一種應用於海參、蝦或鮑魚養殖的製劑的製作方法

2023-05-02 10:16:41

專利名稱：一種應用於海參、蝦或鮑魚養殖的製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種應用於海參、蝦或鮑魚養殖的製劑，具體是由酪酸梭菌製成的製劑在促進海參、蝦或鮑魚的生長，提高海參、蝦或鮑魚免疫力，防治海參、蝦或鮑魚疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質中的應用。
背景技術：
2006年底在全國爆發的大菱鮃藥殘事件給我們敲響了警鐘。歐盟已於2006年全面禁止抗菌藥作為飼料添加劑在養殖中的應用。為保證食品安全，美國等發達國家對肉類、 海產品等抗菌藥殘留進行檢測。隨著中國加入世貿組織，名優產品出口被普遍看好。但由於國內養殖不科學使用抗生素等有害藥物的現象嚴重，大大限制了產品的出口。開發抗菌藥替代產品應用於養殖業是目前市場所需要的。

發明內容
本發明的目的是提供一種促進海參、蝦或鮑魚的生長，提高海參、蝦或鮑魚免疫力，防治海參、蝦或鮑魚疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質的製劑，該製劑由酪酸梭菌製成。本發明的製劑的製備優選是通過下述步驟實施的，但不局限於此製備工藝，公知的能實現的製備工藝均可以採取含酪酸梭菌的樣本，然後將樣品置於滅菌厭氧瓶內，吹入氮氣同時充分混合，迅速從中取一定量樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮氣同時充分混勻，在無菌操作臺內，進行K^m4，ΙΟ"5, ΙΟ"6,10_7梯度稀釋，取ΙΟ"5, ΙΟ"6,10_7 三個稀釋梯度，分別塗布於酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養基上，置於厭氧罐內，厭氧 37°C下培養48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種於酪酸梭菌液體擴增培養基中，置於厭氧罐內，厭氧37°C下擴增培養48小時。將所得培養液離心(12000rpm)分離出菌體後，將菌體冷凍真空乾燥，調製出各菌種的乾燥菌粉，然後根據《伯傑細菌鑑定手冊》、相關細菌鑑定文獻或16S rRNA序列對比分析進行酪酸梭菌菌種鑑定和毒性試驗，將無毒性的酪酸梭菌乾燥菌粉按需要比例添加輔料製成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體製劑等各種劑型，或製成藥品、獸藥、飼料添加劑或水質淨化劑，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協同作用。酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養基優選但不局限於純化水1L，蛋白腖 40. 0g, Na2HPO4 5. 0g, K2HPO4 1. 0g, NaCl 2. 0g, MgSO4 0. Ig,葡萄糖 2. Og,瓊脂 25. Og,調 pH 7. 6，116°C滅菌20分鐘，待其冷至50°C左右，加入卵黃液50. Om L，加入終濃度為200 μ g/mL 的硫酸多粘菌素B，加入終濃度200g/mL的新黴素，充分混勻後，分注於平皿中。酪酸梭菌液體擴增培養基優選但不局限於純化水1L，胰蛋白腖10. 0g，牛肉浸膏 10. Og,酵母浸膏3. Og,葡萄糖5. 0g, NaC15. Og,可溶性澱粉1. Og,半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g，醋酸鈉 3. Og,瓊脂 0. 5g，調 pH 6. 6-7. 0，121°C，滅菌 15 分鐘。為進一步具體說明本發明，發明人利用上述方法通過酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養基分離鑑定出了無毒性的酪酸梭菌，本發明所述酪酸梭菌並不局限於為說明本發明所述的菌株，只要無毒性的酪酸梭菌均是本發明所述，均在本發明的保護範圍內。本發明所述酪酸梭菌優選但不限於丁酸梭菌DHlOl保藏編號CGMCC3764，丁酸梭菌DH102保藏編號CGMCC3762，丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303或酪酸梭菌DF96101保藏編號 CGMCC0313. 1。本發明實施說明中優選使用的酪酸梭菌的細菌學性質1、為說明本發明，本發明利用上述方法分離的酪酸梭菌分別為丁酸梭菌DHlOl 保藏編號CGMCC3764，丁酸梭菌DH102保藏編號CGMCC3762，丁酸梭菌QA-08保藏編號 CGMCC2303 或酪酸梭菌 DF96101 保藏編號 CGMCC0313. 1。2、菌落形態顯微鏡觀察長3. 0-6. 0微米，寬0. 6-1. 2微米，直杆或梭狀菌，革蘭氏染色陽性， 產芽孢，孢子次端生。平板形態菌落圓形，邊緣不整齊，稍凸，不透明，顏色淡黃，表面無光澤。3、生理生化鑑定硫化氫_ ；吲哚_ ；明膠液化_ ；氨_ ；硝酸鹽還原_ ；卵磷脂酶反應_ ；脲酶-；V-P試驗-；接觸酶-；是否需氧厭氧性。4、糖酵解實驗鑑定阿拉伯糖+ ；鼠李糖+ ；纖維二糖+ ；D-山梨醇_ ；D-果糖+ ；可溶性澱粉+ ； D-半乳糖+ ；蔗糖+ ；葡萄糖+ ；海藻糖+ ；菊糖+ ；木糖+ ；乳糖+ ；葡萄糖酸鹽(鈉) + ;D(+)甘露糖+;麥芽糖+ ；D-甘露醇+;甘油+ ；D⑴棉籽糖+;核糖+;松三糖+;
蜜二糖+。本發明所述的酪酸梭菌指活生物個體。本發明是以有效劑量的上述酪酸梭菌作為主要活性成份，按照一定的製劑工藝， 加入常規的賦形齊 、調味劑、崩解齊 、防腐劑、潤滑齊 、溼潤齊 、黏合齊 、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，製成任何一種適合於使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體製劑、粉劑等劑型。本發明所述以有效劑量的上述酪酸梭菌作為主要活性成份製成活菌製劑，也可以是上述酪酸梭菌與雙歧桿菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌等益生菌中的一種或幾種或其他活性成份組合製成活菌製劑，以起到協同作用，提高效果。本發明所指有效劑量是指以上述酪酸梭菌根據上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份製成的固體活菌製劑包含的總活菌數不能低於lX106CFU/g，一般在 1 X 109CFU/g 以上，最高可達至Ij 1 X 10"CFU/g 或 1 X 10"CFU/g 以上。本發明所指有效劑量是指以上述酪酸梭菌根據上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份製成的液體活菌製劑包含的總活菌數不能低於lX106CFU/mL，一般在 1 X 109CFU/mL 以上，最高可達到 1 X 10nCFU/mL 或 1 X 10nCFU/mL 以上。由於本發明首次公開了酪酸梭菌作為主要活性成份製成製劑在海參、蝦或鮑魚養殖中的應用，因此含上述酪酸梭菌的製劑在海參、蝦或鮑魚養殖中的應用均屬於本發明的保護範圍。本發明所述的酪酸梭菌在製成任何一種劑型時，均具有促進海參、蝦或鮑魚的生長，提高海參、蝦或鮑魚免疫力，防治海參、蝦或鮑魚疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質的作用。任何劑型，如果其組份中含有上述酪酸梭菌成份製備成製劑，在其包裝或說明書等標識上或者在其他任何宣傳品上只要註明或提示具有促進海參、蝦或鮑魚的生長，提高海參、蝦或鮑魚免疫力，防治海參、蝦或鮑魚疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質的作用，則落入本發明的保護範圍之內。本發明所述的酪酸梭菌可以製成獸藥、飼料添加劑或養殖水質淨化劑。將上述酪酸梭菌製成的獸藥、飼料添加劑或養殖水質淨化劑應用於促進海參、蝦或鮑魚的生長，提高海參、蝦或鮑魚免疫力，防治海參、蝦或鮑魚疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質等海參、 蝦或鮑魚養殖中，則落入本發明的保護範圍之內。
具體實施例方式製備例說明上述已經對酪酸梭菌製劑的製備進行說明，這裡通過丁酸梭菌 DHlOl保藏編號CGMCC3764、丁酸梭菌DH102保藏編號CGMCC3762、丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303或酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313. 1粉劑為例進行具體說明，其他酪酸梭菌菌種製劑的製備方法本領域技術人員通過本實施例很容易掌握，其他劑型的製備方法本領域技術人員通過本實施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。製備方法並不局限於本發明實施例所述，公知的能夠達到製備目的的方法均可以，實施例的製備說明只是對本發明的說明，並不是對本發明保護範圍的限制。製備實施例酪酸梭菌活菌粉的製備1菌粉的製備和菌種的鑑定採取含有酪酸梭菌的樣品(海參腸道內容物、土壤或嬰兒糞便)，然後將樣品置於滅菌厭氧瓶內，吹入氮氣同時充分混合，迅速從中取部分樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮氣同時充分混勻，在無菌操作臺內，進行IO-1UO-2UO-3UO-4, ο-5, ο-6, ο-7
稀釋，取10_5，ΙΟ"6, ΙΟ"7三個稀釋梯度，80°C水浴13分鐘，塗布於酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養基上，置於厭氧罐內，厭氧37°C下培養48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種到酪酸梭菌液體擴增培養基中，置於厭氧罐內，厭氧37°C下擴增培養48小時。將所得培養液離心(12000rpm)分離出菌體後，將菌體冷凍真空乾燥，調製出乾燥菌粉，活菌數均為lX109CFU/g以上，然後根據《伯傑細菌鑑定手冊》、相關細菌鑑定文獻和分離菌株進行16S rRNA基因測序後用BLAST與GenBank和RDP資料庫中的基因序列進行相似性分析，經鑑定為酪酸梭菌。分別為丁酸梭菌DHlOl保藏編號CGMCC3764，丁酸梭菌DH102保藏編號CGMCC3762，丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303或酪酸梭菌DF96101保藏編號 CGMCC0313. 1。2毒性試驗2. 1動物及分組取50隻SPF級別小鼠，6 8周齡，體重15 19g，隨機分入丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌DF96101組和未給藥組，每組10隻。2. 2製備菌液將上述不同的酪酸梭菌菌粉分別用純化水調製為含菌數均為 1 X 109CFU/mL 的菌液。2. 3方法各酪酸梭菌組和未給藥組均給予相同的基礎飼料，且飼養條件均一致，各酪酸梭菌組每天灌服酪酸梭菌菌液0. 5mL，未給藥組每天灌服純化水0. 5mL，飼餵6個月， 觀察體重及毒性反應。2. 4 結果各組小鼠均未出現異常情況，未發生振顫、痙攣、運動失調、姿態異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，且各酪酸梭菌組的體重增加顯著高於未給藥組 (P < 0. 05)，表明酪酸梭菌菌種有促進生長發育作用，說明效果良好，未見中毒反應。3製備成粉劑等劑型根據上述步驟和方法分離鑑定後，經實驗檢驗無毒性，就可將酪酸梭菌菌種製成菌粉，然後按照需要添加相關輔料製成各種劑型，優選據酪酸梭菌菌粉的活菌數，按比例添加澱粉製成粉劑，使活菌數不低於1 X 109CFU/g,然後裝袋。應用效果實施例說明本發明以丁酸梭菌DHlO 1保藏編號CGMCC3764、丁酸梭菌DH102保藏編號CGMCC3762、丁酸梭菌QA-08 保藏編號CGMCC2303或酪酸梭菌DF96101保藏編號CGMCC0313. 1為代表說明酪酸梭菌的應用效果。應用效果實施例1 酪酸梭菌在海參養殖中的應用1材料與方法1. 1 材料1.1.1試驗產品酪酸梭菌活菌粉劑，活菌數均為1 X 109CFU/g以上。1.1.2試驗海參將海參分為5組，每組50頭。1. 2 方法1. 2. 1試驗時間為30天。1. 2. 2該試驗採取海參常規飼料餵養，試驗組每噸飼料添加試驗產品1000克，對照組不加試驗產品。2試驗結果2. 1對消化酶的影響
2. 1.1對蛋白酶的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌DF96101組與對照組相比，分別將蛋白酶的活性提高41. 12 %,41. 32 %、41. 25 %或 41. 18%，差別具有統計學意義(P 0. 05)。2. 1. 2對澱粉酶的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌DF96101組與對照組相比，分別將澱粉酶的活性提高22. 42 %、22. 51 %、22. 46 %或 22. 57%，差別具有統計學意義(P 0. 05)。2. 2對增強免疫的影響2. 2. 1對超氧化物歧化酶的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將超氧化物歧化酶的活性提高10. 45% ,10. 61%、10. 58% 或10. 37%，差別具有統計學意義，但試驗組之間差異無統計學意義(P > 0. 05)。
2. 2. 2對溶菌酶的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將溶菌酶的活性提高8. 14%,8. 23%,8. 18%或8. 24%，差別具有統計學意義(P 0. 05)。2. 3對日增重的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將日增重提高41^^38^^39%或40%，差別具有統計學意義(P 0. 05)。2. 4死亡率結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組死亡率分別為2. 14%,2. 22%,2. 15%和2. 14%，低於對照組的10. 15% (P 0. 05)。2. 5對養殖水質的影響2. 5. 1 對 pH 的影響丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌DF96101組的pH值在6. 9 7. 6之間變化，對照組pH值在6. 1 7. 8之間變化，試驗組相比對照組變動幅度小，差異有統計學意義(P 0. 05)。2. 5. 2對亞硝酸鹽、氨態氮的影響各試驗組亞硝酸鹽、氨態氮低於對照組40% (P 0. 05)。3 結論酪酸梭菌能夠提高海參日增重、消化酶活性、超氧化物歧化酶活性、溶菌酶活性， 並降低死亡率和改善水質，且試驗組之間差異沒有統計學意義，說明酪酸梭菌具有促進海參的生長，提高海參免疫力，防治海參疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質的作用應用效果實施例2 酪酸梭菌在蝦養殖中的應用1材料與方法1. 1 材料1.1.1試驗產品酪酸梭菌活菌粉劑，活菌數均為1 X 109CFU/g以上。1.1.2 試驗蝦將蝦分為5組，每組90尾，每組設3個重複。1. 2 方法1. 2. 1試驗時間為30天。1. 2. 2該試驗採取蝦常規飼料餵養，試驗組每噸飼料添加試驗產品1000克，對照組不加試驗產品。2試驗結果2.1對促進生長的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將體重量提高20. 32%,20. 17%,20. 54%^ 20. 16%，差別具有統計學意義(P 0. 05)。2. 2對增強免疫的影響2. 2. 1對超氧化物歧化酶的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將超氧化物歧化酶的活性提高8. 51%,8. 72%,8. 47%或 8. 27%，差別具有統計學意義，但試驗組之間差異無統計學意義(P > 0. 05)。2. 2. 2對溶菌酶的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將溶菌酶的活性提高5. 13 %、5. 32 %、5. 27 %或5. 49 %，差別具有統計學意義(P 0. 05)。2. 3死亡率結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組死亡率分別為5. 25%、5. 31 %、5. 27%和5. ；34%，低於對照組的20. 17% (P 0. 05)。2. 4對料重比的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組料重比分別為1.61、1.61、1.62、1.62，低於對照組的1.97 (P 0. 05)。2. 5對養殖水質的影響2. 5. 1 對 pH 的影響試驗組的pH值在6. 5 7. 4之間變化，對照組pH值在6. 2 7. 9之間變化，試驗組相比對照組變動幅度小，差異有統計學意義(P 0. 05)。2. 5. 2對亞硝酸鹽、氨態氮的影響各試驗組亞硝酸鹽、氨態氮低於對照組35% (P 0. 05)。3 結論酪酸梭菌能夠提高蝦體重量、超氧化物歧化酶活性、溶菌酶活性，並降低死亡率、 料重比和改善水質，且試驗組之間差異沒有統計學意義，說明酪酸梭菌具有促進蝦的生長， 提高蝦免疫力，防治蝦疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質的作用。應用效果實施例3 酪酸梭菌在鮑魚養殖中的應用1材料與方法1.1 材料1.1.1試驗產品酪酸梭菌活菌粉劑，活菌數均為1 X 109CFU/g以上。1.1. 2試驗鮑魚將鮑魚分為5組，每組90頭，每組設3個重複。1.2 方法1. 2. 1試驗時間為30天。
8
1. 2. 2該試驗採取鮑魚常規飼料餵養，試驗組每噸飼料添加試驗產品1000克，對照組不加試驗產品。2試驗結果2. 1對促進生長的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將體重量提高15. 21%、15. 31%、15. 27%或15. 26%，差別具有統計學意義(P 0. 05)。2. 2對增強免疫的影響2. 2. 1對超氧化物歧化酶的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將超氧化物歧化酶的活性提高6. 14%,6. 22%,6. 27%或 6. 25%，差別具有統計學意義，但試驗組之間差異無統計學意義(P > 0. 05)。2. 2. 2對溶菌酶的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組與對照組相比，分別將溶菌酶的活性提高8. 47%,8. 68%,8. 37%或8. 39%，差別具有統計學意義(P 0. 05)。2. 3死亡率結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組死亡率分別為3. 18%,3. 21 %,3. 25 %和3. M%，低於對照組的10. 24% (P 0. 05)。2. 4對飼料與體重比的影響結果表明丁酸梭菌DHlOl組、丁酸梭菌DH102組、丁酸梭菌QA-08組、酪酸梭菌 DF96101組料重比分別為1. 54、1. 53、1. 52、1. 53，低於對照組的1. 78 (P 0. 05)。2. 5對養殖水質的影響2. 5.1 對 pH 的影響試驗組的pH值在6. 2 7. 1之間變化，對照組pH值在6. 0 7. 8之間變化，試驗組相比對照組變動幅度小，差異有統計學意義(P 0. 05)。2. 5. 2對亞硝酸鹽、氨態氮的影響各試驗組亞硝酸鹽、氨態氮低於對照組30% (P 0. 05)。3 結論酪酸梭菌能夠提高鮑魚體重量、超氧化物歧化酶活性、溶菌酶活性，並降低死亡率、料重比和改善水質，且試驗組之間差異沒有統計學意義，說明酪酸梭菌具有促進鮑魚的生長，提高鮑魚免疫力，防治鮑魚疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質的作用。本發明在實施過程中所使用的微生物菌種已分別於1997年7月觀日、2007年12 月沈日和2010年04年23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所郵編100101)保藏，共4個下述微生物菌種，但本發明所述的酪酸梭菌並不局限於這4微生物菌種。(1)分類命名酪酸梭菌 Clostridium butyricum，保存編號 0313. 1。(2)分類命名丁酸梭菌 Clostridium butyricum，保存編號 2303。(3)分類命名丁酸梭菌 Clostridium butyricum，保存編號 3764。(4)分類命名丁酸梭菌 Clostridium butyricum，保存編號 3762。上述4個微生物菌種經該微生物中心檢測，檢測結果均為存活。
權利要求
1.一種應用於海參、蝦或鮑魚養殖的製劑，其特徵在於該製劑由酪酸梭菌製成。
2.按權利要求1所述應用，其特徵在於促進海參、蝦或鮑魚的生長，提高海參、蝦或鮑魚免疫力，防治海參、蝦或鮑魚疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質。
3.按權利要求1所述製劑，其特徵在於包括獸藥、飼料添加劑或水質淨化劑。
4.按權利要求1所述酪酸梭菌，其特徵在於酪酸梭菌指活的生物個體。
5.按權利要求1所述酪酸梭菌，其特徵在於包括丁酸梭菌DHlOl保藏編號CGMCC3764。
6.按權利要求1所述酪酸梭菌，其特徵在於包括丁酸梭菌DH102保藏編號CGMCC3762。
7.按權利要求1所述酪酸梭菌，其特徵在於包括丁酸梭菌QA-08保藏編號CGMCC2303。
8.按權利要求1所述酪酸梭菌，其特徵在於包括酪酸梭菌DF96101保藏編號 CGMCC0313. 1。
9.按權利要求1所述微生態製劑，其特徵在於固體製劑包含的總活菌數不低於 1 X 106CFU/g, 一般在 1 X 109CFU/g 以上，最高可達到 1 X 10nCFU/g 或 1 X 10nCFU/g 以上；或液體製劑包含的總活菌數不能低於lX106CFU/mL，一般在lX109CFU/mL以上，最高可達到 1 X IoiiCfuAiL 或 I Χ 10nCFU/mL 以上。
全文摘要
本發明涉及一種應用於海參、蝦或鮑魚養殖的製劑，具體是由酪酸梭菌製成的製劑在促進海參、蝦或鮑魚的生長，提高海參、蝦或鮑魚免疫力，防治海參、蝦或鮑魚疾病，提高飼料轉化率或淨化養殖水質中的應用。
文檔編號A23K1/18GK102240304SQ20101018314
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月12日 優先權日2010年5月12日
發明者孫立國, 崔雲龍, 李洪福 申請人:青島東海藥業有限公司