一種新的彎曲芽孢桿菌lf－3及其應用的製作方法

2023-05-15 08:19:36

專利名稱：一種新的彎曲芽孢桿菌lf－3及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物毒素生物降解技術領域，具體涉及TMPD降解菌，還涉及該TMPD降解菌在降解冰川棘豆主要毒素TMPD中的應用。
背景技術：
瘋草(Locoweed)是豆科黃芪屬和棘豆屬有毒植物的總稱，也是世界範圍內危害草原畜牧業最嚴重的一類毒草。在我國，瘋草廣泛分布於西北、華北和西南的廣大草原，危害面積達1100萬hm2。近年來，國內外在瘋草的危害、有毒成分、毒理機制、防除和利用等方面的研究取得了重要進展，但迄今還沒有控制瘋草蔓延的特效方法，致使瘋草中毒問題日趨嚴重，成為草原畜牧業的大患。
冰川棘豆(Oxytropis.glacialis)是瘋草的一種，也是青藏高原特有草種之一，主要分布在西藏阿里地區，遍及措勤，改則，革吉，日土，喀爾，普蘭等縣。它具有很強的抗逆性，在荒漠中生長旺盛，蔓延速度明顯高於當地的其它植物，容易形成優勢群落。它可以引起多種動物發生慢性中毒，使其出現以中樞神經系統功能紊亂為特徵的中毒症狀(楊小平.動物棘豆屬瘋草中毒的臨床症狀.武漢科技學院學報，2002，15(3)25-28；席琳喬，馬麗萍.草地毒草棘豆的研究現狀及進展.草原與草坪，2003，(3)19-22)，嚴重的發生死亡。據1996年調查統計，措勤縣11個鄉實際放牧草場面積9.30萬hm2，冰川棘豆危害嚴重的有5.40萬hm2，1978～1993年的15年中因中毒導致牲畜死亡達25萬頭(只)，直接經濟損失約2205萬元，年均死亡約1.7萬頭(只)，每年經濟損失150～250萬元；改則縣有166.67萬hm2草地冰川棘豆危害比較嚴重，1987～1995年牲畜中毒死亡21.28萬頭(只)，直接經濟損失達2562萬元，9年中，年均中毒死亡牲畜約2.4萬頭(只)，經濟損失達350多萬元；革吉縣冰川棘豆蔓延較重的草場48.87萬hm2，每年中毒死亡牲畜7500頭(只)以上，經濟損失120～150萬元。到1995年為止，阿里東部三個牧業縣因冰川棘豆中毒死亡的牲畜總數在53萬頭以上，損失超過6172萬元(李勤凡，王建華.冰川棘豆生長的生態環境特點.家畜生態，2004，25(1)42-44；王建華，張志恆，高巨星.西藏阿里地區動物「醉馬草」中毒病調查報告.動物毒物學，1998，13(1-2)22-27；張志恆，高巨星，沈頌東，關於對西藏阿里地區「醉馬草」調查情況的報告.動物毒物學，1998，13(1-2)11-13)；此外，採食冰川棘豆中毒未致死的牲畜，其性能和品質顯著下降，不能騎乘或馱運，皮毛質量低劣，體重下降，奶肉減產、繁殖能力減弱，出現畸胎、流產和死胎等，其損失超過雪災或疫災。而且冰川棘豆耐乾旱、抗寒冷，與優良牧草競爭草地，導致大批優良牧草產量降低和草場退化。在牲畜冰川棘豆中毒經常發生的地區，牧民不敢放牧，致使這些草場得不到充分利用(吳達，司紅麗，王建華.瘋草研究現狀.草業科學，2003，20(2)43-47)。由此可見，冰川棘豆對西藏南部地區家畜的危害非常嚴重，給西藏畜牧業帶來很大損失。
目前國內外對冰川棘豆的防除主要採取人工挖除、化學滅除和生物防除的方法。冰川棘豆雖是毒草，但其屬於豆科植物，營養全面，如能合理利用，變廢為寶，將會取得很好的經濟效益，這方面國內外學者已經進行了許多有益的探索，主要包括合理輪牧、間歇飼餵和日糧搭配、脫毒利用等方法。其中，在有毒植物的脫毒方面，其方法有物理脫毒、化學脫毒、免疫預防及微生物降解等。近年來，應用微生物降解有毒物質一直是國內外研究的熱點，但在微生物降解植物毒素方面的研究較少，不過也取得了一定的成果，周斌從菜籽餅中分離到能夠降解芥子甙的多種微生物70多株，經鑑定這些菌是白色球擬酵母(Torulopsis candida)、華根黴(Rhizopus chinensis)、總狀毛黴(Mucor racemosus)、米麴黴(Aspergillus oryzae)，通過發酵試驗確定其脫毒率為80％(周斌，分離篩選脫菜籽餅中芥子甙毒素菌株的研究，雲南大學學報，1996，18(2)122-125)。譚蓓英等從廣西潿洲島的黃牛瘤胃中，分離出4株厭氧細菌，經鑑定為乳桿菌屬(Lactobacillus)(2株)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)和生孢梭菌(Clostridium sporogenes)，上述菌株對含羞草素和二羥基吡啶類毒素具有降解活性，這些脫毒菌生活在瘤胃中，可以保護宿主動物免受銀合歡的毒害(譚蓓英，王旭明，汪儆，降解有毒的含羞草素和二羥基吡啶化合物的瘤胃細菌.微生物學報，1994，34(5)379-384)，其研究方法可用於冰川棘豆研究，以求徹底解決冰川棘豆的毒害問題，使動物利用冰川棘豆的豐富營養而不中毒。
2，2，6，6-四甲基哌啶酮(2，2，6，6-tetramethyl-4-piperidone，TMPD)是從冰川棘豆地上部分提取、分離出來的一種主要毒性生物鹼(譚遠友，王建華，李勤凡等，西藏阿里地區冰川棘豆毒性生物鹼的鑑定，畜牧與獸醫，2002，34(5)12-13)。目前，尚無有效方法使冰川棘豆中的TMPD毒性降低。如能應用微生物降解TMPD，將對徹底解決冰川棘豆的毒害，為草原毒草的生物學控制和草原生態學研究起到積極作用。

發明內容
針對上述現有技術中存在的問題與缺陷，本發明目的在於提供一種新的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)，該菌能夠有效的降解，2，6，6-四甲基哌啶酮(簡稱TMPD)的毒性，徹底解決冰川棘豆的毒害，為草原毒草的生物學控制和草原生態學研究起到積極作用。
為實現上述目的，本發明的技術方案如下一種新的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3，簡稱CCTCC，其保藏編號為CCTCC NOM 206128。
彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3，已於2006年11月19日保藏於中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，其保藏編號為CCTCC NOM 206128。
本發明還有一目的是彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在降解植物毒素中的應用。
本發明還有一目的是彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的應用。
本發明還有一目的是彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在製備降解植物毒素藥物中的應用。
本發明還有一目的是彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在製備降解植物毒索2，2，6，6-四甲基哌啶酮藥物中的應用。
該TMPD降解菌均來自於西藏、內蒙、青海等地瘋草生長的環境土壤中，經人工分離、篩選而得，見後邊的具體實施例。
以下是本發明彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3的特徵描述。
1、形態學特徵LF-3菌株的菌體呈杆狀，1.0～1.2μm×1.5～5.0μm，其在透射電鏡下的形態見圖1，其在掃描電鏡下的形態見圖2，革蘭氏染色陰性，無莢膜，有芽孢，芽孢橢圓形或柱形，中生或偏中生，孢囊不膨大，有運動性；菌落呈菌絲體狀，直徑為0.5cm～4cm，表面不光滑，乾燥，平升狀，表面有同心圓，邊緣不整齊，呈鋸齒狀，灰白色，半透明；葡萄糖發酵產少量酸，厭氧條件下不生長，不產生吲哚，M.R試驗陰性，V.P試驗陰性，水解澱粉，不還原硝酸鹽，不能利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，不產生H2S，液化明膠，接觸酶陽性，氧化酶陰性，尿素酶陰性，在5％NaCl和7％NaCl中生長，50℃時不生長。
2、生理生化特徵，具體生理生化特徵見表1。
表1.LF-3菌株的生理生化特徵


注「+」表示生長或反應陽性；「-」表示不生長或反應陰性。
3、16S rDNA序列同源性分析取LF-3菌株單菌落接種於10mlLB液體培養基中，37℃過夜振蕩培養後取1.5ml菌液離心去上清，按照U-Gene公司的細菌基因組DNA提取試劑盒中所示的提取方法製備PCR模板DNA，-20℃保存備用。
用於16S rDNA的PCR反應的引物為一對通用引物。正向引物BSF8/205′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′；反向引物BSR1541/205′-AAGGAGGTGA TCCAG CCGCA-3′。
PCR反應體系(50μL)為Taqmix25μL，引物BSF8/20(10μmol/L)2μL，引物BSR1541/20(10μmol/L)2μL，模板DNA1μL，重蒸水20μL。PCR反應條件為94℃預變性2min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，循環29次；72℃10min。經1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統下顯示的圖像如圖3所示，M1為D12000，LF-3為PCR產物，M2為200bp Ladder。PCR產物用U-Gene公司的凝膠回收試劑盒回收純化。測序由上海博亞生物技術有限責任公司完成，測序用引物為引物BSF8/20。
LF-3菌株16SrDNA的GenBank登錄號為EF127831，16SrDNA序列如序列表所示。
將LF-3菌株的16S rDNA序列通過NCBI的Blast檢索系統進行序列同源性分析，利用DNAStar軟體構建系統進化樹，見圖4。由圖4得出，LF-3菌株的遺傳進化距離與芽孢桿菌屬最近，它與彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)同處於一個最小的分支，與已知菌株Bacillus flexus(DQ837542)的同源性達到99.80％，說明該菌在分子系統發育分類學上屬於彎曲芽孢桿菌。經16S rDNA序列同源性分析，依據同源性在系統發育中的分類原則並結合形態、生理生化特徵，參考《伯傑細菌學手冊(第八版)》，最終確定LF-3菌株為彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)，該菌能以TMPD為惟一碳源，可降解TMPD。
所述的LB液體培養基的組分及配比為蛋白腖10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，蒸餾水1L，pH為7.0～7.2，121℃高壓滅菌15min。
本發明的TMPD降解菌可降解冰川棘豆的主要毒素TMPD，為徹底解決冰川棘豆的毒害奠定基礎。


圖1是LF-3菌株的透射電鏡照片；圖2是LF-3菌株的掃描電鏡照片；圖3是LF-3菌株的1％瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4是利用DNAStar軟體構建系統進化樹；圖5是不同培養時間TMPD降解率曲線。
具體實施例方式
下面結合附圖和發明人給出彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3的分離、篩選辦法及其彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在降解TMPD試驗來進一步說明本發明的有益效果。
實施例1彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3的分離、篩選方法1、土樣採自西藏、內蒙、青海等地瘋草生長的環境土壤；2、菌株的分離篩選分別取20g～30g瘋草生長環境中的4個來源的土壤接種於普通肉湯，37℃擴菌培養48h後在普通瓊脂上進行劃線接種，37℃培養24h，挑出單個菌落接種於含50mg/L TMPD的普通肉湯中，37℃培養48h，保存菌種；將上一步保存下來的菌種接種於含100mg/L TMPD的普通肉湯中，置37℃培養48h；重複以上過程，每次培養均增加TMPD含量，降低培養液中有機營養成分的含量，保存菌種。經5次培養，當培養基中TMPD含量增加到300mg/L時，4℃保存菌種備用；將上述保存的菌種接種於普通肉湯中，37℃培養48h進行活化和擴菌，7500r/min離心15min，棄去上清液，沉澱的菌體用滅菌磷酸鹽緩衝液衝洗3次，最後用滅菌磷酸鹽緩衝液製成20mL的菌懸液，分別接種於含150mg/L TMPD培養基和無營養培養基上，37℃培養48h後，挑出TMPD培養基上生長良好的菌株，再劃線分別接種於TMPD培養基和無營養培養基，重複培養，挑純，得到一株降解菌，命名為LF-3菌株。
所述的普通肉湯培養基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白腖10g，NaCl5g，KH2PO41g，蒸餾水1L，pH為7.4～7.6，121℃高壓滅菌20min。
所述的普通瓊脂培養基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白腖10g，NaCl5g，KH2PO41.0g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH 7.4～7.6，121℃高壓滅菌20min。
所述的無營養培養基的組分及配比為NaCl 1.0g，K2HPO41.0g，NH4Cl1.0g，MgSO4·7H2O 0.4g，FeCl30.01g，瓊脂20g，溶於1000mL雙蒸水中，pH為7.2～7.4，121℃滅菌30min。
所述的TMPD培養基根據不同需要，向無營養培養基中加入TMPD，調節pH 7.2～7.4，121℃滅菌30min。
試驗例1彎曲芽孢桿菌LF-3降解TMPD的效果試驗採用紫外一可見分光光度計法測定該菌對TMPD的降解率。將該降解菌分別接種於普通肉湯中，37℃培養48h進行活化和擴菌，7500r/min離心15min，棄去上清液，沉澱的菌體用滅菌磷酸鹽緩衝液衝洗3次，最後用滅菌磷酸鹽緩衝液製成20mL的菌懸液，分別接種於含150mg/L TMPD培養液中，每隔3天測定培養液的吸光度，測定結果帶入回歸曲線，計算其濃度。具體TMPD的降解率見表2。從表2可以看出，經30天培養，LF-3菌株的TMPD降解率為68.20％。不同培養時間TMPD降解率曲線見圖5，從圖5可以看出各菌種在接種後15d內降解速度最快，培養18d後，降解速度降低，說明三株降解菌接種TMPD培養液培養15天後，TMPD能被很好的降解。
表2.不同培養時間TMPD的降解率(％)

序列表110西北農林科技大學120一種新的彎曲芽孢桿菌LF-3及其應用160121012111484212DNA213彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)4001gggatggggg gcatgctata catgcaagtc gagcgaactg attagaagct tgcttctatg 60acgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggcaacctg cctgtaagac tgggataact 120ccgggaaacc ggagctaata ccggataaca ttttctcttg cataagagaa aattgaaaga 180tggtttcggc tatcacttac agatgggccc gcggtgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240gctcaccaag gcaacgatgc atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag 420ggaagaacaa gtacaagagt aactgcttgt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt 540gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg 600tggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga gaaaagcgga attccacgtg 660tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcggc tttttggtct 720gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac ctggtagtgc 780acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgcagctaa 840cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960aggtcttgac atcctctgac aactctagag atagagcgtt ccccttcggg ggacagagtg 1020acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca tttagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200acacacgtgc tacaatggat ggtacaaagg gctgcaagac cgcgaggtca agccaatccc 1260ataaaaccat tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc 1320tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taacctttat ggagccagcc 1440gcctaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgtaacaa cagc148權利要求
1.彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3，簡稱CCTCC NOM206128。
2.如權利要求1所述的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在降解植物毒素中的應用。
3.如權利要求1所述的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的應用。
4.如權利要求1所述的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在製備降解植物毒素藥物中的應用。
5.如權利要求1所述的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF-3在製備降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種新的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF－3，於2006年11月19日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏號分別為CCTCC M206128；該彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)LF－3能有效的降解植物毒素，特別是從冰川棘豆地上部分提取、分離出來的生物鹼2，2，6，6－四甲基哌啶酮(簡稱TMPD)的毒性，對徹底解決冰川棘豆的毒害，為草原毒草的生物學控制和草原生態學研究起到積極作用。
文檔編號C12R1/07GK101067122SQ200710017250
公開日2007年11月7日 申請日期2007年1月18日 優先權日2007年1月18日
發明者王建華, 李勤凡, 王嵐峰, 耿果霞 申請人:西北農林科技大學