細胞和組織的破碎的製作方法

2023-05-01 21:17:01 2

專利名稱：細胞和組織的破碎的製作方法
背景RNA表達可用作體外診斷測試的基礎，其在疾病的篩選、診斷、預後、治療監測和/或復發的隨訪中發揮作用。從細胞或組織提取完整的未降解的RNA對於RNA表達的有效檢測是很重要的。RNA表達在涉及大量基因的微陣列和PCR測試中尤為有用。
在大多數RNA提取法中，通過機械方式從細胞釋放RNA。這經常是在存在例如胍鹽的RNA穩定劑時進行的。這可在處理過程中使RNA受到的釋放自細胞或組織的RNA酶的降解作用最小化。用於機械破碎生物學樣品的裝置在下列例證性的美國專利中有公開Spelsberg的4,307,846；Rogalsy的5,197,483；Collis的5,840,878；DeStefano的5,829,696；Gautsch的6,235,501；以及Zoblinsky的5,567,050。在這種裝置中，使用元件進行碾磨、粉碎，或另外接觸含有待提取的細胞成份的樣品。在本說明書的全文中，該元件被稱為破碎元件。最通常地該裝置使用的元件是珠子或球，例如玻璃珠。
有持續的需要改進細胞和組織的破碎方法，以便使RNA提取變得更快速、更有效、更多產，以及服從於自動化操作。這在內部可操作測試的情況中尤其需要。
發明概述本發明是破碎細胞和組織的方法。優選地，該方法包括使用機械裝置並進行45秒或更短。
本發明的另一個方面是從細胞或組織樣品提取RNA的方法。優選地，該樣品是淋巴結組織。在該方法中，細胞和/或組織是機械破碎的，優選在45秒或更短時間內。然後從受到破碎的樣品除去細胞碎片和例如氣泡的其它非RNA的物質。再從樣品提取RNA。
在本發明的另一個方面，用於破碎細胞和組織的裝置包括其中可放置破碎元件的容器部分。破碎儀外部表面的空間(在珠子的情況中為圓周)剛好略小於容器部分的內部尺寸(在試管的情況中為直徑)。
發明詳述在本發明最優選的實施方案中，使用機械的細胞和組織破碎儀，例如購自Qbiogene，Inc.of Carlsbad，CA的「FASTPREP」設備。這種破碎儀在美國專利5,567,050中有描述，其在此引入作為參考。優選地，本發明的方法使用包含「O-環」的2.0ml有螺旋帽的冷凍小瓶試管或其等同物。將大約30mg-400mg的組織和破碎元件一起放置到試管中。最優選地，破碎元件是例如，可從Bartelesville，OK的BioSpec Products獲得的直徑為6.35mm的鋼珠。添加大約試管的一半或更多體積的勻漿緩衝液(例如，Qiagen公司的RLT緩衝液)到試管中。優選地，當使用2.0ml的試管時加入大約1ml的這種緩衝液。勻漿緩衝液含有RLT穩定劑，優選為胍鹽。然後破碎進行45秒或更短時間，離心樣品，優選是在微量離心機中，以從樣品除去細胞碎片和氣泡。然後丟棄上清液。優選地，將上清液轉移到旋轉柱中，並用不同的洗滌緩衝液處理柱子，以純化RNA。如果需要，也可使用基於溶劑的RNA純化法來替代旋轉柱。
本發明的裝置是如上所述的破碎儀，但是提供的破碎元件的尺寸和/或組成可快速而有效地破碎組織，這種方式在以前是不可能的。如上所述，破碎元件是與組織接觸的裝置的一部分。優選為珠子。本發明破碎元件的外部尺寸剛好略小於其中可處理樣品的容器的內部尺寸。在優選的實施方案中，容器是例如上述的試管，其內部直徑為8.28mm，而破碎元件是6.35mm的鋼珠。也可使用其它的容器和破碎元件，只要它們具有相似比例關係的內部和外部尺寸。珠子的密度也可促進改善發明裝置的性能。優選地，珠子是由密度為8.03g/cm3或以上的不鏽鋼製成的，而密度為7.0以上的珠子也是可以使用的。
實施例實施例1.不同珠子大小和組成的評估對於不同的珠子大小和材料評估其破碎冷凍的豬淋巴結組織的能力。使用具有8.28mm內部直徑的2ml螺旋帽試管(BioSpec Products，Bartlesville，OK)。每個試管用珠子填充至半滿，含有6.35mm(0.25英寸)不鏽鋼珠的試管除外，在此情況中每個試管加入單個的珠子。每個試管加入200-250mg的冷凍的、研磨成粉的豬淋巴結組織。用緩衝液RLT(Qiagen，Inc，Valencia CA)填滿試管，並且通過從BioSpect Products獲得的Mini-Bead Beater 8設備勻漿1、3或5分鐘。
從Biospec Products購買下列大小和組成的珠子0.1mm直徑的氧化鋯/氧化矽珠(cat 11107901z)、0.1mm直徑的玻璃珠(cat 11079101z)、0.5mm直徑的玻璃珠(cat 1107905)、0.5mm直徑的氧化鋯/氧化矽珠(cat 11079105z)、1.0mm直徑的玻璃珠(cat 11079110)、2.5mm直徑的氧化鋯/氧化矽珠(cat 11079125z)、6.35mm直徑的不鏽鋼珠(cat 11079635ss)和6.35mm直徑的玻璃珠(110796325)。
這些研究的結果顯示在下列的表1中，並且表明最佳的組織破碎是用多個6.35mm直徑的玻璃珠或單個6.35mm直徑的不鏽鋼珠，其用下列尺度目測確定(1)較差勻漿的組織，(2)部分勻漿的組織，以及(3)完全勻漿的組織。
表1.評估不同珠子大小和組成對淋巴結組織的勻漿作用*
*如上文所述目測確定組織破碎。
實施例2.珠子密度的影響實施例1說明利用直徑為6.35mm的破碎元件(珠子)可最佳實現完全的組織勻漿化作用。珠子的密度也影響勻漿作用的質量。
在具有相等直徑(6.35mm)但不同密度的珠子之間進行比較。在含有1ml基於胍鹽，加入一個6.35mm的陶瓷珠、玻璃珠或不鏽鋼珠的裂解緩衝液(Qiagen緩衝液RLT)的2ml螺旋帽小管中破碎大約225mg的豬淋巴結。在Biospec BeadBeater 8中處理包含珠子的組織樣品1分鐘、3分鐘和5分鐘。短暫離心樣品，並如實施例1中目測評估勻漿作用的質量。
表2.各種密度的6.35mm珠子對豬淋巴結勻漿作用的性能
表2總結了利用下列尺度目測評分的3組重複實驗的平均結果(1)較差勻漿的組織，(2)部分勻漿的組織，以及(3)完全勻漿的組織。該實驗表明當珠子材料的密度增加時，組織的破碎也提高，使用不鏽鋼珠可獲得最佳的性能。
實施例4.使用BeadBeater設備和玻璃珠或不鏽鋼珠的RNA產率和純度用6.35mm或更大的若干直徑的玻璃珠或不鏽鋼珠確定RNA產率和純度。使用高速的Mini-Bead Beater 8進行1分鐘。條件如同先前在實施例1中所描述的。從Biospec Products獲得6.35mm的不鏽鋼珠和玻璃珠。所有其它的珠子從Glen Mills Inc.Clifton，NJ購買。
組織破碎後，通過Eppendorf型號5415(Brinkman Instruments，Westbury NY)將所得到的勻漿物離心15秒，通過QIAGEN RNeasy Mini試劑盒(Qiagen Inc，Valencia CA)純化RNA。將一部分裂解物稀釋到濃度為30mg組織/ml的RLT緩衝液。將400微升的裂解物加入到含有400ul 70％乙醇的微量離心試管中，通過吹吸混合樣品。將樣品(700ul)施加到置於真空歧管中的RNeasy Mini柱上。施用真空並且在剩餘的過濾步驟期間保持真空。用700ul的RWI緩衝液，然後是700ul的RPE緩衝液洗滌柱子。然後將旋轉柱放置到1.5ml的收集試管中，並以14,000RPM離心30秒以乾燥柱子。將柱子轉移到新的1.5ml收集試管中。直接向膜上施加50微升無RNA酶的水，並將含有柱子的試管以14,000RPM離心30秒以洗脫RNA。將RNA樣品置於冰上，並在測試前於-80℃保存。
根據在Gene Spec III設備(MiraiBio，Alameda CA)上所確定的樣品的260/280nm分光光度比率來測量RNA的產率。Agilent 2100生物分析儀和AgilentRNA 6000 Nano Assay Regents和Supplies(Agilent Technologies，Foster City，CA)也用於確定RNA的產率和質量。
結果總結在表3中，並且證明直徑為6.35mm的不鏽鋼珠提供最高的RNA產率，並且如通過目測檢驗試管所確定的，其提供最佳的組織勻漿作用。此外，不鏽鋼珠與相同直徑的玻璃珠相比，顯示顯著提高了產率。Agilent生物分析儀電泳圖譜證實，用快速的勻漿方法可獲得高質量的RNA。在通過基於珠子的快速方法破碎的樣品中顯示出清楚界定的18s和28s核糖體峰，並且所有的樣品都具有大於1.5的18s與28s比率。
表3.使用不同大小和組成的RNA產率*
*根據下列尺度目測組織破碎1-沒有勻漿，2-較差勻漿，3-部分勻漿(幾乎沒有殘留組織碎片)，4-可觀察到細胞碎片，以及5-完全勻漿。
實施例3.在FastPrep設備中的組織破碎進行下列試驗以確定當在FastPrep勻漿儀(Qbiogene，Inc，Carlsbad CA)中破碎時，重量在50和500mg之間的豬淋巴結樣品的RNA產率的精確度。用包含單個的6.35mm不鏽鋼珠的2ml Sarstedt螺旋帽小管進行這些試驗。
在這些試驗中，將如表4中所示的不同重量的冷凍且研磨成粉的豬淋巴結組織加入每個試管包含一個6.35mm不鏽鋼珠的2ml Sarstedt螺旋帽小管中。加入1ml的RLT緩衝液到試管中，並在FastPrep設備中以6.5米/秒的速度處理試管45秒。(為了進行該實驗，通過從輻條板移出墊圈，以使得該較大的試管尺寸能夠被容納而改進了FastPrep設備)。破碎後，然後將試管在Eppendorf型號5415C(Brinkman Instruments，Westbury，NY)中以14,000xg離心15秒，以從樣品沉澱細胞碎片並除去氣泡。將每個裂解物的一部分稀釋到濃度為30mg的組織/ml的RLT緩衝液，並通過吹吸而充分混合。處理該組織以提取RNA，並在實施例3中定量RNA。
表4.淋巴結重量對RNA產率和精確度的影響
這些研究結果證明，在少於400mg組織的樣品中總RNA的回收超過20ug。在400-500mg的豬淋巴結樣品中觀察到回收的總RNA略少。表明在這些實驗條件下組織破碎效果略差。
含有較低重量組織樣品的試管具有最高的不精確性。然而，在後繼的實驗中，我們已經表明較低的淋巴結組織重量中的較高標準差可能是由於組織異質性和取樣，因為當將較大的組織研磨成粉，然後使用較小組織重量進行勻漿時，組織回收的精確度顯著提高。
實施例5.豬B-肌動蛋白基因表達的實時PCR檢測進行下列試驗來證明將在Fast Prep方法中快速勻漿後回收的RNA可在實時PCR測試中進行擴增。使用從實施例4純化的RNA。為了進行比較，引入對照，其中包括通過Omni組織勻漿器機械破碎的豬淋巴結組織和可任意處理的PCR探針(Omni International，Warrenton，VA)。Omni組織勻漿器不使用珠子來增強組織破碎。為了在Omni組織勻漿器中進行處理，將100-400mg的豬淋巴結組織與6ml的RLT緩衝液混合，並且用手動勻漿器(型號PCR258)勻漿1分鐘。將樣品與等體積的70％乙醇混合，取700ul施加於Qiagen旋轉柱，並且如實施例3中所描述的純化RNA。
如下轉錄RNA以製備cDNA拷貝將1μg的RNA加入主要混合物，該混合物是通過混合1.25μl的錨定Oligo dT23的75μM原液、0.31μl的10mM每種dNTP，和RNA酶處理的水(Sigma Chemical Co，St.Louis，Mo.)至體積為13μl而製備的，將溶液加熱到70℃ 5分鐘，然後置於冰上。再加入9.5μl的混合物，該混合物包括5μl的5×Superscript第一鏈緩衝液，2.5μl的0.1M二硫蘇糖醇，0.75μl的40U/μl Rnasin溶液(Promega Corp，Madison WI)，和1.25μl的200U/μlSuperscript II逆轉錄酶，將試管在42℃孵育50分鐘。加入5μl的5.0M NaOH到試管，試管在70℃孵育5分鐘，然後加入Tris-HCl緩衝液，(2.5μl，1M，pH7.0)，再加入67.4μl無RNA酶的水。假定RNA完全轉化為cDNA，並且轉化係數為1μg等於50,000個細胞等價物(CE)，對於所有隨後的實時PCR測試，使用濃度為在25mM Tris緩衝液中的500CE/μl。
由Invitrogen公司(Carlsbad，CA)合成豬B-肌動蛋白引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，而B-肌動蛋白Taqman探針(SEQ ID NO.3)來自SYNTHEGEN，LLC(Houston，TX)。對於所有的Taqman探針，使用羧基螢光素(FAM)和羧基四甲基羅丹明TAMRA)作為染料和淬滅劑對。
SEQ ID NO.1 CCACACGGTG CCCATCTACGSEQ ID NO.2 AGGATCTTCA TGAGGTAGTC GGTCAGSEQ ID NO.3 6-FAM-ACGCCCTGCC CCACGCCATC CTGCGTCTGG-TAMRA對於Taqman測試，通過加入25μl的2×Taqman Universial PCR混合物(Applied Biosystems，Inc)，1.25μl的10μM探針原液，和5μl的0.5μM每種引物的溶液來製備主要混合物。將cDNA(2μl)加入到每個光反應微滴定平板的孔中。用光學蓋子蓋上後，將平板在ABI Prism 7900 HT序列檢測系統(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)中處理。根據由製造商推薦的方案進行測試。通過Taqman測試的3個測定值的平均值如表5中所示。
這些結果總結在表5中，證明用本發明的方法可獲得與Omni勻漿器相當的RNA產率。本發明的方法在可同時處理多個樣品時是有利的。此外，由於使用密封的試管，可最小化樣品與樣品之間的汙染。
表5.經Omni勻漿器和Fast Prep設備勻漿的RNA的Taqman測試
序列表110Veridex，LLCVeridex，LLCBelly，RobertHays，Dustin120細胞和組織的破碎130VDX-5001 USNP1603170PatentIn version 3.1210121120212DNA213人工的220
223人工的序列是引物4001ccacacggtg cccatctacg 20210221126212DNA213人工的220
223人工的序列是引物4002aggatcttca tgaggtagtc ggtcag26210321130212DNA213人工的
220
223人工的序列是引物4003acgccctgcc ccacgccatc ctgcgtctgg30
權利要求
1.一種裝置，包括細胞或組織破碎儀，該破碎儀具有與樣品容器結合使用的破碎元件，其中所述破碎元件的外部尺寸略小於該容器的內部尺寸。
2.權利要求1的裝置，其中破碎元件的外部尺寸是所述容器內部尺寸的0.3倍以上。
3.權利要求1的裝置，其中破碎元件的外部尺寸是所述容器內部尺寸的0.75倍以上。
4.權利要求1的裝置，其中破碎元件包括密度超過7.0的緻密材料。
5.權利要求4的裝置，其中破碎元件包括鋼或密度等於或大於8.0的材料。
6.權利要求1的裝置，其中破碎元件是直徑為大約6mm的不鏽鋼球，而所述容器是內部直徑為大約8mm的試管。
7.用於破碎細胞或組織的方法，包括將含有細胞或組織的樣品放置到容器中，向所述容器加入核酸穩定溶液，將破碎元件放置到所述的容器中，以及使用破碎裝置45秒或更短。
8.權利要求7的方法，其中受到破碎裝置作用的樣品是淋巴結樣品，丟棄從其得到的上清液並從其提取出核酸。
9.從組織或細胞樣品提取核酸的方法，包括將含有細胞或組織的樣品放置到容器中，向所述容器加入核酸穩定溶液，將破碎元件放置到所述的容器中，使用破碎裝置45秒或更短，移出受到破碎裝置作用的樣品，以及從其提取出核酸。
10.權利要求9的方法，其中破碎元件的外部尺寸略小於容器的內部尺寸。
11.權利要求10的方法，其中破碎元件的外部尺寸是所述容器內部尺寸的0.3倍以上。
12.權利要求10的方法，其中破碎元件的外部尺寸是所述容器內部尺寸的0.75倍以上。
13.權利要求10的方法，其中破碎元件包括緻密材料。
14.權利要求10的方法，其中破碎元件包括鋼或密度等於或大於鋼密度的材料。
15.權利要求10的方法，其中破碎元件是直徑為大約6mm的不鏽鋼球，而所述容器是內部直徑為大約8mm的試管。
16.內部操作進行的權利要求10的方法。
17.權利要求16的方法，其中樣品是淋巴結組織。
全文摘要
用於破碎細胞和/或組織的方法，該方法使用帶有破碎元件的破碎儀，該破碎元件的外部尺寸略小於放置待破碎樣品的容器的內部尺寸。也提供用於破碎細胞和/或組織的裝置。可在例如核酸提取的過程中使用該裝置和方法。
文檔編號C12N15/00GK1673354SQ20051005421
公開日2005年9月28日 申請日期2005年2月18日 優先權日2004年2月18日
發明者R·貝利, D·海斯 申請人:維裡德克斯有限責任公司