇、90-95%V/V乙醇洗脫，收集90-95%v/v乙醇部位；(3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析，依次用環己烷-乙酸乙酯=20 Γ0 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γ0 I系統進行梯度洗脫，每O. 16個柱體積的洗脫液為I流份，收集洗脫液，薄層監測，取39 59份，回收溶劑後，用甲醇復溶，再上凝膠柱，用甲醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，重結晶，即得5-羥基_7，3'，4'-三甲氧基黃酮。其中，步驟(I)中，所述乙醇提取的具體操作為依次用濃度為90%V/V、80%V/V、70%V/V的乙醇提取；優選地，乙醇提取的具體方法為分別用90%V/V、80%V/V、70%V/V的乙醇回流提取，每個濃度的乙醇提取1-2次，每次1-3小時，物料比為I : 6-10。其中，步驟(2 )中，依次用水、80%/V乙醇、95%V/V乙醇洗脫，收集95%v/v乙醇部位；所述大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。其中，步驟(2)中，上柱液濃度以生藥計為O. 02-0. 2g/ml,比上柱量小於2. 8g藥材/g幹樹脂。進一步地，步驟(2)中，上柱液濃度以生藥計為O. 10g/ml，比上柱量2. 74g藥材/g幹樹脂。其中，步驟(3)中，梯度洗脫條件如下環己烷-乙酸乙酯=20 1，I. 07倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=10 11. 07倍柱體積，環己烷-乙酸乙酯=8 1，3. 3倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=6 I ;1. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=5 1，2. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=4:1，2. O倍柱體積。其中，步驟(3)中，所述凝膠柱為S印hadexLH-20型凝膠柱；重結晶溶劑為甲醇。本發明還提供了 β_谷甾醇的分離純化方法，它包括如下步驟(I)取細租毛忍冬Lonicera similes Hemsl的乾燥花蕾,加入70_90%V/V乙醇提取，合併提取液，回收溶劑，即得細氈毛忍冬總提取物浸膏；(2)取細氈毛忍冬總提取物浸膏，加水配製上柱液，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、80%/V乙醇、90-95%V/V乙醇洗脫，收集90-95%乙醇部位；(3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析，用環己烷-乙酸乙酯=20 Γ0 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γ0 I系統進行梯度洗脫，每O. 16個柱體積的洗脫液為I流份，收集洗脫液，薄層監測，取17 22份，回收溶劑後，重結晶，即得β-谷甾醇；步驟(3 )中，梯度洗脫條件如下環己烷-乙酸乙酯=20 1，I. 07倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=10 11. 07倍柱體積，環己烷-乙酸乙酯=8 1，3.3倍柱體積。本發明還提供了 β -胡蘿蔔苷的分離純化方法，它包括如下步驟(I)取細租毛忍冬Lonicera similes Hemsl的乾燥花蕾,加入70_90%V/V乙醇提取，合併提取液，回收溶劑，即得細氈毛忍冬總提取物浸膏；(2)取細氈毛忍冬總提取物浸膏，加水配製上柱液，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、80%/V乙醇、90-95%V/V乙醇洗脫，收集90-95%乙醇部位；(3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析，用環己烷-乙酸乙酯=20 Γ0 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γ0 I系統進行梯度洗脫，每O. 16個柱體積的洗脫液為I流份，收集洗脫液，薄層監測，取12(Γ124份，回收溶劑後，重結晶，即得β -胡蘿蔔苷;步驟(3 )中，梯度洗脫條件如下環己烷-乙酸乙酯=20 1，I. 07倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=10 I I. 07倍柱體積，環己烷-乙酸乙酯=8 1，3. 3倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=6 I ;1. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=5 1，2. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=4:1，2. O倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=3:1，4. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=2:1，I. 67倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=1:1，2. 12倍柱體積；乙酸乙酯I. 62倍柱體積。
本發明還提供了從細氈毛忍冬中同時分離5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮、β_谷甾醇和β_胡蘿蔔苷的方法，它包括如下步驟(I)取細租毛忍冬Lonicera similes Hemsl的乾燥花蕾,加入70_90%V/V乙醇提取，合併提取液，回收溶劑，即得細氈毛忍冬總提取物浸膏；(2)取細氈毛忍冬總提取物浸膏，加水配製上柱液，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、80%/V乙醇、90-95%V/V乙醇洗脫，收集90-95%v/v乙醇部位；(3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析，用環己烷-乙酸乙酯=20 Γ0 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γ0 I系統進行梯度洗脫，每O. 16個柱體積的洗脫液為I流份，收集洗脫液，薄層監測，梯度洗脫條件如下環己烷-乙酸乙酯=20 1,1.07倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=10 I I. 07倍柱體積，環己烷-乙酸乙酯=8 1，3.3倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=6 I ;1. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=5 1，2.05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=4:1，2. O倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=3:1，4. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=2:1，I. 67倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=1:1，2. 12倍柱體積；乙酸乙酯I. 62倍柱體積；(4)取17 22份流份，回收溶劑後，重結晶，即得β _胡蘿蔔苷；取39 59份，回收溶劑後，用甲醇復溶，再上凝膠柱，用甲醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，重結晶，即得5-羥基_7，3'，4'-三甲氧基黃酮；取12(Γ124份，回收溶劑後，重結晶，即得β_胡蘿蔔苷。本發明的有益效果如下(I)本發明提供了從細氈毛忍冬中分離純化5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮、胡蘿蔔苷、谷留醇的分離純化方法，得到的各化合物純度較高，為細氈毛忍冬藥材
尋找到了新的使用價值；其中，5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮、β-胡蘿蔔苷是首次從細氈毛忍冬中分離得到。(2)本發明提供的從細氈毛忍冬中同時分離5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮、β_胡蘿蔔苷、β_谷留醇的方法，可以在同一操作路徑下，依次分離得到上述三種化合物，與化合物的單獨分離方法相比，本發明更節省試劑用量，提高了原藥材的利用率，極大地節約了化合物的分離純化成本。(3>5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮對金葡球菌等具有抗菌作用，與細氈毛忍冬抗菌、抗病毒的功效相吻合，可能是反映其功能主治的有效成分，本發明對該化合物的有效分離，也為明確細氈毛忍冬的藥效物質基礎提供了可能。
圖I蘆丁對照品溶液和供試品溶液UV-VIS掃描圖
圖2蘆丁對照品溶液標準曲線圖
圖3不同類型大孔樹脂靜態吸附性能分析
圖4上樣液濃度考察結果分析
圖5洩漏曲線圖
圖6細氈毛忍冬提取流程圖
圖7細氈毛忍冬總黃酮部位化學成分分離流程圖
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圖8 β -谷甾醇(β -sitosterol)氫譜9 β -谷甾醇(β -sitosterol)碳譜105-輕基 _7，3' ,4'-三甲氧基黃酮(5-hydroxyl-7, 3』，4』-trimethoxyflavone)氫譜11 5_輕基 _7，3' ,4'-三甲氧基黃酮(5-hydroxyl-7, 3』，4』-trimethoxyflavone)碳譜12β-胡蘿蔔苷(β-Daucosterin)氫譜13β-胡蘿蔔苷(β-Daucosterin)碳譜14細氈毛忍冬的HPLC圖譜
具體實施例方式儀器旋轉蒸發器RE-5203 (上海亞榮生化儀器廠)循環水式多用真空泵SHB- IIK鄭州長城科工貿有限公司)ZF-90型暗箱式紫外投射儀(上海顧村電光儀器廠)。試劑及試藥乙醇、甲醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯化鋁(以上均為分析純，成都市科龍化工試劑廠生產)。柱層析矽膠(青島海洋化工廠生產，100 200目、200 300目)、薄層層析矽膠G (青島海洋化工廠生產)。藥材來源與鑑定實驗所用的細氈毛忍冬藥材採購於四川省南江縣，經成都中醫藥大學馬逾英教授鑑定，為忍冬科植物細租毛忍冬Lonicera similis Hemsl。實施例I 5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮的分離純化方法(I)稱取細氈毛忍冬Lonicera similes Hemsl 的乾燥花蕾 I. 9Kg，用 90%、80%、70%的乙醇回流提取，物料比為I : 8，過濾，減壓回收乙醇，得浸膏。經測定，該提取物中含有總黃酮3. 39%ο(2)取上述浸膏，加水配製上柱液，上柱液濃度以生藥計為0. 10g/ml，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、濃度為10%、20%、40%、60%、80%、95%V/V的乙醇洗脫，收集95%乙醇部位；(3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析(200-300目，350g，柱體積925ml)，用環己烷-乙酸乙酯=20 Γθ 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γθ I系統進行梯度洗脫，每流份150ml，收集洗脫液，薄層監測，合併相同流份，取39 59份，回收溶劑後，用甲醇復溶，再上S印hadexLH-20凝膠柱，用甲醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，重結晶，即得5-羥基-7，3' ,4'-三甲氧基黃酮(35mg)，轉移率為0. 17%。梯度洗脫的條件為己燒-乙酸乙酯=20 : I (997. 5ml),環己燒-乙酸乙酯=10 : I (990ml),環己烷-乙酸乙酯=8 I (3050ml)，環己烷-乙酸乙酯=6 I (970ml)，環己烷-乙酸乙酯=5 : I (1901ml),環己燒-乙酸乙酯=4:1 (1855ml),環己燒-乙酸乙酯=3:1 (3755ml),環己烷-乙酸乙酯=2:1 (1550ml)，環己烷-乙酸乙酯=1:1 (1960ml)，乙酸乙酯(1500ml)，乙酸乙酯-甲醇=5 :1 (2035ml)，乙酸乙酯-甲醇=3:1 (1430ml)，乙酸乙酯-甲醇=2 1 (1335ml),乙酸乙酯-甲醇=1:1 (1500ml)，甲醇(1500ml)。化合物鑑定所得化合物為黃色粉末，mpl67^169°C。TLC紫外燈下顯色，噴AlCl3有黃色螢光，鹽酸-鎂粉反應為陽性，三氯化鐵反應為陽性。由此初步判斷為黃酮類或黃酮醇類化合物。ESI-MS m/z:329[M+H]+。1H-NMR(C5D5N, 400ΜΗζ) δ :7.07 (1H, s, H_3)，6. 60 (1H, s, H_6)，6. 73 (1H, s, H_8)，7.57 (1H, s, H-2' )，7. 06 (1H, d, J=8. 6Hz, H_5』), 7. 66 (1H, d, J=8. 6Hz, H_6' )，13. 60 (1H, s, 5-0H)，3. 82 (3H, s, -OCH3)，3. 79 (3H, s, -OCH3)，3. 72 (3H, s, -OCH3)。13C-NMR (C5D5N, 100MHz) δ 164. 4 (C_2, s)，104. 9 (C_3, d)，182. 9 (C_4, s)，162. 7 (C-5, s)，98. 8 (C-6, d)，166. 0 (C_7, s)，93. I (C_8, d)，158. 2 (C_9, s)，106. 0 (C-10, s)，123. 2(C-Γ，s)，110. 0 (C-2，，d)，149. 6 (C_3，，s)，153. 2 (C_4，，s)，112. 20 (C_5，，d)，120. 7 (C-6』，d)，56. 5 (-OCH3)，56. 4 (-OCH3)，56. 2 (-OCH3)。以上數據與文獻基本一致，故確定為5-羥基_7，3' ,41 -三甲氧基黃酮。
權利要求
1.5-羥基_7，3'，4'-三甲氧基黃酮的分離純化方法，其特徵在於它包括如下步驟(1)取細租毛忍冬Lonicerasimiles Hemsl的乾燥花蕾,加入70_90%V/V乙醇提取,合併提取液，回收溶劑，即得細氈毛忍冬總提取物浸膏；(2)取細氈毛忍冬總提取物浸膏，加水配製上柱液，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、80%/V乙醇、90-95%V/V乙醇洗脫，收集90-95%v/v乙醇部位；(3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析，依次用環己烷-乙酸乙酯=20 Γ0 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γ0 I系統進行梯度洗脫，每O. 16個柱體積的洗脫液為I流份，收集洗脫液，薄層監測，取39 59份，回收溶劑後，用甲醇復溶，再上凝膠柱，用甲醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，重結晶，即得5-羥基_7，3'，4'-三甲氧基黃酮。
2.根據權利要求I所述的分離純化方法，其特徵在於步驟(I)中，所述乙醇提取的具體操作為依次用濃度為90%V/V、80%V/V、70%V/V的乙醇提取；優選地，乙醇提取的具體方法為分別用90%V/V、80%V/V、70%V/V的乙醇回流提取，每個濃度的乙醇提取1_2次，每次1-3小時，物料比為I : 6-10。
3.根據權利要求I所述的分離純化方法，其特徵在於步驟(2)中，依次用水、80%/V乙醇、95%V/V乙醇洗脫，收集95%v/v乙醇部位；所述大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
4 根據權利要求I所述的分離純化方法，其特徵在於步驟(2)中，上柱液濃度以生藥計為O. 02-0. 2g/ml,比上柱量小於2. 8g藥材/g幹樹脂。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)中，上柱液濃度以生藥計為O.10g/ml,比上柱量2. 74g藥材/g幹樹脂。
6.根據權利要求I所述的分離純化方法，其特徵在於步驟(3)中，梯度洗脫條件如下環己烷-乙酸乙酯=20 1，I. 07倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=10 11. 07倍柱體積，環己烷-乙酸乙酯=8 1，3. 3倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=6 I ;1. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=5 1，2. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=4:1，2. O倍柱體積。
7.根據權利要求I所述的分離純化方法，其特徵在於步驟(3)中，所述凝膠柱為SephadexLH-20型凝膠柱；重結晶溶劑為甲醇。
8.β_谷留醇的分離純化方法，其特徵在於它包括如下步驟(1)取細租毛忍冬Lonicerasimiles Hemsl的乾燥花蕾,加入70_90%V/V乙醇提取,合併提取液，回收溶劑，即得細氈毛忍冬總提取物浸膏；(2)取細氈毛忍冬總提取物浸膏，加水配製上柱液，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、80%/V乙醇、90-95%V/V乙醇洗脫，收集90-95%乙醇部位；(3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析，用環己烷-乙酸乙酯=20 Γ0 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γ0 I系統進行梯度洗脫，每O. 16個柱體積的洗脫液為I流份，收集洗脫液，薄層監測，取17 22份，回收溶劑後，重結晶，即得β -谷甾醇；步驟(3)中，梯度洗脫條件如下環己烷-乙酸乙酯=20 1，I. 07倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=10 I I. 07倍柱體積，環己烷-乙酸乙酯=8 1，3.3倍柱體積。
9.β -胡蘿蔔苷的分離純化方法，其特徵在於它包括如下步驟(1)取細租毛忍冬Lonicerasimiles Hemsl的乾燥花蕾,加入70_90%V/V乙醇提取,合併提取液，回收溶劑，即得細氈毛忍冬總提取物浸膏； (2)取細氈毛忍冬總提取物浸膏，加水配製上柱液，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、80%/V乙醇、90-95%V/V乙醇洗脫，收集90-95%乙醇部位； (3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析，用環己烷-乙酸乙酯=20 Γ0 1，乙酸乙酯-甲 醇=5 Γ0 I系統進行梯度洗脫，每O. 16個柱體積的洗脫液為I流份，收集洗脫液，薄層監測，取12CT124份，回收溶劑後，重結晶，即得β -胡蘿蔔苷； 步驟(3)中，梯度洗脫條件如下 環己烷-乙酸乙酯=20 1，I. 07倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=10 I I. 07倍柱體積，環己烷-乙酸乙酯=8 1，3. 3倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=6 I ;1. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=5 1，2.05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=4:1，2.0倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=3:1，4. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=2:1，I. 67倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=1:1，2. 12倍柱體積；乙酸乙酯I. 62倍柱體積。
10.從細氈毛忍冬中同時分離5-羥基_7，3'，4'-三甲氧基黃酮、β-谷甾醇和β-胡蘿蔔苷的方法，其特徵在於它包括如下步驟 (1)取細租毛忍冬Lonicerasimiles Hemsl的乾燥花蕾,加入70_90%V/V乙醇提取,合併提取液，回收溶劑，即得細氈毛忍冬總提取物浸膏； (2)取細氈毛忍冬總提取物浸膏，加水配製上柱液，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、80%/V乙醇、90-95%V/V乙醇洗脫，收集90-95%v/v乙醇部位； (3)取所得乙醇部位，回收溶劑後，上矽膠柱層析，用環己烷-乙酸乙酯=20 Γ0 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γ0 I系統進行梯度洗脫，每O. 16個柱體積的洗脫液為I流份，收集洗脫液，薄層監測，梯度洗脫條件如下環己烷-乙酸乙酯=20 1，I. 07倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=10 11. 07倍柱體積，環己烷-乙酸乙酯=8 1，3.3倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=6 I ;1. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=5 1，2. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=4:1，2. O倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=3:1，4. 05倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=2:1，I.67倍柱體積；環己烷-乙酸乙酯=1:1，2. 12倍柱體積；乙酸乙酯I. 62倍柱體積； (4)取17 22份流份，回收溶劑後，重結晶，即得β-谷甾醇； 取39 59份，回收溶劑後，用甲醇復溶，再上凝膠柱，用甲醇洗脫，收集洗脫液，回收溶齊U，重結晶，即得5-羥基_7，3'，4'-三甲氧基黃酮； 取12CT124份，回收溶劑後，重結晶，即得β -胡蘿蔔苷。
全文摘要
本發明公開了從細氈毛忍冬中分離純化5-羥基-7,3′,4′-三甲氧基黃酮、β-谷甾醇或/和β-胡蘿蔔苷的方法。本發明從細氈毛忍冬中分離純化5-羥基-7,3′,4′-三甲氧基黃酮、β-胡蘿蔔苷、β-谷甾醇的分離純化方法，得到的各化合物純度較高，為細氈毛忍冬尋找到了新的使用價值，同時也為明確細氈毛忍冬的藥效物質基礎提供了可能。
文檔編號C07J9/00GK102924418SQ20121041811
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月26日 優先權日2011年11月3日
發明者馬逾英, 鄭光雅, 盧曉琳, 穆向榮 申請人:成都中醫藥大學