生物人工肺的製作方法

2023-05-23 23:55:51 1

專利名稱：生物人工肺的製作方法
技術領域：
本文件提供了涉及組織生成的裝置和方法。例如，本文件提供了用於生成人或動物受試者中的可移植肺組織的方法。
背景技術：
肺移植物代表許多經歷以肺衰竭為典型的狀況，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD) C0PD、囊性纖維化病、肺癌、和先天性肺疾病等的患者的最後希望。肺移植的典型等待時間可以是2年以上，導致等待表上的那些人的30%死亡率。發明概述呈現了氣道器官生物反應器裝置。該裝置具有器官室，其配置為容納對之(onto) 灌注細胞培養基以培養器官的器官基質支架。該裝置進一步具有溼式通風器系統，其配置為經由連接器的第一分支對所述器官供應溼式通氣。所述裝置進一步具有乾式通風器系統，其配置為經由連接器的第一分支對所述器官供應乾式通氣。所述裝置進一步具有控制器，其配置為控制溼式通氣的投遞或乾式通氣的投遞。所述裝置可以進一步包含連接器，其包含與所述器官連接的第一分支、第二分支、 和第三分支。所述裝置進一步具有所述連接器的所述第一分支和所述連接器的所述第二分支與所述連接器的所述第三分支連接的第一三通接合(three-way junction)。所述三通接合包括開關，其可以配置為在所述第一分支和所述第二分支間轉換。所述裝置進一步具有溼式通風器系統，其配置為經由所述連接器的所述第一分支對所述器官供應溼式通氣。所述裝置進一步具有乾式通風器系統，其配置為經由所述連接器的所述第二分支對所述器官供應乾式通氣。所述裝置進一步具有控制器，其配置為控制所述第一三通接合的所述開關， 由此控制溼式通氣的投遞或乾式通氣的投遞。所述裝置可以進一步包含貯液系統(reservoir system)，其配置為通過進入線 (ingress line)對所述器官供應細胞培養基；並通過外出線(egress line)從所述器官排出廢培養基，所述外出線包含第一分支、第二分支、和第三分支；和所述外出線的所述第一分支和所述外出線的所述第二分支與所述外出線的所述第三分支連接的第二三通接合。溼式通風器系統可以包含經由溼式通氣線與所述器官室連接的溼式通風器；和經由所述連接器的所述第一分支與所述器官連接的順應室(compliance chamber) 0可以經由所述順應室的提高對所述器官室提供溼式呼氣末正壓(wet positive and expiratory pressure, wPEEP)。所述裝置可以進一步包含後負荷室，其經由所述外出線的所述第二分支與器官室連接；並經由外出回流線(egress return line)與貯液系統連接。貯液系統可以包含經由進入線與所述器官室連接的第一貯液器；和第二貯液器，其經由器官室引流器與器官室連接；並經由所述外出回流線與後負荷室連接，其中所述第一貯液器和第二貯液器通過貯液器進料線和貯液器引流管使培養基循環。乾式通風器系統可以包含含有噴霧器的乾式通氣室，其經由所述連接器的所述第二分支與所述器官連接；和第一乾式通風器，其配置為對所述器官室提 共乾式呼氣末IE壓(dry positive and expiratory pressure, dPEEP)，並且其經由dPEEP線與所述乾式通氣室連接。乾式通風器系統可以進一步包含第二乾式通風器， 其經由乾式通風器線與所述器官室連接。所述裝置可以進一步包含氣罐，其配置為對所述器官室、所述乾式通氣室、和所述貯液系統供應氣體介質。控制器可以由計算機操作。在另一方面，本文件的特徵在於一種提供生物人工氣道器官的方法。該方法可以包括提供包含肺組織基質(lung tissue matrix)和實質血管系統(substantial vasculature)的肺組織基質；用細胞接種所述肺組織基質；給組織提供溼式通氣，其持續時間足以發生第一期望程度的器官成熟；並給所述溼式成熟器官提供乾式通氣，其持續時間足以發生第二期望程度的器官成熟，由此提供生物人工肺。該方法可以進一步包括通過所述器官的所述血管系統用內皮細胞接種所述肺組織基質；並通過所述器官的氣道用表皮細胞接種氣道肺組織基質。該方法可以進一步包括通過所述器官的血管系統用幹細胞接種所述肺組織基質。所述幹細胞可以是骨髓衍生的間充質幹細胞或誘導的多能幹(iPS)細胞。可以將所述幹細胞以每30cc流體約1億個細胞的濃度在流體中懸浮。可以將所述內皮細胞以每IOcc流體約1億個細胞的濃度在流體中懸浮。可以將所述表皮細胞以每5cc 流體約1億個細胞的濃度在流體中懸浮。所述方法可以進一步包括監測器官成熟的程度， 直至已經發生第一期望程度的器官成熟；對所述器官停止所述溼式通氣；對所述器官應用人工表面活化劑；並對所述器官開始所述乾式通氣。給所述肺組織基質提供溼式通氣可以包括經由溼式通風器線連接所述氣道與溼式通風器；經由溼式通氣線連接所述器官與順應室；通過所述溼式通氣線提高溼式氣道壓力；並通過提高所述順應室對所述器官提供溼式呼氣末正壓(wPEEP)。以生理潮氣量提供所述溼式通氣。給所述溼式成熟器官提供乾式通氣可以包括經由乾式通氣線連接所述氣道與乾式通氣室；通過乾式呼氣末正壓(dPEEP)線連接所述乾式通氣室與第一乾式通風器；通過所述乾式通氣線提高幹式氣道壓力；斷開所述溼式通氣線；並經由乾式通風器線連接所述器官與第二乾式通風器。所述肺組織基質可以包含去細胞化的人肺組織或人工肺基質。生物人工肺可以包含足以提供完整的肺功能或其一部分的細胞數目。在另一方面，本文件的特徵在於通過本文中提供的方法生成的生物人工肺。生物人工肺可以是完整的肺或其一部分。在又一方面，本文件的特徵在於一種治療具有受損的或降低的肺容量的受試者的方法。該方法可以包括將生物人工肺移植入所述受試者中。除非另有定義，本文中所使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域普通技術人員的通常理解具有相同的意義。雖然可以使用與本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料來實施本發明，但是下文描述了合適的方法和材料。通過提及而完整收錄本文中所提及的所有出版物、專利申請、專利、和其它參考文獻。在衝突的情況中，應當以本說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法、和例子僅是例示性的，而並不意圖為限制性的。在附圖和下文描述中列出了本發明的一個或多個實施方案的詳情。從描述和附圖及從權利要求書看，本發明的其它特徵、目的、和優點會是顯而易見的。附圖簡述


圖1是例示性肺生物反應器的示意圖。圖2A、2B、2C、和2D是用於在肺生物反應器中培養肺組織的例示性方法的流程圖。圖3是例示性的肺去細胞化單元的示意圖。圖4是細胞接種模式的例示性肺生物反應器的示意圖。圖5是灌注模式的例示性肺生物反應器的示意圖。圖6是例示性肺生物反應器的示意圖。發明詳述本文件涉及牽涉器官生成的方法和材料。本發明至少部分基於配置為生成功能性肺組織的生物反應器的發現，所述生物反應器可以用於為準備好移植入人和其它動物中的功能性氣道器官生長提供更實際的環境。通過給定的基質，例如人工的或去細胞化的肺組織基質生成肺組織。如本文中所使用的，「功能性」肺組織執行正常的健康肺的大多數或所有功能，例如容許將氧從空氣運輸到血流中，及將二氧化碳從血流釋放到空氣中。它溼潤吸入的空氣， 生成表面活性劑以降低肺泡中的表面張力，而且生成並轉運粘液以將吸入的微粒物質從遠端移動到近端氣道。如本文中所使用的，術語「去細胞化的」和「無細胞的」可互換使用，並且定義為使用標準的組織學染色方法在組織切片中完全或幾乎完全沒有可檢出的胞內、內皮細胞、表皮細胞、和細胞核。優選地，但不必要地，還已經自去細胞化的器官或組織除去殘留的細胞碎片。去細胞化的組織/器官基質用於製備去細胞化的肺組織基質的方法和材料是本領域中已知的。可以使用任何合適的材料來製備此類基質。在一個優選的實施方案中，組織基質可以是自去細胞化的肺組織形成的無細胞組織支架。例如，可以通過合適的方法來使諸如人肺等組織或其一部分去細胞化，以在維持組織或組織部分的形態學完整性和血管系統並保留胞外基質(ECM)蛋白的情況中自組織除去天然的細胞。在一些情況中，可以使用屍體的肺或其一部分。去細胞化方法可以包括使用液氮將組織(例如肺組織)進行重複冷凍-融化循環。在其它情況中， 可以使組織受到陰離子或離子細胞破壞介質諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇(PEG)、 或TritonX-100處理。還可以用核酸酶溶液(例如，核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶)處理組織，並將其在無菌磷酸鹽緩衝鹽水中在溫和攪動的情況中清洗。在一些情況中，可以使用本領域中已知的方法和材料通過將導管插入器官或組織的血管、導管、和/或腔來實施去細胞化。在插管步驟後，可以經由插管用如上文所描述的細胞破壞介質灌注器官或組織。灌注通過組織可以是順行的或逆行的，並且可以交替方向以改善灌注效率。根據器官或組織的大小和重量和特定陰離子或離子去汙劑及陰離子或離子去汙劑在細胞破壞介質中的濃度， 一般用細胞破壞介質對組織灌注約2至約12小時/克組織。包括清洗，可以對組織灌注多至約12至約72小時/克組織。一般針對生理狀況調節灌注，包括流速和壓力。去細胞化的組織可以基本上由組織的所有或大多數區域的胞外基質(ECM)組分， 包括血管樹的ECM組分組成。ECM組分可以包括下列任一或所有項纖連蛋白、肌原纖蛋白、 層粘連蛋白、彈性蛋白、膠原家族成員(例如，膠原Ι、ΠΙ、和IV)、糖胺聚糖、基質、網狀纖維和血小板反應蛋白，其仍可以組織為限定的結構諸如基膜。在一個優選的實施方案中，去細胞化的肺組織基質保留基本上完整的血管系統。保留基本上完整的血管系統實現移植後組織基質與受試者血管系統的連接。另外，可以用例如照射(例如，UV、gamma)進一步處理去細胞化的組織基質以降低或消除保留於去細胞化的組織基質之上或之中的任何類型的微生物的存在。使用物理、化學、和酶手段來獲得去細胞化的組織基質的方法是本領域中已知的，參見例如 Liao 等，Biomaterials 29(8) :1065-74(2008) ；Gilbert 等，Biomaterials 27 (9) :3675-83 (2006) ；Teebken Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 19 :38卜86 (2000)。 還可參見美國專利公開文本 No. 2009/0142836 ；2005/0256588 ；2007/0244568 ；及 2003/0087428 ο人工器官基質用於製備人工器官基質的方法和材料是本領域中已知的。可以使用任何合適的材料來製備此類基質。在一個優選的實施方案中，人工器官基質可以是自多孔材料諸如例如聚乙醇酸、Pluronic F-127 (PF-127)、Gelfoam海綿、膠原-糖胺聚糖(GAG)、血纖蛋白原-纖連蛋白-玻連蛋白水凝膠(FFVH)、和彈性蛋白開發的支架。參見例如hgenito等， J Tissue Eng Regen Med. 2009 年 12 月 17 日；Hoganson 等，Pediatric Research,2008 年 5 月，63(5) :520-526 ；Chen 等，Tissue Eng. 2005 年 9 月-10 月；11(9-10) 1436-48 在一些情況中，人工器官基質可以具有與肺泡單元相似的多孔結構。參見Andrade等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007 年 2 月；292 (2) :L510_8。在一些情況中，植入的人工器官基質可以表達器官特異性標誌物(例如，克拉拉細胞、肺細胞、和呼吸上皮的肺特異性標誌物)。在一些情況中，植入的人工器官基質可以組織成可鑑定的結構(例如， 人工肺基質中與肺泡和末端支氣管相似的結構)。例如，使用FFVH生成的植入的人工肺基質可以在體外促進細胞附著、擴散和胞外基質表達及在體內促進表觀嫁接(apparent engraftment)，對周圍組織具有營養效應的證據。參見hgenito等，見上文。還可參見美國專利 No. 7，662，409 和 6，087，552 ；美國專利公開文本 No. 2010/0034791 ；2009/0075282 ； 2009/0035855 ； 2008/0292677 ； 2008/0131473 ； 2007/0059293 ； 2005/0196423 ； 2003/0166274 ；2003/0129751 ；2002/0182261 ；2002/0182241 ；及 2002/0172705。細胞接種在本文中所描述的方法中，用細胞，例如分化的或再生的細胞接種肺組織基質，例如去細胞化的肺組織基質或人工肺基質。可以使用任何合適的再生細胞類型，諸如未處理的或未分化的細胞類型來接種肺組織基質。如本文中所使用的，再生細胞可以包括但不限於祖細胞、前體細胞、和「成人」衍生的幹細胞(包括臍帶細胞(例如，人臍靜脈內皮細胞))和胎兒幹細胞。再生細胞還可以包括分化的或定型的細胞類型。適合於本文中所提供的方法和材料的幹細胞可以包括人誘導的多能幹細胞(iPSC)、間充質幹細胞、人臍靜脈內皮細胞、多能成人祖細胞(MAPC)、或胚胎幹細胞。在一些情況中，還可以使用源自其它組織的再生細胞。例如，可以使用源自皮膚、 骨、肌肉、骨髓、滑膜、或脂肪組織的再生細胞來形成幹細胞接種的組織基質。在一些情況中，可以用分化的細胞類型諸如人表皮細胞和內皮細胞來進一步接種本文中所提供的肺組織基質。例如，可以經由血管系統用內皮細胞，及經由灌注接種用表皮和間充質細胞以及人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)接種肺基質。
可以使用任何適用於分離並收集供接種用的細胞的方法。例如，誘導的多能幹細胞一般可以自通過轉錄因子諸如0ct4、Sox2、Klf4、c-MYC, Nanog、和LiM8的異位表達「重編程」為多能狀態的體細胞獲得。參見Takahashi等，Cell 131 :861-72 Q007) ;Park等， Nature 451 :141-146(2008) ；Yu 等，Science318 1917-2(^2007)。臍帶血幹細胞可以自新鮮的或冷凍的臍帶血分離。間充質幹細胞可以自例如粗製的未純化的骨髓或經Ficoll純化的骨髓分離。可以依照本領域中已知的方法從活的或屍體的供體，例如從會接受生物人工肺的受試者分離並收集表皮和內皮細胞。例如，表皮細胞可以自皮膚組織樣品獲得，而內皮細胞可以自血管組織樣品獲得。在一些實施方案中，經由放在血管系統中的導管將蛋白水解酶灌注到組織樣品中。可以將經酶處理的組織的一部分進行進一步的酶和機械破壞。 可以分離以此方式獲得的細胞混合物以純化表皮和內皮細胞。在一些情況中，基於特定細胞表面標誌物的存在或缺乏，可以使用基於流式細胞術的方法(例如，螢光激活的細胞分選)來分選細胞。在使用非自體細胞的情況中，應當考慮選擇免疫類型匹配的細胞，使得在植入受試者中時不會排除器官或組織。可以將分離的細胞在緩衝溶液(例如，磷酸鹽緩衝鹽水)中漂洗，並在細胞培養基中重懸。可以使用標準的細胞培養方法來培養並擴充細胞群。一旦獲得，可以使細胞與組織基質接觸以接種基質。例如，可以以任何合適細胞密度在體外用至少一種細胞類型接種組織基質。例如，用於接種基質的細胞密度可以是至少IxlO3個細胞/克基質。可以使用範圍可以為約IxlO5至約IxlOici個細胞/克基質(例如，至少100, 000,1, 000, 000,10, 000, 000, 100，000，000、1，000，000，000、或 10，000，000，000 個細胞 / 克基質)的細胞密度。在一些情況中，可以通過灌注接種以上文所描述的細胞類型和細胞密度接種如本文中所提供的去細胞化的或人工的肺組織基質。例如，經由保留於組織基質中的血管系統， 可以使用流動灌注系統來接種去細胞化的肺組織基質。在一些情況中，可以在合適的條件下使用自動化流動灌注系統。此類灌注接種方法可以改善接種效率，並且在整個組成中提供更一致分布的細胞。可以使用定量生物化學和圖像分析技術來評估靜態或灌注接種方法後的接種細胞的分布。在一些情況中，可以給組織基質注入一種或多種生長因子以刺激接種的再生細胞的分化。例如，可以給組織基質注入適合於本文中所提供的方法和材料的生長因子，例如血管內皮生長因子(VEGF)、TGF-i3生長因子、骨形態發生蛋白(例如，BMP-I、BMP_4)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)，例如FGF-10、胰島素樣生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)、或生長分化因子-5(⑶F-5)。參見例如Desai和Cardoso， Respir. Res. 3 :2(2002)。可以將接種的組織基質在接種後溫育一段時間(例如從幾小時至約14天或更多) 以改善細胞在組織基質中的固定和滲透。可以在如下的條件下維持接種的組織基質，其中至少一些再生細胞可以在無細胞組織基質之內和之上增殖和/或分化。此類條件可以包括但不限於合適的溫度和/或壓力、電和/或機械活動(例如，通風)、力、合適量的A和/ 或CO2、合適量的溼度、和無菌或接近無菌的條件。此類條件還可以包括溼式通氣、溼式至乾式通氣和乾式通氣。在一些情況中，可以將營養補充物(例如，營養物和/或碳源諸如葡萄糖)、外源激素、或生長因子添加到接種的組織基質。可以實施組織學和細胞染色以測定接種細胞增殖。可以實施任何合適的方法來測定接種細胞分化。一般而言，本文中所描述的方法會在例如如本文中所描述的氣道器官生物反應器裝置中實施。如此，可以使用本文中所描述的方法來生成可移植的生物人工肺組織，例如用於對人受試者移植。如本文中所描述的，可移植的組織會優選地保留足夠完整的血管系統，其可以與患者的血管系統連接。本文中所描述的生物人工肺組織可以與包裝材料組合以生成製造商品或試劑盒。 用於生產製造商品的組分和方法是公知的。在生物人工組織外，製造商品或試劑盒可以進一步包括例如一種或多種抗粘合劑、無菌水、藥用載體、緩衝液、和/或用於促進體外和/或移植後功能性肺組織形成的其它試劑。另外，此類製造商品中可以包含描述可如何使用其中含有的組合物的印刷指令。製造商品或試劑盒中的組分可以在多種合適的容器中包裝。使用生物人工肺的方法本文件還提供了使用生物人工肺組織及在一些情況中促進肺功能的方法和材料。在一些實施方案中，可以使用本文中所提供的方法來恢復損害或降低肺容量的疾病 (例如，囊性纖維化病、C0PD、肺氣腫、肺癌、哮喘、肺創傷、或其它遺傳性或先天性肺異常， 例如支氣管源性囊腫、肺發育不全和低常增生(pulmonary agenesis and hypoplasia)、 多肺泡葉、肺泡毛細管發育異常、隔離，包括動靜脈畸形(AVM)和彎刀症候群(scimitar syndrome)、肺淋巴管擴張(pulmonary lymphangiectasis)、先天性肺葉性肺氣腫(CLE)、和囊性腺瘤樣畸形(CAM)和其它肺囊腫)患者中的一些肺功能。本文中所提供的方法還包括如下那些，其中受試者鑑定為需要特定的規定治療，例如，升高的肺功能、或增加或改善的肺容量。可以依照本文中所提供的方法來生成生物人工肺組織(例如，整個器官或其一部分)。在一些實施方案中，該方法包括對有此需要的受試者(例如，人患者)移植如本文中所提供的生物人工肺組織。在一些實施方案中，對患病或損傷組織部位移植生物人工肺組織。例如，可以將生物人工肺組織移植入受試者的胸腔中，替換不發揮功能或發揮功能不良的肺(或與其一起)；用於實施肺移植的方法是本領域中已知的，參見例如Boasquevisque 等，Surgical Techniques :Lung Transplant and Lung Volume Reduction, Proceedings of the American Thoracic Society 6 :66-78(2009) ；Camargo Surgical maneuvers for the management of bronchial complications in lung transplantation, Eur J Cardiothorac Surg 2008 ；34 :1206-1209(2008) ；Yoshida 等，「Surgical Technique of Experimental Lung Transplantation in Rabbits,，，Ann Thorac Cardiovasc Surg. 11 (1) :7-11 (2005) ；Venuta 等，Evolving Techniques and Perspectives in Lung Transplantation, Transplantation Proceedings 37 (6) :2682-2683 (2005)； Yang 禾口 Conte, Transplantation Proceedings 32(7) 1521-1522(2000) ；Gaissert 禾口 Patterson, Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation in The Transplantation and Replacement of Thoracic Organs, 2 IK Springer Netherlands (1996)。所述方法可以包括在部分或完全除去受試者的肺的手術方法過程中和/或肺切除過程中移植如本文中所提供的生物人工肺或其一部分。在一些情況中，可以使用本文中所提供的方法來替換或補充受試者，例如人或動物受試者中的肺組織和功能。可以實施任何合適的方法來測定移植之前或之後的肺功能。例如，可以實施方法來評估組織癒合、評估功能性、及評估細胞向內生長(in-growth)。在一些情況中，可以將組織的一部分收集，並用固定劑諸如例如中性緩衝福馬林處理。可以將此類組織的一部分脫水，在石蠟中包埋，並用切片機切片以進行組織學分析。可以將切片用蘇木精和曙紅 (H&E)染色，然後安放於玻璃載玻片上以用顯微鏡評估形態學和細胞性。例如，可以實施組織學和細胞染色來檢測接種的細胞增殖。測定法可以包括移植的組織基質的功能性評估或成像技術(例如，計算機斷層攝影術(CT)、超聲、或磁共振成像(例如，造影劑增強的 MRI))。測定法可以進一步包括在靜息和生理應激下的功能性測試(例如，身體體積描記術 (body ρletysinography)、肺功能測試)。可以使用本領域中已知的方法，例如組織學、電子顯微術、和機械測試(例如體積和順從性的)來測定用細胞接種的基質的功能性。氣體交換可以作為另一種功能性測定法測量。為了測定細胞增殖，可以例如通過檢測胸苷摻入來測量胸苷激酶活性。在一些情況中，基於血液中的氧水平，可以實施血液測試來評估肺功能。在一些情況中，可以使用分子生物學技術諸如RT-PCR來量化代謝和分化標誌物的表達。可以使用任何合適的RT-PCR方案。簡言之，可以如下收集總RNA，即將生物學樣品(例如腱樣品)均質化，實施氯仿提取，並使用旋轉柱(例如，RNeasy 微量旋轉柱 (QIAGEN,Valencia,CA))或其它核酸結合基質來提取總RNA。在其它情況中，可以使用抗體和標準的免疫測定法來檢測與肺細胞類型和不同分化階段有關的標誌物。氣道器官生物反應器裝置圖1中呈現了例示性的氣道器官生物反應器裝置。貫穿整個說明書，肺會作為氣道器官的例子提供。其它例子可以包括例如氣管。參考圖1，生物反應器的組分包括肺室102、氣道連接器、和控制器(未顯示)，所述氣道連接器包含氣管線124、溼式通氣線150、和乾式通氣線134、溼式通風器系統120、乾式通風器系統116和118、氣管線124、溼式通氣線150、與乾式通氣線134間接合處的三通連接器148。控制器是計算機操作的，而且也是手工操作的。生物反應器還可以包含肺動脈線 122、肺靜脈線126、貯液系統104和106、滾子泵(roller pump) 114、氣罐122及伴隨的氣體線、後負荷室110、肺靜脈回流線136、和肺室壓力線128。生物反應器進一步包含順應室 109和順應室引流管146。另外或取而代之，生物反應器可以進一步包含膜式氧合器以提供灌注培養基溶液的氧合和碳化(未顯示)。肺室102容納去細胞化的肺基質支架。肺室102是閉合的以提供無菌肺培養環境。 肺基質的肺動脈與肺動脈線122連接，並且肺基質的肺靜脈與肺動脈血管1 連接，其各經由血管插管連接。肺基質的氣管經由氣管線口4與氣道連接器連接。在肺室102內，用細胞培養基順行灌注細胞基質以容許接種細胞，從而培養肺。通過肺動脈線122對肺動脈發生灌注。從那裡起，培養基流過肺血管系統，並且流出到貯液系統(104 和 106)。貯液系統包括第一貯液器104和第二貯液器106，及貯液器補料線140和貯液器弓| 流管(140)。細胞培養基經由貯液器補料線138和貯液器引流管140在貯液器104和106 間循環。任選地，可以將微濾器放置於進料線140中以進行無菌過濾。細胞培養基還在貯液器104和106中氧合。對於灌注，經由滾子泵114或經由重力將細胞培養基從貯液器104 經由肺動脈線122對肺動脈補料。經由肺室引流管(4)從肺室102直接吸出流出到貯液器106的培養基以維持肺室102內的恆定流體水平。經由第三連接器1 流出肺的培養基經由重力排到後負荷室110， 並且經由後負荷室引流管136吸到貯液器106。後負荷室110經由肺室壓力線130與肺室 102並且經由肺靜脈回流線136與貯液器106連接。肺室壓力線平衡肺室102和後負荷室 110中的壓力。後負荷室110還經由氣管與肺室102並經由三通接合156與溼式通氣線連接。將細胞再導入基質中的一種例示性方法如下。在肺基質的灌注過程中，開始基質的細胞化。經由肺動脈線122接種懸浮於約30cc培養基中的約1億個間充質細胞。間充質細胞是骨髓衍生的胚胎幹細胞，但是也可以是例如iPS或造血細胞，如記載於 U. S. S. N. 12/233，017，"Generation of Inner Ear Cells」的，通過提及而將其內容完整收錄。在一些實施方案中，在完成接種後，停止灌注，例如持續約60分鐘，以容許細胞附著。 在灌注停止期間，從氣管和肺靜脈排出細胞培養基；然後，排出的細胞培養基流到貯液器 106。在60分鐘停止後，繼續僅用培養基灌注，例如持續約M小時。為了維持順應室109 中恆定的培養基水平，可以經由別的線將其與貯液器104連接(未顯示)。接著，建立用於接種內皮細胞的條件。氣管線IM經由三通接合148及其控制器與溼式通氣線150連接。三通接合156使用其控制器來轉動，以連接溼式通氣線150與順應室109。順應室109提供溼式氣道正壓(wAP)以限制淨培養基流過間質空間和氣管，同時將氣道壓力限於生理範圍。經由室109的調節來調節wAP。因此，細胞培養基的一部分經由肺靜脈線(3)排出到貯液器106，而細胞培養基的更小部分經由淋巴系統經由肺室引流線 128排出到貯液器106。經由約10分鐘的重力補料經由肺動脈線122接種懸浮於約15cc培養基中的約1 億個內皮細胞。在完成接種後，停止灌注，例如持續60分鐘以容許細胞附著。停止後，繼續灌注，例如持續約3-5天以容許內皮細胞單層的形成。在已經將內皮細胞接種，並已經形成內皮細胞單層後，內皮細胞準備好接種。對於內皮細胞的接種，三通接合156使用其控制器來轉動以堵塞溼式通氣線150。經由氣管線 124將懸浮於約15cc培養基中的約2億個內皮細胞接種入氣管中。在一些實施方案中，內皮細胞是肺細胞。在完成接種後，停止經由肺動脈的灌注，例如持續約60分鐘。此外，一旦已經完成肺的細胞接種，需要溼式通氣以將細胞懸浮液推進到外周氣道中。溼式通風器系統120通過溼式通氣線150對肺提供溼式通氣。三通接合156使用其控制器來轉動以連接溼式通氣線150與順應室109。提高 wAP以對間質空間提供小的流動，並且提高細胞附著。對肺提供溼式通氣達約5分鐘，保持約60分鐘，然後再對肺提供約5分鐘，然後保持約M小時。以生理潮氣量(對於人而言為約500mL)而以降低的速率提供溼式通氣以將溼式的峰吸氣和呼氣壓力保持較低。經由提高順應室109提供溼式呼氣末正壓。一旦恢復灌注，提供順行灌注和溼式通氣達一段約5天的時間以實現組織形成。在約5天期間後或在測定肺已經達到足夠成熟的監測(未顯示)後進行從溼式向乾式通氣的轉換。經由氣管線1 施用人工表面活性劑。然後，三通接合148使用其控制器來轉動，從而氣管線1 與乾式通氣線150和乾式通氣系統(116和118)連接。乾式通氣系統包括具有用於提供溼潤空氣的噴霧器(未顯示)的乾式通氣室112、第一乾式通風器116、和第二乾式通風器118。乾式通氣室112經由幹PEEP線144與第一乾式通風器116並經由乾式通氣線150與氣管線連接。因此，使肺通風以用氣體而不是流體緩慢充滿其空間。所使用的氣體是經由氣體線通過氣罐122供應的碳合氣(carbogen)。乾式通風器116 配置為對乾式通氣室112提供dPEEP，隨後實現肺室102中的流體排出。接著，分離溼式通氣系統120，並對肺室打開乾式通風器118以將通風速率提高至生理速率，對肺室102排空流體，並在肺室102內使肺圍繞溼潤的空氣。組織成熟的約3天後，實施灌注氣體分析以確認功能性組織的形成，及可以自生物反應器取出肺。在溼式通氣與乾式通氣間的轉換中，肺在模擬肺天然形成條件的條件下形成。已經確定了此環境是肺形成必需的，並且如所描述的生物反應器提供了生成供移植用的組織工程化改造肺需要的系統和方法。圖2A中顯示了使肺基質細胞化的例示性方法。將肺基質放置210入肺室中。然後，通過肺動脈線用細胞培養基灌注220肺基質。然後，給肺基質提供230溼式通氣。最後， 給肺基質提供乾式通氣對0。在肺基質的灌注220期間，如圖2B中所例示的，通過肺的血管系統用間充質細胞或其它幹細胞接種222肺基質。然後，通過肺血管系統用內皮細胞接種2M肺基質。然後， 通過肺氣道用表皮細胞接種2 肺基質。為了提供溼式通氣，如圖2C中所顯示的，肺氣道通過溼式通風器線與溼式通風器連接231。然後，肺經由溼式通氣線與順應室連接232。通過調節順應室內的流體高度， 然後通過溼式通氣線提高233溼式氣道壓力。此外，通過提高順應室，然後提供234溼式 PEEP(wPEEP)。監測235肺基質上生長的肺的成熟程度。如果成熟程度測定236為可接受， 那麼開始237轉變成乾式通氣。為了提供乾式通氣，如圖2D中所顯示的，經由氣管應用241人工表面活性劑。然後，氣管經由乾式通氣線與乾式通氣室連接對2。乾式通氣室通過dPEEP線與第一乾式通風器連接M3。然後，通過乾式通氣線提高244幹氣道壓力。分離溼式通氣線對5，並且肺室與第二乾式通風器連接對6。完整的大鼠肺可能需要總共約2億-4億個細胞。外推到人提供了對於完整的肺而言約2百億-約4百億個細胞的估計值。生成此類數目的細胞可能比患者可具有數目多需要幾倍。需要某一肺功能百分比，比如說20%的患者僅會需要此數目的約20%，並且會必須為新的肺等待少得成比例的時間。圖3中呈現了器官去細胞化中使用的例示性氣道器官生物反應器裝置。如上文所描述的，肺會作為氣道器官的例子提供。參考圖3，生物反應器的組分包括肺室302、密封的重力貯液器304、和大貯液器306，其中貯液器304和306含有用於灌注入肺室302中的肺中的去細胞化溶液。去細胞化溶液經由貯液器補料線314在貯液器304和306間循環。肺基質的肺動脈與肺動脈線308連接，經由所述肺動脈線308，去細胞化溶液經由重力流從貯液器304灌注到肺組織中。在去細胞化後，自肺室302除去廢物。在一些情況中，經由補料入貯液器306中的泵312再循環來自肺室302的溶液。圖4中呈現了細胞接種中使用的例示性氣道器官生物反應器裝置。參考圖4，生物反應器的組分包括肺室402、密封的重力貯液器404、和大貯液器406，其中貯液器404和 406含有用於灌注入肺室302中的肺中的細胞培養基。細胞培養基經由貯液器進料線408 在貯液器404和406間循環。肺基質的肺動脈與肺動脈線410連接，並且肺基質的肺靜脈與肺靜脈線412連接，其各經由血管插管連接。對於細胞接種，經由泵或經由重力將細胞培養基從貯液器404經由肺動脈線410對肺動脈供應細胞培養基。經由第三連接器412流出肺的培養基(靜脈流出物)經由重力排到後負荷順應室420，並且經由後負荷室引流管吸到貯液器406。後負荷室420經由肺室壓力線與肺室402並經由肺靜脈回流線412與貯液器 406連接。肺室壓力線平衡肺室402和後負荷室420中的壓力。後負荷室420還經由氣管與肺室402並經由三通接合414與溼式通氣線連接。氣管線經由三通接合414及其控制器與溼式通氣線連接。三通接合414使用其控制器轉動以連接溼式通氣線與順應室420。順應室420提供溼式氣道正壓力(wAP)以限制淨培養基流過間質空間和氣管，同時將氣道壓力限制於生理範圍。經由室420的調節來調節wAP。因此，細胞培養基的一部分經由肺靜脈線412排出到貯液器406，而細胞培養基的更小部分經由淋巴系統經由肺室引流線排出到貯液器406。圖5中呈現了基質灌注中使用的例示性氣道器官生物反應器裝置。參考圖5，生物反應器的組分包括肺室502、密封的重力貯液器504、和大貯液器506，其中貯液器504和 506含有用於灌注入肺室502中的肺中的溶液(例如，血液)。細胞培養基經由貯液器進料線508在貯液器504和506間循環。肺基質的肺動脈與肺動脈線510連接，並且肺基質的肺靜脈與肺動脈血管512連接，其各經由血管插管連接。在細胞接種後，需要溼式通氣以將細胞懸浮液推進到外周氣道中。溼式通風器系統518通過溼式通氣線對肺提供溼式通氣。然後，三通接合514使用其控制器轉動，從而氣管線與乾式通氣線和乾式通氣系統516連接。圖6中呈現了例示性的氣道器官生物反應器裝置。參考圖6，生物反應器的組分包括肺室602、密封的重力貯液器616、和大貯液器606，其中貯液器616和606含有用於灌注入肺室602中的肺中的灌注溶液。溶液經由貯液器進料線在貯液器616和606間循環。肺基質的肺動脈與肺動脈線6 連接，並且肺基質的肺靜脈與肺動脈血管6 連接，其各經由血管插管連接。對於細胞接種，經由泵或經由重力將培養基從貯液器616經由肺動脈線626 對肺動脈供應培養基。經由第三連接器擬8流出肺的培養基(靜脈流出物)經由重力排到後負荷順應室604，並且經由後負荷室引流管吸到貯液器606。為了維持順應室604中恆定的培養基水平，可以經由別的線將其與貯液器606連接(未顯示)。溼式通風器系統擬4通過溼式通氣線對肺提供溼式通氣。三通接合620使用其控制器來轉動，以連接溼式通氣線與順應室604。在約5天期間後或在測定肺已經達到足夠成熟的監測(未顯示)後進行從溼式向乾式通氣的轉換。經由氣管線630施用人工表面活性劑。然後，三通接合620使用其控制器來轉動，從而氣管線630與乾式通氣線和乾式通氣系統622連接。使肺通風以用氣體而不是流體緩慢充滿其空間。本發明會在以下實施例中進一步描述，所述實施例並不限制權利要求書中所描述的本發明的範圍。
實施例基於灌灃去細朐,僕支奧的fl市再牛自肝素化的成年SD大鼠(n = 20)分離肺，並使用去汙劑灌注來使其去細胞化。使用組織學、電子顯微術和機械測試來分析所得的胞外基質(ECM)支架。將支架安放在生物反應器中，並用人臍帶內皮細胞(HUVEC，η = 4)、HUVEC和人肺泡基底表皮細胞(Η-ΑΜ9，η =4)、和HUVEC和大鼠胎兒肺細胞(H-FLC，n = 2)接種。將培養物維持多達7天。使用血液灌注和通氣在分離的肺裝置中分析肺功能，正常的肺充當對照(n = 4)。屍體肺的灌注去細胞化產生具有完整氣道和血管結構的無細胞肺ECM支架。肺支架可以再殖入(!^populate)內皮和表皮細胞，並且在生物反應器中維持。與正常的肺 (465. 8mmHg)相比，氣體交換(Pa02/Fi02率)在H-A549構建體中較低(103. 6mmHg)，並且在 H-FLC構建體中相等(455. ImmHg)。順從性在去細胞化的肺中降低(0. 27ml/cmH20/S)，但是在 H-FLC 構建體(0. 67ml/cmH20/s)和正常的肺(0. 69ml/cmH20/s)中相等。屍體肺的灌注去細胞化產生完整的全肺ECM支架，其可以用表皮和內皮細胞接種以形成與正常的肺具有相當的通氣、灌注和氣體交換的生物人工肺。其它實施方案應當理解，雖然本發明已經結合其詳細的說明書進行描述，但是前述說明書意圖例示而非限制本發明的範圍，其由所附權利要求書的範圍限制。其它方面、優點、和修飾在所附權利要求書的範圍內。
權利要求
1.一種氣道器官生物反應器裝置，其包含器官室，其配置為容納對之灌注細胞培養基以培養器官的器官基質支架； 溼式通風器系統，其配置為對所述器官供應溼式通氣； 乾式通風器系統，其配置為對所述器官供應乾式通氣；和控制器，其配置為控制溼式通氣的投遞或乾式通氣的投遞。
2.權利要求1的裝置，其進一步包含連接器，其包含與所述器官連接的第一分支、第二分支、和第三分支；和所述連接器的所述第一分支和所述連接器的所述第二分支與所述連接器的所述第三分支連接的第一三通接合，所述三通接合包括開關，其配置為在所述第一分支和所述第二分支間轉換； 其中所述溼式通風器系統配置為經由所述連接器的所述第一分支對所述器官供應溼式通氣；所述乾式通風器系統配置為經由所述連接器的所述第二分支對所述器官供應乾式通氣；及所述控制器配置為控制所述第一三通接合的所述開關，由此控制溼式通氣的投遞或乾式通氣的投遞。
3.權利要求1的裝置，其進一步包含 貯液系統，其配置為通過進入線對所述器官供應細胞培養基；並通過外出線從所述器官排出廢培養基，所述外出線包含第一分支、第二分支、和第三分支；和所述外出線的所述第一分支和所述外出線的所述第二分支與所述外出線的所述第三分支連接的第二三通接合。
4.權利要求2的裝置，其中所述溼式通風器系統包含 溼式通風器，其經由溼式通氣線與所述器官室連接；和順應室，其經由所述連接器的所述第一分支與所述器官連接。
5.權利要求4的裝置，其中經由所述順應室的提高來對所述器官室提供溼式呼氣末正壓(wPEEP)。
6.權利要求4的裝置，其進一步包含 後負荷室，其經由所述外出線的所述第二分支與所述器官室連接；並經由外出回流線與所述貯液系統連接。
7.權利要求6的裝置，其中所述貯液系統包含 第一貯液器，其經由進入線與所述器官室連接；和第二貯液器，其經由器官室引流器與所述器官室連接；並經由所述外出回流線與所述後負荷室連接，其中所述第一貯液器和第二貯液器通過貯液器進料線和貯液器引流管使培養基循環。
8.權利要求3的裝置，其中所述乾式通風器系統包含包含噴霧器的乾式通氣室，其經由所述連接器的所述第二分支與所述器官連接；和第一乾式通風器，其配置為對所述器官室提供乾式呼氣末正壓(dPEEP)，並且其經由 dPEEP線與所述乾式通氣室連接。
9.權利要求8的裝置，其中所述乾式通風器系統進一步包含 第二乾式通風器，其經由乾式通風器線與所述器官室連接。
10.權利要求8的裝置，其進一步包含氣罐，其配置為對所述器官室、所述乾式通氣室、和所述貯液系統供應氣體介質。
11.權利要求1的裝置，其中所述控制器由計算機操作。
12.一種提供生物人工氣道器官的方法，該方法包括 提供包含氣道和實質血管系統的肺組織基質； 用細胞接種所述肺組織基質；給所述肺組織基質提供溼式通氣，其持續時間足以發生第一期望程度的器官成熟，以生成溼式成熟器官；並給所述溼式成熟器官提供乾式通氣，其持續時間足以發生第二期望程度的器官成熟， 由此提供生物人工肺。
13.權利要求12的方法，其進一步包括通過所述器官的所述血管系統用內皮細胞接種所述肺組織基質；並通過所述器官的氣道用表皮細胞接種所述肺組織基質。
14.權利要求13的方法，其進一步包括通過所述器官的血管系統用幹細胞接種所述肺組織基質。
15.權利要求14的方法，其中所述幹細胞是骨髓衍生的間充質幹細胞或誘導的多能幹 (iPS)細胞。
16.權利要求14的方法，其中將所述幹細胞以每30cc流體約1億個細胞的濃度在流體中懸浮； 將所述內皮細胞以每IOcc流體約1億個細胞的濃度在流體中懸浮；並將所述表皮細胞以每5cc流體約1億個細胞的濃度在流體中懸浮。
17.權利要求13的方法，其進一步包括監測器官成熟的程度，直至已經發生所述第一期望程度的器官成熟，以生成溼式成熟器官；對所述器官停止所述溼式通氣； 對所述器官應用人工表面活化劑；並對所述器官開始所述乾式通氣。
18.權利要求12的方法，其中給所述肺組織基質提供溼式通氣包括 經由溼式通風器線連接所述氣道與溼式通風器；經由溼式通氣線連接所述器官與順應室；通過所述溼式通氣線提高溼式氣道壓力；並通過提高所述順應室對所述器官提供溼式呼氣末正壓(《PEEP)。
19.權利要求18的方法，其中以生理潮氣量提供所述溼式通氣。
20.權利要求12的方法，其中給所述溼式成熟器官提供乾式通氣包括 經由乾式通氣線連接所述氣道與乾式通氣室；通過乾式呼氣末正壓(dPEEP)線連接所述乾式通氣室與第一乾式通風器； 通過所述乾式通氣線提高幹式氣道壓力； 斷開所述溼式通氣線；並經由乾式通風器線連接所述器官與第二乾式通風器。
21.權利要求12的方法，其中所述肺組織基質包含去細胞化的人肺組織或人工肺基質。
22.權利要求12的方法，其中所述生物人工肺包含足以提供完整的肺功能或其一部分的細胞數目。
23.通過權利要求11-22的方法生成的生物人工肺。
24.權利要求23的生物人工肺，其中所述器官是完整的肺或其一部分。
25.一種治療具有受損的或降低的肺容量的受試者的方法，該方法包括將權利要求23 的生物人工肺移植入所述受試者中。
全文摘要
呈現了一種氣道器官生物反應器裝置及其使用方法，以及使用該方法生成的生物人工氣道器官及使用生物人工氣道器官治療受試者的方法。
文檔編號A61L27/38GK102459564SQ201080032724
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者H.C.奧特 申請人:通用醫療公司