豬瘟活疫苗的製備方法及其產品的製作方法
2023-05-15 07:15:21
專利名稱：豬瘟活疫苗的製備方法及其產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種獸用活疫苗的生產方法，尤其涉及一種豬瘟活疫苗的製備方法以及由該製備方法得到的產品，屬於豬瘟活疫苗的生產領域。
背景技術：
豬瘟(Hog ch0lera，HC)是由豬瘟病毒引起的一種高度接觸傳染性疾病，世界動物衛生組織(OIE)將其列入OIE疾病名錄，為法定必需報告的傳染病。在我國，豬瘟是重大疫病之一，在《一、二、三類動物疫病病種名錄》中將豬瘟列入一類17種動物疫病之一，豬瘟的爆發流行給世界和我國的養豬業造成嚴重經濟損失。疫苗是控制豬瘟的重要手段，包括滅活疫苗和弱毒疫苗。各國都在努力研究安全有效的疫苗。經過多年應用，公認安全有效，沒有殘餘致病力的弱毒疫苗株有三種①中國兔化弱毒疫苗；②日本GPE細胞弱毒疫苗；③法國「Thiveosal」冷變異弱毒株。其中中國學者研製成功的中國系(C系)豬瘟兔化弱毒疫苗，自1957年起，除在我國廣泛應用外，並已推廣到歐亞很多國家，使這些國家控制或消滅了豬瘟。該疫苗被公認為目前世界上比較理想的豬瘟疫苗。將豬瘟兔化弱毒接種於犢牛睪丸細胞製備而成的豬瘟細胞苗，具有生產成本低， 便於工廠化生產，不良反應少等優點，缺點是用牛睪丸細胞培養豬瘟兔化弱毒(HCLV)，毒價不穩定，批間差異很大，兔檢合格的產品，最高和最低毒價相差甚遠，且生產過程中使用牛睪丸、牛血清，有汙染牛病毒性腹瀉病毒的可能性，引起免疫失敗。疫苗效價的高低是疫苗合格與否的關鍵指標，HCLV在細胞中的增殖力較弱，不產生致細胞病變，對其效價的測定一直沿用兔體定型熱反應法(兔熱法)。但該法存在的突出不足是兔熱法測毒屬於一種非特異性反應，用其測毒不能準確定量，測毒結果易受兔體個體差異和天氣條件影響，試驗周期長、費時費力。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服豬瘟細胞苗的生產所存在的不足，提供一種新的豬瘟活疫苗的製備方法，該方法能夠快速、準確的測定疫苗效價，所製備的疫苗安全性好、免疫效力高，對豬瘟強毒攻擊具有完全的免疫保護作用。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種豬瘟活疫苗的製備方法，包括以下步驟(1)、將豬瘟活疫苗生產種毒接種豬源傳代細胞系，篩選得到豬瘟弱毒疫苗株；(2)、將豬瘟弱毒疫苗株進行病毒增殖；(3)、採用免疫螢光方法測定增殖病毒懸液的(TCID5tl)毒價J4)、向檢測合格後的病毒液中加入凍幹保護劑和抗生素進行配苗、冷凍乾燥，即得。本發明針對豬瘟細胞苗在生產中所存在的一系列問題，從經過如下幾個階段進行改進(1)、豬源傳代細胞系的篩選與鑑定將豬瘟兔化弱毒接種不同豬源傳代細胞系，至 37°C培養4 5日，收穫病毒，將收穫病毒傳代，應用免疫螢光方法對接種不同豬源傳代細胞系的各代次病毒進行檢測，檢測結果顯示豬瘟兔化弱毒可在PT細胞系、MPK細胞系、SK6 細胞系、PK 2a細胞系、CPK細胞系、RKC細胞系、MDBK細胞系、MDCK細胞系、CRFK細胞系、 Vero/slam細胞系、Vero_E6細胞系、Marc_145細胞系、BHK細胞系、BGM細胞系或DK細胞系上增殖。O)、毒種的製備將豬瘟兔化弱毒在PT細胞系上進行傳代，適應PT細胞系。應用有限稀釋法進行兩輪克隆純化，篩選到一株合適的豬源傳代細胞系的豬瘟弱毒疫苗株，其微生物保藏號是CGMCC No. 3891 ；分類命名是豬瘟病毒；保藏時間是2010年5月27日； 保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。(3)免疫螢光方法的建立應用抗CSFV 單克隆抗體建立免疫螢光方法，應用此方法進行病毒TCID5tl的測定。優選的，步驟(1)中將豬瘟活疫苗生產種毒以感染劑量(MOI)O. 1-0.5接種到PT 單層細胞系上進行培養，接種5日作第一次收穫換液，以後每隔4日收穫換液，收穫不超過 5次。步驟(3)中採用免疫螢光方法測定增殖病毒的(TCID5tl)毒價時，所採用的單克隆抗體優選為抗CSFV單克隆抗體(北京健翔和牧生物科技有限公司對外有售)，所採用的標記物優選為FITC或IPMA ；所用到的固定液優選為預冷的80%丙酮、10%甲醛或75%乙醇。 更優選的，所述的免疫螢光方法包括以下步驟(1)細胞傳代，準備細胞培養板選取生長良好的PT細胞，經胰酶-EDTA消化後， 加入細胞生長液製備細胞懸液，應用臺盼蘭稀釋計數，調整細胞密度為2. 5 3. 5 X IO5個/ ml,以IOOul/孔接入96孔細胞培養板；(2)疫苗毒樣品的稀釋將要滴定的豬瘟活疫苗病毒懸液作10倍倍比稀釋，注意在從上一個稀釋度移至下一個稀釋度時要更換吸頭，每次稀釋均要漩渦混勻；(3)病毒接種接入100 μ 1樣本，每個稀釋度6 8個重複。加入100 μ 1培養基作為陰性對照，每塊板至少設2列陰性對照。蓋上蓋子在37°C 士 1°C，4 6% CO2培養箱中培養3 5天；(4)免疫螢光檢測①傾去板子中的液體於強鹼性溶液中，用PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加 50 100 μ L預冷的固定液(80%丙酮或10%甲醛或75%乙醇)固定20min ；②直接免疫螢光PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加入工作濃度的FITC標記抗CSFV單克隆抗體50 μ L，置溼盒中37°C孵育30 45min，去除抗體，用PBST洗滌3次；③間接免疫螢光PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加入工作濃度的抗CSFV單克隆抗體50 μ L，置溼盒中37°C孵育45 60min，去除一抗，用PBST洗滌3次，每孔加入工作濃度的FITC標記抗鼠二抗(SIGMA) 50 μ L，閉光37°C孵育30 45min，去除二抗，用PBST 洗滌3次；④在螢光顯微鏡下觀察有無特異性螢光斑出現，記錄於試驗記錄紙上並應用 Spearman Karber方法計算病毒滴度；(5)結果有效的判定所有試驗中陰性孔螢光陰性；參考對照必須在正常的範圍內；如果樣本在最小稀釋度陽性孔低於50%或在最高稀釋度陽性孔高於50%，可報告結果低於或高於該滴度50%。本發明用細胞系替代牛睪丸原代細胞製造豬瘟活疫苗，可解決牛源外源病原汙染的問題，通過原材料和培養條件的嚴格控制，保證生產出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性。用細胞系生產豬瘟活疫苗各批間質量差異小，具有生產工藝簡單穩定、易操作、產量大、 成本低等特點，具備工業化大生產的可行性和可放大性。此外，本發明採用單克隆抗體的免疫方法檢測豬瘟細胞毒液病毒含量，檢測敏感，快速，特異，準確，重複性高，結果可靠。利用本發明生產並應用新型凍幹保護劑配製的豬瘟活疫苗凍幹後疫苗可在4°C保存。經生產，檢驗，保存的一系列改善，可以大大提高豬瘟活疫苗的免疫效力，經免疫攻毒試驗結果顯示， 本發明所製備的豬瘟活疫苗對豬瘟強毒攻擊可100%保護。
圖1豬瘟活疫苗免疫螢光檢測結果；A 陰性對照，B 疫苗檢測樣品。圖2免疫螢光檢測豬瘟活疫苗毒價的敏感性試驗結果。圖3免疫螢光檢測豬瘟活疫苗毒價的特異性試驗結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例1豬源傳代細胞系的篩選與鑑定將豬瘟兔化弱毒接種不同豬源傳代細胞系，至37°C培養4 5日，收穫病毒，將收穫病毒傳代，應用免疫螢光方法對接種不同豬源傳代細胞系的各代次病毒進行檢測，檢測結果顯示豬瘟兔化弱毒可在PT細胞系、MPK細胞系、SK6細胞系、PK 2a細胞系、CPK細胞系、RKC細胞系、MDBK細胞系、MDCK細胞系、CRFK細胞系、Vero/slam細胞系、Vero-E6細胞系、Marc-145細胞系、BHK細胞系、BGM細胞系或DK細胞系上增殖。本發明是用細胞系(PT、 MPK、SK6、PK 2a、CPK、RKC、MDBK, MDCK, CRFK, Vero/slam、Ver。_E6、Marc-145, BHK, BGM 或 DK)培養豬瘟兔化弱毒，收穫細胞病毒液，採用免疫螢光法測定增殖病毒懸液的毒價，向檢測合格後的病毒液中加入凍幹保護劑和抗生素進行配苗、冷凍乾燥，製成豬瘟傳代細胞苗。實施例2用細胞系生產豬瘟活疫苗的方法(1)制苗用細胞的傳代與培養PT細胞系經胰酶-EDTA細胞分散液消化傳代，一比五進行傳代。以細胞生長液於37°C繼續培養，形成良好單層時，用於繼續傳代或接種病毒；(2)細胞毒種的繁殖用細胞維持液，將新鮮脾毒製成0.3%的病毒懸液，接種生長良好的PT細胞系單層，置37°C繼續培養。隔5日收穫細胞培養毒液作為生產用毒種；細胞毒種鑑定細胞毒種鑑定完全符合豬瘟兔化弱毒株毒種標準，對豬安全無副作用，細胞毒種每Iml含病毒> 100，000個家兔感染量；(3)制苗毒液的繁殖取已形成良好單層的PT細胞系培養瓶，棄去營養液，接種含3%生產用細胞毒種(在轉瓶中培養，細胞密度達到5-10X107ml ；在生物反應器中添加附著載體的懸浮培養或無載體的懸浮培養，細胞密度達到5-10X107_8/ml ；固定化培養將上述細胞系與水不溶性載體(紙片、無紡聚酯纖維載片)結合進行培養，細胞密度達 5-10X107_8/ml)，置37°C繼續培養，接毒後第5日作第一次收穫換液，以後每隔4日收穫換液1次，收穫的毒液置_15°C以下保存；制苗毒液的檢驗按《中華人民共和國獸藥典》(2005 年版)附錄15、19頁進行檢驗，應無細菌、黴菌、支原體生長。細胞毒液對豬安全無副作用， 各收次病毒培養液分別用家兔測定，每Iml含病毒> 100，000個家兔感染量；上述所用營養液的配方是92% DMEM液、5-8%犢牛血清、加適量的抗菌素，pH值調整為7. 0。上述所用維持液的配方是95% DMEM液、3. 5_5%犢牛血清、加適量的抗菌素， PH值調整為7.2。試驗例1應用單克隆抗體的免疫螢光方法檢驗豬瘟活疫苗的病毒滴度1、細胞傳代，準備細胞培養板選取生長良好的PT細胞，經胰酶-EDTA消化後，加入細胞生長液製備細胞懸液，應用臺盼蘭稀釋計數，調整細胞密度為2. 5 3. 5X IO5個/ ml,以IOOul/孔接入96孔細胞培養板；2、疫苗毒樣品的稀釋將要滴定的豬瘟活疫苗病毒懸液作10倍倍比稀釋，注意在從上一個稀釋度移至下一個稀釋度時要更換吸頭，每次稀釋均要漩渦混勻；3、病毒接種接入IOOul病毒樣本，每個稀釋度6 8個重複。加入IOOu 1培養基作為陰性對照，每塊板至少設2列陰性對照。蓋上蓋子在37°C 士 1°C，4 6%0)2培養箱中培養3 5天；4、免疫螢光檢測①傾去板子中的液體於強鹼性溶液中，用PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加 50 100 μ L預冷的固定液(80%丙酮或10%甲醛或75%乙醇)固定20min ；②直接免疫螢光PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加入工作濃度的FITC標記抗CSFV單克隆抗體50 μ L，置溼盒中37°C孵育30 45min，去除抗體，用PBST洗滌3次；③間接免疫螢光PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加入工作濃度的抗CSFV單克隆抗體50 μ L，置溼盒中37°C孵育45 60min，去除一抗，用PBST洗滌3次，每孔加入工作濃度的FITC標記抗鼠二抗(SIGMA) 50 μ L，閉光37°C孵育30 45min，去除二抗，用PBST 洗滌3次；④在螢光顯微鏡下觀察有無特異性螢光斑出現，記錄於試驗記錄紙上並應用 Spearman Karber方法計算病毒滴度；(5)結果有效的判定所有試驗中陰性孔螢光陰性；參考對照必須在正常的範圍內；如果樣本在最小稀釋度陽性孔低於50%或在最高稀釋度陽性孔高於50%，可報告結果低於或高於該滴度50%。試驗例2豬瘟病毒培養條件的優化試驗1 方法1. 1接毒方式研究1. 1. 1同步接種選用生長良好的PT細胞2轉瓶消化，按1 3進行傳代，其中1瓶作為陰性對照，2瓶傳代後以MOI值0. 1接種病毒，置37°C轉瓶機內進行培養，接種5日後收穫病毒液，凍融2次，測定病毒含量(TCID5tl)。1. 1. 2單層接種1. 1. 1消化傳代的細胞中，2瓶待細胞長滿單層後以Μ0Ι0. 1接種豬瘟病毒，加入維持液，置37°C轉瓶機內進行培養，接種5日後收穫病毒液，凍融2次，測定病毒含量(TCID5tl)。1. 2M0I 研究
選用生長良好的PT細胞，按MOI值0. 01，0. 05，0. 1,0. 3和0. 5接入病毒液，每個
MOI值接種2個轉瓶，同時設一個轉瓶為陰性對照。接種5日後收穫病毒液，凍融2次，測定病毒含量(TCID5tl)。1. 3病毒收穫時間，收穫次數的研究 選生長良好的PT細胞，按MOI值0. 1加入豬瘟病毒液，分別在接毒後第1日，2日， 3日，4日，5日取上清樣品，測定病毒含量(TCID5tl),在接毒後5日作第一次收穫換液，以後每隔4日收穫換液一次，於每個收次每天取上清樣品，測定病毒含量(TCID5tl),收穫不超過5 個收次。2試驗結果2. 1接毒方式研究結果表明，單層接毒方式豬瘟病毒滴度高於同步接毒方式，詳見表1。表1同步與單層接種比較結果
權利要求
1.一種豬瘟活疫苗的製備方法，包括以下步驟(1)、培養豬源傳代細胞系；( 、將豬瘟活疫苗生產種毒接種培養好的豬源傳代細胞系，篩選得到豬瘟弱毒疫苗株；(3)、將豬瘟弱毒疫苗株進行病毒增殖；⑷、採用免疫螢光方法測定增殖病毒懸液的毒價；(5)、向檢測合格後的病毒液中加入凍幹保護劑和抗生素進行配苗、冷凍乾燥，即得。
2.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)所述的豬源傳代細胞系的培養方式為單層貼壁培養、懸浮培養或固定化培養。
3.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述的豬源傳代細胞系包括但不限於PT細胞系、MPK細胞系、SK6細胞系、PK 2a細胞系、CPK細胞系、RKC細胞系、 MDBK細胞系、MDCK細胞系、CRFK細胞系、Vero/slam細胞系、Vero-E6細胞系、Marc_145細胞系、BHK細胞系、BGM細胞系或DK細胞系。
4.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟O)中所述豬瘟弱毒疫苗株的微生物保藏號是CGMCC No. 3891。
5.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟O)中將豬瘟活疫苗生產種毒以感染劑量0. 1-0. 5接種到培養好的豬源傳代細胞系上進行培養。
6.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟O)中將豬瘟活疫苗生產種毒以感染劑量0. 1-0. 5接種到培養好的豬源傳代細胞系上進行培養，接種5日作第一次收穫換液，以後每隔4日收穫換液，收穫不超過5次。
7.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟中採用免疫螢光方法測定增殖病毒的毒價時，所採用的單克隆抗體為抗豬瘟病毒單克隆抗體；所採用的螢光標記物為FITC或IPMA ；所用到的固定液為預冷的80%丙酮、10%甲醛或75%乙醇。
8.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟中採用免疫螢光方法測定增殖病毒的毒價時，其步驟包括(1)細胞傳代，準備細胞培養板選取生長良好的豬源傳代細胞系，經胰酶-EDTA消化後，加入細胞生長液製備細胞懸液，應用臺盼蘭稀釋計數，調整細胞密度為2. 5 3. 5 X IO5個/ml，以IOOul/孔接入96孔細胞培養板；(2)疫苗毒樣品的稀釋將要滴定的豬瘟活疫苗病毒懸液作10倍倍比稀釋；( 病毒接種接入100 μ 1樣本， 每個稀釋度6 8個重複；加入100 μ 1培養基作為陰性對照，每塊板至少設2列陰性對照； 蓋上蓋子在37°C 士 1°C，4 6% (X)2培養箱中培養3 5天；(4)免疫螢光檢測①傾去板子中的液體於強鹼性溶液中，用PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加50 100 μ L預冷的固定液固定20min ；②直接免疫螢光PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加入工作濃度的 FITC標記CSFV單克隆抗體50 μ L，置溼盒中37°C孵育30 45min，去除抗體，用PBST洗滌 3次；③間接免疫螢光PBST洗滌2次，拍幹殘餘液體，每孔加入工作濃度的CSFV單克隆抗體50 μ L，置溼盒中37°C孵育45 60min，去除一抗，用PBST洗滌3次，每孔加入工作濃度的FITC標記抗鼠二抗50 μ L，閉光37°C孵育30 45min，去除二抗，用PBST洗滌3次；④在螢光顯微鏡下觀察有無特異性螢光斑出現，記錄於試驗記錄紙上並應用Spearman Karber 方法計算病毒滴度；(5)結果有效的判定所有試驗中陰性孔螢光陰性；參考對照必須在正常的範圍內；如果樣本在最小稀釋度陽性孔低於50%或在最高稀釋度陽性孔高於50%，報告結果低於或高於該滴度50%。
9.由權利要求1-8任何一項製備方法得到的豬瘟活疫苗。
10.權利要求9所述的豬瘟活疫苗在製備預防或治療豬瘟生物製品中的用途。
全文摘要
本發明公開了豬瘟活疫苗的製備方法及其產品，其製備方法包括(1)培養豬源傳代細胞系；(2)將豬瘟活疫苗生產種毒接種豬源傳代細胞系，得到豬瘟弱毒疫苗株；(3)將豬瘟弱毒疫苗株進行病毒增殖；(4)採用免疫螢光方法測定增殖病毒懸液的毒價；(5)向檢測合格後的病毒液中加入凍幹保護劑和抗生素進行配苗、冷凍乾燥。本發明用細胞系生產豬瘟活疫苗，各批間質量差異小，具有工藝簡單穩定、易操作、產量大、成本低等特點，具備工業化大生產的可行性和可放大性。此外，本發明採用免疫螢光方法測定增殖病毒懸液的毒價，檢測敏感，快速，特異，準確，重複性高，結果可靠。本發明所製備豬瘟活疫苗對豬瘟強毒攻擊可100％保護。
文檔編號C12N7/08GK102294029SQ201010536418
公開日2011年12月28日 申請日期2010年11月9日 優先權日2010年6月28日
發明者夏銘崎, 張淑琴, 武華 申請人:北京華威特生物科技有限公司