多基因共表達體系及含二硫鍵功能性蛋白的生產方法

2023-12-02 04:27:16

專利名稱：多基因共表達體系及含二硫鍵功能性蛋白的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因技術領域和生物化學領域，涉及使真核生物的二硫鍵蛋白在原核細菌內表達形成正確的二硫鍵、摺疊成正確構象、成為可溶性活性蛋白質。具體說，利用能促進二硫鍵正確形成的同源巰基氧化酶、二硫鍵異構酶、肽基-脯氨醯順反異構酶、伴侶蛋白等基因與二硫鍵蛋白基因在原核細胞內共同表達，或使這些相關酶蛋白和伴侶蛋白與二硫鍵蛋白在細胞外相互作用，從而產生可溶性活性二硫鍵蛋白的方法和相關物質。本發明還涉及包涵體蛋白質的復性技術領域。
背景技術：
用大腸桿菌(E. coli.)原核系統重組表達真核生物蛋白質的優點是成本低、產量 高，但是它的最大缺點之一是表達的真核生物蛋白很多都是包涵體形式，即無活性的沉澱蛋白形式。要使包涵體蛋白變成活性蛋白，首先需用高濃度鹽酸胍或尿素溶解包涵體蛋白，然後用各種方法，例如稀釋，使重組蛋白恢復活性(復性)[王穎等「蛋白質復性技術研究進展」生物工程進展，2002，22 (2) :61-64]。如該領域眾所周知，蛋白質復性耗時、成本高、復性率低。由於包涵體蛋白復性的機理尚不清楚，不同蛋白質的復性條件又有所不同，特別是含二硫鍵蛋白質的復性很困難，大規模生產問題很多。因此，如何提高大腸桿菌細胞表達可溶性異源蛋白一直是人們研究的課題[任增亮等「大腸桿菌高效表達重組蛋白策略」中國生物工程雜誌，2007，27(9) =103-109 ;盧晟曄等「大腸桿菌中外源蛋白高效表達的影響因素及策略研究的新進展」中國實驗診斷學，2006，10(9) :1100-1103]，其中如何形成正確的二硫鍵對表達可溶性異源蛋白最為關鍵。目前提出的解決原核系統表達可溶性蛋白的方法主要有以下幾種。①使目的蛋白與可溶性蛋白融合一起表達，例如，與硫氧還蛋白(Trx)(見Novagen公司的pET system manual)或二硫鍵異構酶(PDI) (US 2009/0305351A1)融合表達。此方法常可使目的蛋白可溶性分泌，但最大缺點是得到的分泌性融合蛋白需要去除其融合伴侶才能得到純化的目的蛋白。在大規模製備中，此步驟往往成本高，而且目的蛋白切下後常常有一部分多留有I至多個胺基酸，得到的是非均一性目的蛋白；②使目的蛋白與大腸桿菌外膜蛋白(OmpA)融合，表達的蛋白分泌到大腸桿菌的周質間隙中進而獲得可溶性蛋白[J. Manosroi等，ApplEnviron Microbiol, 2001,67 (6) :2657-2664]。但此法產量低，難以規模化工業生產；③使目的蛋白與參與蛋白質摺疊的伴侶蛋白在細菌細胞內共同表達，或加入小分子化合物，例如 L-精氨酸[J. Schaffner 等，Appl Environ Microb, 2001,67 (9) :3994-4000],包括加入大腸桿菌伴侶素60家族成員(GroEL)、熱激蛋白70 (Hsp70)或其它參與蛋白質摺疊的蛋白[P. Goloubinoff 等 Nature, 1989，337 (6202) :44-47]，但此法促進含二硫鍵蛋白可溶性表達的效果難以滿足實際生產需求。④與真核生物二硫鍵異構酶PDI蛋白共表達[Ostermeier，M 等 J Biol Chem，1996，271 (18) : 10616-10622]。PDI 具有一定的巰基氧化活性，同時又能通過異構作用促進蛋白質正確摺疊[G. Kozlov等，Febs Journal, 2010,277(19) :3924-3936],另外PDI還具有類似分子伴侶抑制蛋白質沉聚的功能[H.Cai，等，JBiol Chem, 1994, 269 (40) :24550-24552];⑤採用硫氧還蛋白還原酶(TrxB)和穀胱甘肽還原酶(gor)缺失 大腸桿菌突變株[PH. Bessette 等,Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96 (24)13703-13708]。含二硫鍵蛋白在原核細胞內容易形成包涵體的主要原因在於原核細胞的細胞質氧化還原勢較低，不能有效地促進二硫鍵形成，在TrxB和gor這兩種還原酶缺失的突變株細胞中，細胞質氧化還原勢中的氧化勢提高，而有利於氧化蛋白質半胱氨酸的巰基形成二硫鍵。⑥採用過量表達自身質膜半胱氨酸氧化還原酶(DsbA和DsbC)的大腸桿菌菌株[J. Qiu 等，Appl Environ Microbiol, 1998,64(12) :4891-4896 ；Y Geng 等，Appl EnvironMicrobiol, 2010, 76 (21) :7226-7230]。DsbA具有催化蛋白質巰基氧化的功能，DsbC具有二硫鍵異構酶活性，二者的過量表達在一定程度上可促進外源蛋白二硫鍵的形成。綜合分析，使目的蛋白與可溶性蛋白融合一起表達能夠較為有效地促進大多數目的蛋白(包括含二硫鍵蛋白)可溶性表達，但製備成均一性純化目的蛋白困難；而⑤-⑥方法生產成本較高，據報導④-⑤-⑥三種方法只能使二硫鍵蛋白一定程度上可溶性表達。細胞外蛋白質復性除了常規方法外，目前較多地利用能輔助蛋白質摺疊的蛋白，例如分子伴侶[王穎、董曉燕、孫彥:生物工程進展，2002，22 (2) :61-64]，PDI [J. Yang等，Hum Antibodies Hybridomas, 1995,6 (4) :129-136]來促進蛋白質重摺疊復性。但單用分子伴侶往往不能實現輔助含二硫鍵較多蛋白的正確重摺疊復性。以下4種蛋白是代表性的含多個二硫鍵的目的蛋白人組織纖溶酶原激活蛋白(tpa)是一條含527個胺基酸的多肽，共含有17對二硫鍵[D. Pennica等，Nature, 1983, 301 (5897) :214-221]。重組人組織纖溶酶原激活蛋白(rpa,又稱瑞替普酶)是tpa的非糖基化變體，含有tpa 527個胺基酸中的355個(胺基酸1-3和176-527)，共有9對二硫鍵，包含第二鉸鏈區(Kringle2)及tpa的酶結合位點[U. Kohnert 等，Protein Eng, 1992, 5 (I) :93-100]。採用原核系統表達的 tpa 和 rpa 都是包涵體蛋白形式。過去二十年中，研究如何實現原核系統可溶性表達tpa和rpa —直是研究熱點，但進展緩慢，目前醫用rpa仍需通過復性方法得到。Gaussia突光素酶(Gluc)是分離自夏威夷水域海洋燒腳類動物(Gaussiaprinceps)的一種新型突光素酶,它能催化底物腔腸動物突光素(coelenterazine)氧化脫羧而產生突光發射光。GLuc含185個胺基酸,其中有10個半胱氨酸[M. Verhaegent和 Christopoulos TK. Anal Chem，2002，74 (17) :4378-4385]。原核系統表達的 GLuc 都是包涵體蛋白或是可溶性但構象不正確的蛋白，目前都採用哺乳動物細胞表達GLuc [M.Verhaegent 和 ChristopoulosTK. Anal Chem,2002,74(17) :4378-4385]。骨形態發生蛋白2(BMP2)是轉化生長因子蛋白(TGF-P)超家族成員之一，它的C端序列含有一個保守的半胱氨酸節摺疊基序(cystine-knot folding motif),這段含114個胺基酸的基序包括7個半胱氨酸，成熟的BMP2共有3對二硫鍵，剩餘的一個半胱胺基酸與另外一個BMP2分子的一個半胱氨酸形成分子間二硫鍵[C. Scheufler等，J Mol Biol,1999,287(1) :103-115]，這段基序在原核系統中表達為包涵體形式。血管內皮生長因子(VEGF)家族共有六個成員，具有其全部生物活性的最短形式的VEGF121為121個胺基酸的多肽，包含8個半胱氨酸。目前主要是採用添加融合標籤，例如添加硫氧還蛋白融合標籤，使VEGF121在大腸桿菌中可溶性表達[Backer MV和BackerJM, Protein Expr Purif，2001，23 (I) :1_7]。VEGF121在原核系統中的表達強烈受到胞內氧化還原勢的影響，目前表達的VEGF121仍為包涵體,需要復性[SA. Pizarro等，ProteinExpr Purif, 2010, 72 (2) :184-193]。但我們實驗室的結果證明，如果提高胞內氧化還原勢可明顯促進VEGF121的可溶性表達。二硫鍵形成是蛋白質翻譯後的一種重要修飾，對蛋白質正確摺疊最終形成活性空間構象有決定作用。隨著研究的深入對參與目的蛋白二硫鍵正確形成的各種酶有了新的認識，其中主要是巰基氧化酶家族，包括=Quiescin巰基氧化酶(QSOX)家族[EJ. Heckler等，Biochim Biophys Acta, 2008,1783 (4) :567-577]、內質網氧化還原蛋白(Erol)家族[Wang，L 等，J Biol Chem, 2009, 284 (I) =199-206]及呼吸和生長必需蛋白(ERV/ALR)家族[D. Fass, Biochim Biophys Acta, 2008,1783(4) :557-566. ]。二硫鍵異構酶(PDI)等也與_■硫鍵蛋白質正確折置有關。目如的研究表明，在真核細胞內，疏基氧化酶[KL. Hoober等，J Biol Chem,1999,274(32) :22147-22150]和 PDI[DP. Humphreys 等，J Biol Chem,1995 ,270(47) =28210-28215]能促進二硫鍵的正確形成、蛋白質的正確摺疊和分泌。體外研究也表明，巰基氧化酶和PDI分別能促進巰基氧化、蛋白質形成正確的二硫鍵和形成正確的空間構象[PC. Rancy 和 Thorpe C，Biochemistry, 2008,47 (46) :12047-12056]，巰基氧化酶還與PDI直接相互作用共同促進二硫鍵形成[Wang，L等，J Biol Chem, 2009, 284 (I)199-206 ;Tu. BP 和 Weissman，J Cell Biol,2004,164(3) :341-346 ;PC Rancy 和 Thorpe,Biochemistry, 2008,47 (46) :12047-12056]。因此，可利用它們來調控蛋白質二硫鍵的形成與還原，改變蛋白質和酶的生物活性。目前，雖已有報導採用目的蛋白與二硫鍵異構酶roi共同表達或融合表達產生了可溶性功能目的蛋白[M. Ostermeier等，J Biol Chem, 1996,271(18) :10616-10622]，但產量不大高。而採用巰基氧化酶在宿主細胞中共同表達促進原核系統中蛋白質~■硫鍵的正確形成、誘導蛋白質折置成為正確空間構象尚未見報導。目前的研究還證明，在細胞外聯合巰基氧化酶與PDI的共同作用可促進還原型蛋白氧化形成活性構象蛋白質[Wang, L 等，JBiol Chem, 2009, 284 (I) :199-206 ；PC Rancy 和 Thorpe，Biochemistry,2008,47(46) :12047-12056]。本發明者首先採用巰基氧化酶與目的蛋白基因共表達取得了良好結果，進而通過預試驗選擇，優選聯合巰基氧化酶和二硫鍵異構酶與目的蛋白在細胞內共同表達相互作用，或在細胞外相互作用。本發明更優選聯合巰基氧化酶和/或二硫鍵異構酶和/或伴侶蛋白多個基因與目的蛋白基因細胞內共表達。將這種方法用於細胞內二硫鍵包涵體蛋白取得成功，有效產生了二硫鍵正確和摺疊正確、空間構象正確的可溶性功能目的蛋白，從而完成了本發明。發明概述本發明的目的在於提供一種多基因共表達體系，用該共表達體系在宿主細胞中共同表達目的蛋白和一個或多個相關酶和/或伴侶蛋白，它們在細胞微環境中相互作用產生可溶性功能目的蛋白；或分別表達目的蛋白與多個相關酶和/或伴侶蛋白，它們在細胞外相互作用，產生可溶性功能目的蛋白。本發明的目的還在於提供多基因共表達系統的製備方法。本發明的進一步目的是提供用本發明的多基因共表達體系製備可溶性功能性目的蛋白的方法。本發明提供的多基因共表達體系，包括含二硫鍵目的蛋白的編碼基因和一種或幾種具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因，所述酶或伴侶蛋白的編碼基因以融合基因形式構建在表達載體的一個閱讀框中或兩個或兩個以上所述酶或伴侶蛋白的編碼基因分別構建在所述表達載體的不同閱讀框中，所述目的蛋白的編碼基因構建在與所述酶或伴侶蛋白的所述表達載體含有不同抗性基因的表達載體中。
所述目的蛋白是其表達後摺疊形成的構象正確與否決定其有無生物學功能的蛋白，該目的蛋白含有一個或一個以上分子內和分子間二硫鍵。所述具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白是參與或輔助該目的蛋白正確摺疊形成正確構象的酶和/或伴侶分子，包括參與二硫鍵蛋白表達後分子內半胱氨酸正確配對形成正確二硫鍵、摺疊成正確活性構象的各種酶和伴侶蛋白。本發明提供的多基因共表達系統的製備方法包括以下步驟(I)構建具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因的融合基因並將所述融合基因構建在表達載體的一個閱讀框中，或構建兩個或兩個以上所述酶或伴侶蛋白的編碼基因並將它們分別構建在表達載體的不同閱讀框中；和(2)構建與所述酶或伴侶蛋白的所述表達載體含有不同抗性基因的目的蛋白編碼基因的表達載體。本發明還提供用多基因共表達系統製備可溶性功能性目的蛋白的方法，包括以下步驟(I)將所述多基因共表達系統中的所述含二硫鍵目的蛋白編碼基因的表達載體和所述具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因的表達載體同時轉化宿主細胞，依據這兩種載體抗性的不同，採用二種或三種抗菌素培養基，選出同時轉化入這兩種載體的陽性克隆菌落；(2)培養選出的陽性克隆菌落，誘導共表達目的蛋白與相關酶和/或伴侶蛋白，通過它們在細胞內的相互作用產生可溶性功能目的蛋白。本發明還提供用多基因共表達系統在體外製備可溶性功能性目的蛋白的方法，包括以下步驟(I)將所述多基因共表達系統中的所述含二硫鍵目的蛋白編碼基因的表達載體和所述具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因的表達載體分別轉化宿主細胞，選出分別表達它們的陽性克隆菌落；(2)分別培養選出的陽性克隆菌落，分別誘導表達目的蛋白與相關酶和/或伴侶蛋白，通過它們在細胞外的相互作用產生可溶性功能目的蛋白。本發明提供的多基因共表達系統中，可採用以下優選的具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的相關酶和/或伴侶蛋白的組合I.巰基氧化酶和人二硫鍵異構酶roi的融合蛋白，如人巰基氧化酶Q6與PDI的融合蛋白Q6TOI、PDIQ6 ;含ERV結構域活性片段的截短的Q6 (295-540)與TOI的融合蛋白Q6 (295-540)PDI ；2.巰基氧化酶人內質網氧化還原蛋白Erol家族(與釀酒酵母Erol家族蛋白同源)蛋白Erol-La和HH的融合蛋白Erol-L a TOI ;3.釀酒酵母巰基氧化酶Erv2的巰基氧化活性結構域Erv2_c和HH的融合蛋白Erv2-cPDI ；
4.分別構建在表達載體二個閱讀框中的Q6PDI融合蛋白與肽基-脯氨醯順反異構酶 PPI 的組合 Q6PDI-PPI ；5.以及已發現的相關酶和/或伴侶蛋白的其它優選組合。本發明還提供含有上述優選組合的相關酶和/或伴侶蛋白基因的表達載體(質粒)，具體包括含Q6基因的p⑶FDuet-l-sumoQ6表達質粒、含Q6TOI融合基因的 pCDFDuet-l-sumoQ6PDI 表達質粒、含 PDIQ6 融合基因的 pCDFDuet-l_sumoPDIQ6表達質粒、含 PDIQ6 (295-540)融合基因的 pCDFDuet-l_sumoPDIQ6 (295-540)表達質粒、含 Q6 (295-540) PDI 融合基因的 pCDFDuet-1-sumo Q6 (295-540) PDI 表達質粒、含Erol-L a PDI 融合基因的 pCDFDuet-l-sumoErol-L a PDI 表達質粒、含 Erv2_cPDI 融合基因的pCDFDuet-l-Erv2-cPDI表達質粒、在二個閱讀框中分別含Q6基因和PDI基因的p⑶FDuet-l-sumo Q6-PDI表達質粒、在二個閱讀框中分別含Q6PDI融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因p⑶FDuet-l-sumoQ6PDI-PPI表達質粒、在二個閱讀框中分別含TOIQ6融合 蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因p⑶FDuet-l-sumoQ6PDI-PPI表達質粒等等。也可將上述優選組合的相關酶和/或伴侶蛋白基因構建在其它表達載體，如pET28a或pET22b質粒中，用這種表達載體與含目的蛋白基因的載體在宿主細胞內共表達可獲得同樣效果。本發明的這種三基因、四基因或更多基因在宿主細胞中的共同表達方法，可有效地產生可溶性功能目的蛋白，包括可溶性功能性。本發明也提供用含二硫鍵蛋白基因和含上述相關酶和/或伴侶蛋白基因質粒共同轉化得到的陽性共表達克隆菌株。本發明還提供用上述共表達質粒轉化宿主菌表達得到的經過純化的優選相關酶和/或伴侶蛋白及其融合蛋白。可用它們在細胞外與另外表達的目的蛋白混合反應產生可溶性功能目的蛋白。本發明包括相關酶和/或伴侶蛋白目前已知和將來發現的、保留了其活性的的保守性變體多肽、或活性片段。發明詳述本發明第一方面內容，是提供與目的蛋白基因在原核細胞系統中共同轉錄、翻譯表達，促進目的蛋白正確摺疊形成可溶性功能蛋白質的相關酶或伴侶蛋白的基因，或和二種或和三種這些相關酶或伴侶蛋白組成的融合蛋白的基因核苷酸序列。由於編碼蛋白質的基因核苷酸序列密碼子的簡併性(即某些胺基酸可有二個、或三個、或四個密碼子，它們稱為該胺基酸的簡併密碼子)，本發明包括基因中包含有這種簡併密碼子的編碼所述相關酶或伴侶蛋白的所有簡併核苷酸序列，它們經轉錄和翻譯後可產生具有相同胺基酸序列的蛋白質。本文所用術語「目的蛋白」指含有二硫鍵，尤其是含有多個二硫鍵的蛋白質，簡稱為「二硫鍵蛋白」，這類蛋白含有多個半胱氨酸，表達後只有這些半胱氨酸相互正確配對形成正確的二硫鍵和摺疊成正確構象才能產生功能活性蛋白。例如人組織纖溶酶原激活蛋白、Gaussia螢光素酶Gluc蛋白、人骨形態發生蛋白2-BMP2、人血管內皮生長因子VEGF121蛋白等等，就是典型的含多個二硫鍵的真核生物蛋白質。採用常規基因工程技術將這類真核蛋白基因在原核細菌或真生物細胞內單獨表達時，表達的這類蛋白由於無相關酶或伴侶蛋白的幫助不能迅速形成正確的二硫鍵而摺疊成正確構象，主要產生的是不溶性沉澱的無生物學活性的包涵體蛋白，或是雖然可溶但摺疊不正確而無活性的蛋白。本文所用術語「相關酶」和「伴侶蛋白」指能促進或輔助表達的二硫鍵蛋白形成正確的二硫鍵、摺疊成正確構象、產生可溶性活性二硫鍵蛋白的酶或起輔助功能的伴侶蛋白。例如巰基氧化酶中的QSOX(如Q6)、內質網氧化還原蛋白(EroUn Erol-L a )、呼吸和生長必需蛋白(Erv,如釀酒酵母Erv2蛋白ScErv2)三個家族；二硫鍵異構酶(F1DI)等，以及其它已發現的相關酶和伴侶分子。本發明包括目前已知的這類相關酶或伴侶蛋白，及它們的保留了所述酶活性或伴侶活性的突變體和活性片段，例如這類相關酶或伴侶蛋白胺基酸序列的保守性突變體，包括其胺基酸序列中含保守性缺失、添加、置換、截短所產生的仍保留了所述酶活性或伴侶活性的突變體和活性片段，如本發明的Q6酶蛋白的295-540區段截短體、呼吸和生長必需蛋白釀酒酵母Erv2的活性結構域片段(Erv2-c)等。本發明第二方面內容，是提供含有所述「相關酶」和「伴侶蛋白」編碼基因的表達
本文所用的術語「表達載體」，「質粒」和「表達質粒」可互換使用，指通常攜帶有基因的染色體外元件，它不是細胞中心代謝的一部分，通常是環狀雙鏈DNA分子形式。這種元件可以是衍生自任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA，線形、環狀或超螺旋形的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核苷酸序列連接或重組入獨特構建物中，這種構建物能將所選基因產物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3』非翻譯序列一起引入細胞。本發明中的表達載體主要是pET系列質粒和p⑶Fduet-I系列質粒,也可以是其它系列質粒例如pBADhisA、pRsetB系列質粒。主要是原核表達質粒，也可以是真核表達質粒，如PVAX-I系列質粒等。pET系列質粒含有一個閱讀框，pCDFDuet-1系列質粒含有二個閱讀框，可以在兩個閱讀框內分別插入二個異源蛋白基因。本發明將目的蛋白的編碼基因構建在pET28a或pET22b表達質粒中，而將相關酶蛋白或伴侶蛋白的編碼基因構建在PCDFDuet-I表達質粒中。在一個實施方式中，p⑶FDuet-I的一個閱讀框中含Q6蛋白基因。在一優選實施方式中，p⑶FDuet-I的一個閱讀框中含Q6PDI融合蛋白基因。在另一個實施方式中，pCDFDuet-1的一個閱讀框中含Q6 (295-540)截短蛋白基因。在另一優選實施方式中，pCDFDuet-1的一個閱讀框中含TOIQ6融合蛋白基因。在另一優選實施方式中，pCDFDuet-1的一個閱讀框中含H)IQ6 (295-540)融合蛋白基因。在另一優選實施方式中，p⑶FDuet-I的一個閱讀框中含Q6 (295-540)PDI融合蛋白基因。在另一優選實施方式中，P⑶FDuet-I的一個閱讀框中含Erol-L a PDI融合蛋白基因。在另一優選實施方式中，p⑶FDuet-I的一個閱讀框中含Erv2-croi (巰基氧化活性結構域Erv2-c和roi)融合蛋白基因。在另一個實施方式中，p⑶FDuet-I的二個閱讀框中分別含Q6基因和PDI基因。在還要優選的一個實施方式中，p⑶FDuet-I的二個閱讀框中分別含Q6PDI融合蛋白基因和肽基-脯氨醯順反異構酶PPI蛋白基因。也可相反，將目的蛋白的編碼基因構建在pCDFDuet-1表達質粒中，而將相關酶蛋白或伴侶蛋白的編碼基因構建在pET28a或pET22b表達質粒中，這種互換並不影響共表達的效果。表達載體的選擇主要視其抗性標記(抗性基因)、複製起始位點(保證穩定共存)、可容納外源基因閱讀框的大小和表達能力，不必由目的蛋白基因或相關酶或伴侶蛋白基因所特定。利用這二種質粒抗性標記和複製起點的不同，可採用含相應的二種或多種抗菌素的LB平板篩選同時轉化入這兩種質粒的克隆菌落，而這兩種質粒彼此能穩定共存於同一細菌細胞內而共同表達。本發明第三方面內容，是提供用所構建的含有所述「相關酶」或「伴侶蛋白」的融合蛋白編碼基因的質粒轉化原核細菌細胞表達所產生的純化的融合蛋白，和提供製備這類融合蛋白的方法。本發明第四方面內容，是利用上述第三方面得到的相關酶或伴侶蛋白或其融合蛋白，使其在細胞外與另外表達的目的蛋白相互作用，產生含正確二硫鍵的正確摺疊的可溶性功能二硫鍵蛋白質的方法。本發明第五方面內容，是提供所構建的含有所述「相關酶」或「伴侶蛋白」和/或其融合蛋白編碼基因的表達質粒，用它們與構建的含目的蛋白基因的質粒共同轉化原核細 菌或真核生物細胞，通過轉錄、翻譯共表達，在細胞內產生含正確二硫鍵的正確摺疊的可溶性功能二硫鍵蛋白質的方法。本文所用術語「共表達」或「共同表達」指目的蛋白質基因與相關酶或伴侶蛋白或其融合蛋白基因在宿主菌細胞中同時轉錄、翻譯表達成相應的蛋白質。在細胞內，表達的相關酶或伴侶蛋白或其融合蛋白可使同時表達的目的蛋白形成正確的二硫鍵、摺疊成正確構象而成為可溶性功能性二硫鍵蛋白質。本發明所使用的術語「融合表達」，指經基因工程技術改造將二個或三個相關酶或伴侶蛋白的基因直接串聯融合或通過一短肽接頭編碼序列串聯融合形成融合蛋白基因，經轉錄、翻譯表達而產生融合蛋白，該融合蛋白具有這二個或三個相關酶或伴侶蛋白的活性。串聯的順序可顛倒，只要表達的融合蛋白仍具有相關酶或伴侶蛋白的活性，如這種融合蛋白中巰基氧化酶在N端、PDI在C端(Q6TOI)，或PDI在N端、巰基氧化酶在C端(TOIQ6)，或含其它融合標籤，例如sumo標籤的sumoPDIQ6融合蛋白。本文所用術語「可溶性蛋白」，指存在於宿主細胞周質間隙內或細菌裂解上清液中的蛋白組分。所述裂解上清液是細菌經超聲波粉碎裂解，再經13000rpm，4°C離心去除沉澱後得到的上層清澈液體。與之相反，用常規基因工程技術在原核細菌細胞內表達的真核二硫鍵蛋白主要是沉澱的無生物學活性的包涵體蛋白，必須經復性才能具有生物學活性，但復性常困難，復性比率低。本文所用術語「功能性蛋白」或「活性蛋白」含義相同，可互換使用，指具有相應生物學功能的蛋白組分。本文所用術語「含正確二硫鍵摺疊成正確空間構象」指具有相應生物學功能或活性的可溶性二硫鍵蛋白。本發明中，將這種二硫鍵蛋白與巰基氧化酶和/或PDI在細胞內共表達，使其能形成正確的二硫鍵、摺疊成正確空間構象而溶於裂解上清液中，同時保存了其相應生物學功能或活性。在本發明的一些實施方式中，提供巰基氧化酶與二硫鍵異構酶的融合基因。例如，在一具體實施方式
中，提供Q6PDI融合基因。在另一具體實施方式
中，提供PDIQ6融合基因。在另一具體實施方式
中，提供TOIQ6 (295-540)融合基因。在另一具體實施方式
中，提供Q6 (295-540) PDI融合基因。在另一具體實施方式
中，提供Erol-L a PDI融合基因。在另一具體實施方式
中，提供Erv2-cPDI融合基因。在本發明的另一些實施方式中，提供含有巰基氧化酶與二硫鍵異構酶融合基因的表達質粒。例如，在一具體實施方式
中，提供含Q6PDI融合基因的p⑶FDuet-l-sumoQ6roi表達質粒。在另一具體實施方式
中，提供含TOIQ6融合基因的p⑶FDuet-l-SumoroiQ6表達質粒。在另一具體實施方式
中，提供含TOIQ6融合基因的p⑶FDuet-l-SumoroiQ6表達質粒。在另一具體實施方式
中，提供含TOIQ6 (295-540)融合基因的pCDFDuet-l-sumoroiQ6 (295-540)表達質粒。在另一具體實施方式
中，提供含Q6 (295-540)PDI融合基因的pCDFDuet-l-sumo Q6 (295-540)PDI表達質粒。在另一具體實施方式
中，提供含Erol-L a PDI融合基因的pOFDuet-l-sumoErol-L a PDI表達質粒。在另一具體實施方式
中，提供含Erv2-cPDI融合基因的pCDFDuet-l-ErV2-cPDI表達質粒。在另一具體實施方式
中，提供在二個閱讀框中分別含Q6基因和PDI基因的p⑶FDuet-l-sumo Q6-PDI表達質粒。在另一具體實施方式
中，提供在二個閱讀框中分別含Q6PDI融合蛋白基因和肽基-脯氨醯順反異構酶PPI蛋白基因的三基因p⑶FDuet-l-sumoQ6PDI-PPI表達質粒。在本發明的另一實施方式中，提供用上述質粒和含目的蛋白基因的質粒共同轉化宿主細胞，選擇同時轉化了這二種質粒的宿主細胞的方法。所述方法包括採用含這二種質粒所含抗性標記的相應二種或多種抗菌素的LB平板培養轉化菌，挑選同時轉化了這兩種質粒的陽性克隆菌落。在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括已建立的各種大腸桿菌、枯草桿菌菌株等。本發明也提供用含二硫鍵蛋白基因的質粒和含上述相關酶和伴侶蛋白基因的質粒共同轉化得到的陽性共表達克隆菌株，具體包括二基因共表達 pCDFDuet-l-sumoQ6/pET28a-rPA_BL21 菌株、pCDFDuet-l_sumoQ6/pET28a_tpa_BL2I 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6/pET28a-Gluc_BL2I 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6/pET28a-BMP2_BL21 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6/pET28a-VEGF-BL21菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6/pET28a-rPA-Origarni B 菌株、pCDFDuet-l_sumoQ6/pET28a-tpa~0rigarni B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6/pET28a-Gluc-0rigami B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6/pET28a-BMP2-0rigami B 菌株、pCDFDuet-l_sumoQ6/pET28a-VEGF-0ri garni B 菌株；三基因共表達pCDrouet-l-sumoQ6PDI/pET28a-rPA-BL21 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6PDI/pET28a-tpa-BL21 菌株、pCDFDuet-l_sumoQ6PDI/pET28a-Gluc-BL21 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6PDI/pET28a-BMP2_BL21 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6PDI/pET28a-VEGF-BL21 菌株、pCDFDuet-l_sumoQ6PDI/pET28a-rPA~0rigarni B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6PDI/pET28a-tpa-0rigarni B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6PDI/pET28a-Gluc-0rigami B 菌株、pCDFDuet-l_sumoQ6PDI/pET28a-BMP2-0rigarni B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6PDI/pET28a-VEGF-0rigami B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6-PDI/pET28a-rPA-BL21 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6_PDI/pET28a_tpa_BL21 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6-PDI/pET28a-Gluc_BL21 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6-PDI/pET28a-BMP2-BL21 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6_PDI/ pET28a-VEGF-BL21> pCDFDuet-l-sumoQ6-PDI/pET28a-rPA-0rigarni B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6-PDI/pET28a-tpa-0rigami B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6_PDI/ET28a-Gluc-0rigarni B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6-PDI/pET28a-BMP2-0rigarni B 菌株、pCDFDuet-l-sumoQ6-PDI/pET28a-VEGF-0ri garni B 菌株；四基因共表達 pCDFDuet-l_sumoQ6 (295-540) PDI-PPI/pET28a_rPA-Rossetta 菌株、pCDFDuet-l_sumoQ6 (295-540) PDI-PPI/pET22b-rPA-Rossetta 菌株。


圖I是巰基氧化酶ERV/ALR結構域示意圖(摘自Alon, A等,Febs Lett, 2010,584(8) :1521-1525)。圖中A為QSOX (300-540區段)的二級結構，淺灰色是^摺疊區域，深灰色是a螺旋區域，粗體字母「C」是參與二硫鍵形成的半胱氨酸殘基；B為QSOX的ERV/ALR結構域胺基酸序列與Erv2p胺基酸殘基對比(NCBI) ;C為QSOX (286-546區段)和Erv2p蛋白質三維結構圖。圖2為活性rpa的濃度與405nm吸收光變化斜率的標準曲線。圖3為p⑶FDuet-I和pET28a表達質粒的構建和共同轉化感受態大腸桿菌的示意圖。圖4為同源重組連接示意圖。圖5顯示不同融合蛋白氧化DTT巰基的活性。meanV360，485指360nm激發光產生的485nm發射光強度變化的斜率，它與巰基被氧化的速率成正比。圖6顯不不同融合蛋白氧化rRNase巰基的活性。meanV360,485指360nm光激發產生的485nm發射光強度變化的斜率，它與巰基被氧化的速率成正比。圖7為細胞外sumoPDIQ6融合蛋白體外使rpa復性的效率圖。樣品為IyM rrpa,於加入5 ii M sumoPDIQ6融合蛋白後lh、24h、48h分別測定活性rpa濃度。圖8顯示rpa單獨表達菌或與PDI或Q6PDI或Q6TOI+PPI共表達菌裂解上清液中活性rpa濃度的測定結果。 圖9顯示rpa單獨表達菌或與Q6或PDI或Q6PDI共表達菌裂解液離心前樣品及離心後上清液樣品的SDS-PAGE電泳結果。A :菌體總裂解液；B :細菌裂解上清液。泳道I. rpa ；泳道2. Q6-rpa ;泳道3. PD I-rpa ;泳道4. Q6PDI-rpa ;泳道5.分子量標記。箭頭所指為rpa條帶。圖10顯示18°C誘導的rpa單獨表達、與Q6共表達、與PDI共表達、與Q6PDI共表達所得I升培養菌裂解液純化得到的活性rpa的含量。圖11顯示30°C誘導的rpa-PDI共表達、或rpa_PDI Q6共表達所得I升培養菌裂解液純化得到的活性rpa含量。圖12顯示30°C誘導的rpa-PDI Q6 (295-540)共表達，或18°C誘導的PDI-rpa共表達所得I升培養菌裂解液純化得到的活性rpa的含量。圖13顯不18°C誘導的rpa_Q6_PDI三基因質粒分別轉化的Rosetta和Rosettagarni B培養菌裂解上清液純化得到的rpa的量。以單獨表達rpa的Rosetta garni B菌為對照。圖14顯示30°C誘導的Erol-L a PDI-rpa共表達、或18°C誘導的PDI-rpa共表達所得I升培養菌裂解液純化得到的活性rpa的含量。圖15顯示30°C誘導的ErvZ-CF1D I-rpa共表達、或18°C誘導的HH-rpa共表達所得I升培養菌裂解液純化得到的活性rpa的含量。、
圖16顯示tpa單獨表達、與Q6共表達、與F1DI共表達、與Q6+PDI共表達的Rosetta菌或Rosetta garni B菌裂解上清液中活性rpa濃度的測定結果。R表示菌株Rosetta ；R. g. B表不菌株 Rosetta garni B。圖17顯示tpa_Q6PDI共表達菌裂解上清液活性rpa濃度的測定結果。R表示菌株Rosetta圖18顯示GLUC-Q6共表達菌裂解上清液中的活性GLuc測定結果。圖19顯示GLuc與H)I、或與Q6PDI共表達菌裂解上清液中GLuc活性的測定結果。圖20顯示GLuc單獨表達、與PDI共表達、與Q6PDI共表達產生的GLuc的比活力測定結果。三種樣品濃度均為IOnM時測得。圖21顯示BMP2單獨表達、與Q6、或與H)I、或與Q6TOI共表達菌裂解液的SDS-PAGE鑑定結果。採用15% SDS-PAGE凝膠。BMP2分子量約為13KD，黑色箭頭和方框為BMP2條帶。泳道 I.單獨 BMP2 ;泳道 2. Q6-BMP2 ;泳道 3. PDI-BMP2 ;泳道 4. Q6PDI-BMP2。圖22顯示單獨表達或與PDIQ6共表達產生的VEGF121蛋白的SDS-PAGE及斑點印染鑑定。單獨表達的VEGF121 ;與sumoPDIQ6共表達產生的VEGF121 ；A =SDS-PAGE,箭頭所指為VEGF12條帶，Marker條帶是14. 4KD ；B :斑點印染。圖23為rpa與sumoroiQ6分別用pET系列載體和p⑶FDuet-I共表達得到的菌體上清中活性rpa的濃度比較。圖中左側直方為pET28a-rpa與pO)FDuet-l-sumoPDIQ6共表達；右側直方為pQ)FDuet-l_rpa與pETsumoPDIQ6共表達。下面結合具體實施方式
，進一步闡述本發明。應該理解，這些實施方式僅用於說明本發明而不限於本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按《分子克隆實驗指南》中所述條件，或按照製造提供試劑盒廠商所建議的條件執行。
具體實施例方式以下用實施例對本發明作進一步闡述。這些實施例僅僅用於舉例說明本發明，而不對本發明的範圍構成任何限制。材料和方法實施例中主要採用常規基因工程分子生物學克隆方法，這些方法是本領域普通技術人員所熟知的，例如簡 羅斯凱姆斯等的《分子生物學實驗參考手冊》和J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯的「分子克隆實驗指南」(第三版，2002年8月，科學出版社出版，北京)中有關章節所述的方法。本領域普通技術人員按照以下實施例，不難根據具體情況略作修改和變換而成功實施本發明，這些修改和變換均落在本申請權利要求的範圍內。實施例中所用的原核表達pET28a、pET22b、pO)FDuet-l質粒載體購自Novagen公司，原核表達pETsumo質粒載體及試劑盒購自Invitrogen公司(見Champion pET SUMO蛋白表達系統說明書，可高水平表達重組蛋白和增強其可溶性，盒中包括相應的全套pETSUMOTA克隆試劑、感受態大腸桿菌、蛋白酶、線性化的pETsumo質粒、各種所需緩衝液、T4DNA連接酶等)。pET28a、pETsumo、pET22b複製起始位點是pBR322，前兩者都含卡那黴素抗性基因，pET22b含氨苄青黴素抗性基因，它們都含有17啟動子和IacI基因，可用IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)在原核生物中誘導表達目的蛋白。p⑶FDuet-I複製起點是⑶F複製起點，pCDFDuet-1含有兩個閱讀框，都由17啟動子啟動轉錄，可以同時在兩個閱讀框內插入異源蛋白基因，可用IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)在原核生物中同時誘導兩個異源蛋白表達，同時還含有鏈黴素抗性基因和IacI基因。含CDF複製起始點的pCDFDuet-1 (鏈黴素抗性)與pET28a(卡那抗性)、pETsumo (卡那抗性)和pET22b (氨節抗性)的抗性篩選標記(抗性基因)和複製起點不相同，故pCDFDuet-1可以與pET28a或pETsumo或pET22b能同時在宿主細胞中穩定存在。
實施例中的所用的克隆大腸桿菌菌株Machl購自Invitroten公司，Machl因包含tonA基因缺失突變而對Tl和T5噬菌體具有抗性。實施例中表達所用的大腸桿菌菌株 BL21、Rosetta、Origami B、Rosetta garni B 均購自 Novagen 公司，都包含 Lon ATP 依賴蛋白酶基因(Ion)和外膜蛋白酶基因(ompT)缺失突變，因而表達外源蛋白的穩定性高。Rosetta菌株含有表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因的質粒，對外源蛋白的翻譯效率高。OrigamiB菌株是BL21硫氧還蛋白還原酶(trxB)和穀胱甘肽還原酶(gor)缺失突變株,其胞質的氧化還原勢高，同時基因組包含四環素和卡那黴素抗性基因(缺失篩選形成的)。Rosettagami B菌株是在Origami B中導入表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因的質粒得到的菌株，其基因組也包含四環素和卡那黴素抗性基因(缺失篩選形成的)。實施例中普遍採用了聚合酶鏈式反應(PCR)。我們設計的用於PCR的所有引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成、純化和經質譜法鑑定正確。實施例所用的Taq DNA聚合酶購自東盛生物，Pfu DNA聚合酶購白天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTARDNA聚合酶購自上海TaKaRa公司，三種聚合酶購買時都附贈相應聚合酶緩衝液和dNTP。NdeI,NotI、BamHI、SacI等限制性內切酶、T4連接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)購自Fermenpas公司，購買時附帶有10XTango 緩衝液等。實施例中所用的CloneEZ PCR克隆試劑盒(含同源重組酶)購自南京金斯瑞生物科技有限公司(原金思特科技(南京)有限公司)。化學試劑均購自國藥集團上海化學試劑公司。核酸酶A購自sigma公司，瑞替普酶購自愛德藥業(北京)有限公司，抗VEGF抗體為本實驗室製備,蛋白A購自sigma公司。5，5' 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和咪唑(Imidazole)購自Alfa公司；卡那黴素(Kana)、氨苄青黴素(Amp)、氯黴素(CAM)、二硫蘇糖醇(DTT)和還原性穀胱甘肽(GSH)購自Ameresco公司；三羧甲基磷酸(TCEP)購自Pierce公司；黃素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD)購自Alfa公司；辣根過氧化物酶(HRP)和高香草酸(HVA)購自Merck公司生產。本發明實施例中所用的DNA純化試劑盒購自BBI公司(加拿大)，質粒小抽試劑盒購白天根生化科技(北京)有限公司。本發明實施例中用到的主要儀器有Biotek Synergy 2多功能酶標儀(美國BioTek公司)，AKTA primer蛋白純化儀(美國GE公司)，X-15R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，Microfuge22R臺式高速冷凍離心機(美國beckman公司)，PCR擴增儀(德國 Biometra 公司)。本發明實施例中所用的目的蛋白和酶蛋白等的基因序列均通過計算機檢索NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站獲得。檢索各蛋白編碼基因的具體網站如下Q6http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_001004128. IPDI 和 PPI (http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/protein/NP 066953.I)Erol-L a (http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/protein/NP 055399.I)Erv2~c (http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/protein/NP 015362.I)
權利要求
1.一種多基因共表達體系，包括含二硫鍵蛋白編碼基因的表達載體和一種或幾種具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因的表達載體，所述酶或伴侶蛋白的編碼基因以融合基因形式構建在表達載體的一個閱讀框中或兩個或兩個以上所述酶或伴侶蛋白的編碼基因分別構建在所述表達載體的不同閱讀框中，所述目的蛋白的編碼基因構建在與所述酶或伴侶蛋白的所述表達載體含有不同抗性基因的表達載體中。
2.如權利要求I所述的多基因共表達系統，其中所述目的蛋白是其表達後摺疊形成的構象正確與否決定其有無生 物學功能的蛋白，所述目的蛋白含有一個或一個以上分子內和分子間二硫鍵。
3.如權利要求2所述的多基因共表達系統，其中所述目的蛋白選自人組織纖溶酶原激活蛋白rpa、Gaussia螢光素酶Gluc蛋白、人骨形態發生蛋白2-BMP2和人 血管內皮生長因子VEGF121蛋白。
4.如權利要求I所述的多基因共表達系統，其中所述具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白是參與或輔助所述目的蛋白正確摺疊形成正確構象的酶和/或伴侶分子，包括參與二硫鍵蛋白表達後分子內半胱氨酸正確配對形成正確二硫鍵、摺疊成正確活性構象的各種酶和伴侶蛋白。
5.如權利要求4所述的多基因共表達系統，其中所述具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白選自以下組合巰基氧化酶Q6和二硫鍵異構酶roi的融合蛋白；巰基氧化酶人內質網氧化還原蛋白Erol家族蛋白Erol-La和人二硫鍵異構酶PDI的融合蛋白Erol-L a PDI ;釀酒酵母巰基氧化酶Erv2的巰基氧化活性結構域Erv2_c和人二硫鍵異構酶PDI的融合蛋白Erv2-croi，及Q6PDI融合蛋白與肽基-脯氨醯順反異構酶PPI的組合 Q6PDI-PPI。
6.如權利要求I所述的多基因共表達系統，其中所述目的蛋白的編碼基因構建在pET28a或pET22b表達質粒中。
7.如權利要求I所述的多基因共表達系統，其中所述具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因構建在選自以下質粒的表達質粒中含Q6基因的 pCDFDuet-l-sumoQ6 表達質粒、含 Q6PDI 融合基因的 pCDFDuet-l_sumoQ6PDI 表達質粒、含H)IQ6融合基因的pCDFDuet-l-sumoPDIQ6表達質粒、含H)IQ6 (295-540)融合基因的 pCDFDuet-l-sumoroiQ6 (295-540)表達質粒、含 Q6 (295-540) PDI 融合基因的 pCDFDuet-l-sumo Q6 (295-540) PDI 表達質粒、含 Erol-La PDI 融合基因的pCDFDuet-l-sumoErol-L a PDI 表達質粒、含 Erv2_cPDI 融合基因的 pCDFDuet-l-Erv2_cPDI表達質粒、在二個閱讀框中分別含Q6基因和PDI基因的pCDFDuet-l-sumo Q6-PDI表達質粒、在二個閱讀框中分別含Q6TOI融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因p⑶FDuet-l-sumoQ6PDI-PPI表達質粒，及在二個閱讀框中分別含TOIQ6融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-l-sumoQ6PDI-PPI表達質粒。
8.權利要求I所述多基因共表達系統的製備方法，其特徵在於包括 (1)構建具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因的融合基因並將所述融合基因構建在表達載體的一個閱讀框中，或構建兩個或兩個以上所述酶或伴侶蛋白的編碼基因並將它們分別構建在表達載體的不同閱讀框中；和 (2)構建與所述酶或伴侶蛋白的所述表達載體含有不同抗性基因的目的蛋白編碼基因的表達載體。
9.含有組合的相關酶和/或伴侶蛋白基因的表達載體(質粒)，包括含Q6基因的 pCDFDuet-l-sumoQ6 表達質粒、含 Q6PDI 融合基因的 pCDFDuet-l_sumoQ6PDI 表達質粒、含H)IQ6融合基因的pCDFDuet-l-sumoPDIQ6表達質粒、含H)IQ6 (295-540)融合基因的 pCDFDuet-l-sumoroiQ6 (295-540)表達質粒、含 Q6 (295-540) PDI 融合基因的 pCDFDuet-l-sumo Q6 (295-540) PDI 表達質粒、含 Erol-La PDI 融合基因的pCDFDuet-l-sumoErol-La PDI 表達質粒、含 Erv2_cPDI 融合基因的 pCDFDuet-l-Erv2_cPDI表達質粒、在二個閱讀框中分別含Q6基因和PDI基因的p⑶FDuet-l-sumo Q6-PDI表達質粒、在二個閱讀框中分別含Q6TOI融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-l-sumoQ6PDI-PPI表達質粒、在二個閱讀框中分別含H)IQ6融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-l-sumoQ6PDI-PPI表達質粒。
10.用權利要求I所述多基因共表達系統製備可溶性功能性目的蛋白的方法，其特徵在於包括 (1)將所述多基因共表達系統中的所述含二硫鍵目的蛋白編碼基因的表達載體和所述具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因的表達載體同時轉化宿主細胞，依據這兩種載體抗性的不同，採用二種或三種抗菌素培養基，選出同時轉化入這兩種載體的陽性克隆菌落； (2)培養選出的陽性克隆菌落，誘導共表達目的蛋白與相關酶和/或伴侶蛋白，通過它們在細胞內的相互作用產生可溶性功能目的蛋白。
11.用權利要求I所述多基因共表達系統在體外製備可溶性功能性目的蛋白的方法，其特徵在於包括 (1)將所述多基因共表達系統中的所述含二硫鍵目的蛋白編碼基因的表達載體和所述具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因的表達載體分別轉化宿主細胞，選出分別表達它們的陽性克隆菌落； (2)分別培養選出的陽性克隆菌落，分別誘導表達目的蛋白與相關酶和/或伴侶蛋白，通過它們在細胞外的相互作用產生可溶性功能目的蛋白。
12.用權利要求10或11的方法製得的純化的可溶性功能目的蛋白和相關酶和/或伴侶蛋白及其融合蛋白。
全文摘要
本發明提供一種多基因共表達體系，包括含二硫鍵目的蛋白編碼基因的表達載體和一種或幾種具有促進二硫鍵目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侶蛋白的編碼基因的表達載體，所述酶或伴侶蛋白的編碼基因以融合基因形式構建在表達載體的一個閱讀框中或兩個或兩個以上所述酶或伴侶蛋白的編碼基因分別構建在所述表達載體的不同閱讀框中，所述目的蛋白的編碼基因構建在與所述酶或伴侶蛋白的所述表達載體含有不同抗性基因的表達載體中。還提供多基因共表達系統的製備方法及用其製備可溶性功能性目的蛋白的方法。本發明的多基因共表達系統使其所表達的含二硫鍵蛋白形成正確的二硫鍵、摺疊成正確空間構象而溶於裂解上清液中，並保持相應生物學功能或活性。
文檔編號C12P21/00GK102643847SQ20111003986
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月17日 優先權日2011年2月17日
發明者張文耀, 楊弋, 鄭文雲 申請人:華東理工大學