一種提高肺癌幹細胞富集效率的細胞培養容器的製作方法

2023-05-15 04:50:51 1

本實用新型屬於幹細胞領域，具體涉及一種提高肺癌幹細胞富集效率的細胞培養容器。
背景技術：
：肺癌是目前對人類的健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一。迄今為止，現有的肺癌治療方法僅可延長患者的生存期，改善其生活質量，幾乎所有的患者最終仍死於原發病。近年來有學者提出，在腫瘤組織中存在極小一部分具備無限增殖潛能和自我更新能力的幹細胞群體，對腫瘤的發生、發展起著至關重要的作用，針對這部分細胞的靶向治療將會給腫瘤治療帶來深遠影響。但由於腫瘤幹細胞(cancerstemcells,CSCs)在腫瘤組織中的含量極少，這成為制約CSCs研究發展的主要障礙。因此，建立一種高效的富集CSCs方法，對後續實驗研究的順利進行非常必要，也是目前CSCs領域研究的重要課題之一。當前肺癌幹細胞研究的焦點是分離和鑑定肺癌幹細胞，一般採用流式細胞儀分選可能的肺癌細胞亞群，再進行生物學鑑定，以證明其幹細胞特性。但由於缺乏特異性的幹細胞篩選的分子標誌，篩選結果爭議較大。腫瘤幹細胞標誌物是一些在腫瘤幹細胞中特異性高表達(陽性表達)、不表達或低表達(陰性表達)的分子。國外一些學者通過研究報導，CD133(+)/nestin(+)可能為肺癌幹細胞的標記物。研究過程中，可以按照腫瘤幹細胞具有能在無血清懸浮培養條件下富集的特性，採用添加生長因子的無血清培養基對肺癌細胞進行懸浮培養，獲得肺癌細胞球體，然後對分離到的肺癌細胞球體進行生物學功能鑑定。目前，在實際的動物細胞培養過程中，血清是最為常用和基本的添加物。無血清培養基則可以在不添加血清的條件下即為細胞的體外生長和繁殖提供良好的條件。從原代腫瘤中獲取腫瘤細胞，在含有適當生長因子(如鹼性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子等)的無血清培養基中培養，非腫瘤幹細胞由於「血清飢餓」，將無法正常存活，但腫瘤幹細胞卻可以存活並繁殖，由此腫瘤細胞將得到純化並維持幹細胞狀態，其得率也將提高，更好進行各項研究。無血清培養具有實用、簡單、快捷等諸多優點，可快速獲得足夠數量的幹細胞。以陳平等人的研究為例(肺癌幹細胞富集及相關標誌物的表達，中國組織工程研究第19卷第14期)，使用含有表皮細胞生長因子、胰島素樣生長因子1以及鹼性成纖維細胞生長因子的無血清培養基對SPCA-1肺癌細胞誘導培養5-10d可獲得懸浮生長細胞球體。RT-PCR檢測肺球體細胞，除表達肺癌幹細胞標誌CD24和CD221外，還表達細支氣管肺泡幹細胞標誌CCSP和SP-C，此外，肺球體細胞表達胚胎幹細胞的主幹基因OCT4、Nanog、Bmi-1和肺幹細胞的主幹基因TTF-1。上述方法確實可以有效獲得肺癌幹細胞，但是培養過程較為繁瑣且誘導效率較低，需要培養5-10d才可獲得懸浮生長細胞球體，且在球體形成之前每隔2d就需要添加一次生長因子。技術實現要素：本實用新型的目的在於提供一種提高肺癌幹細胞富集效率的細胞培養容器，以高效、快捷獲取懸浮生長細胞球體及肺癌幹細胞，提高科研效率。上述目的是通過如下技術方案實現的：一種提高肺癌幹細胞富集效率的培養容器，包括培養容器主體，培養容器主體內壁還設有包被層，包被層為γ聚穀氨酸材質。優選地，所述γ聚穀氨酸分子量為70萬克/摩爾。優選地，所述培養容器為培養瓶。更優選地，培養瓶規格為25cm2、75cm2、175cm2。優選地，所述培養容器為培養皿。更優選地，培養皿規格為35mm、60mm、100mm。優選地，所述培養容器為培養板。更優選地，培養板規格為6孔、12孔、24孔。一種製備上述培養容器的方法，包括如下步驟：步驟S1，將無菌γ聚穀氨酸溶於無菌水中，製成濃度為0.1-0.2mg/mL的γ聚穀氨酸溶液，用0.22μm濾膜過濾，備用；步驟S2，取上述γ聚穀氨酸溶液加入培養容器中，充分搖勻使其均勻鋪滿於整個細胞培養容器的底部，放入37℃培養箱中靜置4-6小時；步驟S3，從培養箱中取出培養器皿，用無菌水清洗2-3次，置於37℃培養箱備用。本實用新型的有益效果：本實用新型提供的含有γ聚穀氨酸包被層的培養容器可以顯著提高懸浮生長細胞球體的形成效率，24小時內即可形成理想的懸浮生長細胞球體，且肺癌幹細胞在該懸浮生長細胞球體中高度富集，比現有的無血清培養基加細胞生長因子法效率更高，更便捷。附圖說明圖1為本實用新型培養瓶結構示意圖，圖中1為γ聚穀氨酸包被層；圖2為本實用新型培養皿結構示意圖，圖中1為γ聚穀氨酸包被層；圖3為本實用新型培養板結構示意圖，圖中1為γ聚穀氨酸包被層。具體實施方式下面結合具體實施例和附圖詳細介紹本實用新型的技術方案和技術效果。未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如教科書和實驗指南中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件，為本領域普通技術人員熟知或易於獲知。實施例1本實用新型培養瓶的製備取市售T-75培養瓶(國產科晶培養瓶，產品編號191-203118，透氣濾膜蓋，斜口，螺口，滅菌；T-75指平放時可用細胞培養面積為75cm2，此為本領域技術人員公知常識)備用，在此基礎上實驗室自製本實用新型提供的培養瓶，具體步驟如下：步驟S1，將γ聚穀氨酸(採用γ射線鈷60照射滅菌，分子量70萬克/摩爾)溶於無菌水中，製成濃度為0.15mg/mL的γ聚穀氨酸溶液，用0.22μm濾膜過濾，備用；步驟S2，取γ聚穀氨酸溶液15mL加入上述T-75培養瓶中(溶液高度約0.2cm)，充分搖勻使其均勻鋪滿於整個細胞培養瓶的底部，放入37℃培養箱中靜置5小時；步驟S3，從培養箱中取出培養瓶，用無菌水清洗培養瓶底部2-3次，置37℃培養箱備用。顯微鏡觀察顯示，細胞培養瓶底部形成均勻的γ聚穀氨酸包被層，包被層厚度約0.4mm。結構示意圖如圖1所示。還可以採用市售的T-25培養瓶、T-175培養瓶製成可用細胞培養面積分別為25cm2、175cm2的本實用新型培養瓶，製備時分別添加0.15mg/mL的γ聚穀氨酸溶液5mL、35mL，包被層厚度約0.4mm。當然，為了提高科研人員的工作效率，可以製備成預包被培養瓶成品銷售給科研人員。實施例2本實用新型培養皿的製備取市售規格60mm細胞培養皿(上海翼飛生物科技，滅菌；細胞生長面積21cm2，高度為15mm，此為本領域技術人員公知常識)備用，在此基礎上實驗室自製本實用新型提供的細胞培養皿，具體步驟如下：步驟S1，將γ聚穀氨酸(採用γ射線鈷60照射滅菌)溶於無菌水中，製成濃度為0.15mg/mL的γ聚穀氨酸溶液，用0.22μm濾膜過濾，備用；步驟S2，取γ聚穀氨酸溶液5mL加入上述60mm細胞培養皿(溶液高度約0.24cm)，充分搖勻使其均勻鋪滿於整個細胞培養皿的底部，放入37℃培養箱中靜置5小時；步驟S3，從培養箱中取出培養皿，用無菌水清洗培養皿底部2-3次，置37℃培養箱備用。顯微鏡觀察顯示，細胞培養皿底部形成均勻的γ聚穀氨酸包被層，包被層厚度約0.48mm。結構示意圖如圖2所示。還可以採用市售的35mm培養皿(高度10mm，細胞生長面積8cm2)、100mm培養皿(高度20mm，細胞生長面積55cm2)製成本實用新型培養皿，分別添加0.15mg/mL的γ聚穀氨酸溶液3mL、10mL，包被層厚度分別約為0.75mm、0.36mm。當然，為了提高科研人員的工作效率，可以製備成預包被培養皿成品銷售給科研人員。實施例3本實用新型培養板的製備取市售6孔板(國產邁博瑞，滅菌；單孔面積9.5cm2，單孔體積16.5mL，此為本領域技術人員公知常識)備用，在此基礎上實驗室自製本實用新型提供的細胞培養皿，具體步驟如下：步驟S1，將γ聚穀氨酸(採用γ射線鈷60照射滅菌)溶於無菌水中，製成濃度為0.15mg/mL的γ聚穀氨酸溶液，用0.22μm濾膜過濾，備用；步驟S2，取γ聚穀氨酸溶液2.5mL加入上述6孔板(溶液高度約0.26cm)，充分搖勻使其均勻鋪滿於整個細胞培養孔的底部，放入37℃培養箱中靜置5小時；步驟S3，從培養箱中取出培養板，用無菌水清洗培養孔底部2-3次，置37℃培養箱備用。顯微鏡觀察顯示，細胞培養孔底部形成均勻的γ聚穀氨酸包被層，包被層厚度約0.52mm。結構示意圖如圖3所示。還可以採用市售的12孔板(單孔面積3.9cm2，單孔體積6.5mL)、24孔板(單孔面積1.75cm2，單孔體積2.9mL)製成本實用新型培養板，分別添加0.15mg/mL的γ聚穀氨酸溶液2mL、1mL，包被層厚度分別約為1mm、1.1mm。當然，為了提高科研人員的工作效率，可以製備成預包被培養板成品銷售給科研人員。實施例4不同培養容器對肺癌幹細胞成球的影響一、實驗材料細胞株：人肺癌細胞株SPCA-1為本公司長期凍存，復甦後置於DMEM培養液(含體積分數為10％胎牛血清)中進行傳代培養，得到活躍增殖期細胞備用。包被培養皿：按實施例2方法製備，規格60mm。常規培養皿A：直接採用實施例2中市售培養皿，規格60mm，無γ聚穀氨酸包被層。常規培養皿B：超低吸附培養皿，上海昨非實驗室設備有限公司，規格60mm，無包被。無血清DF12培養液購於昆明中雲美生物技術有限公司。其他儀器和試劑均為本領域技術易於獲得的常規儀器和試劑。二、實驗方法1、球體培養和分離包被培養皿：將活躍增殖期肺癌細胞置於無血清DF12培養液中，調整細胞濃度為2×107/L，取5mL細胞培養於包被培養皿中，常規條件培養至球體形成為止。收集細胞，離心(100×g)後留取球體細胞沉澱備用，對球體細胞進行免疫螢光檢測。常規培養皿A：將活躍增殖期肺癌細胞置於無血清DF12培養液中，調整細胞濃度為2×107/L，取5mL細胞培養於常規培養皿A中，常規條件培養至球體形成為止。收集細胞，離心(100×g)後留取球體細胞沉澱備用，對球體細胞進行免疫螢光檢測。常規培養皿B：將活躍增殖期肺癌細胞置於無血清DF12培養液中，調整細胞濃度為2×107/L，取5mL細胞培養於常規培養皿B中，分別加入20μg/L不同的細胞生長因子，包括重組人成纖維細胞生長因子10、重組人表皮細胞生長因子以及重組人胰島素樣生長因子1，每隔2d添加1次上述3種因子，常規條件培養至球體形成為止。收集細胞，離心(100×g)後留取球體細胞沉澱備用，對球體細胞進行免疫螢光檢測。2、免疫螢光檢測細胞濃度調整至1×109/L，取200μL滴於蓋玻片培養過夜，用40g/L多聚甲醛進行固定，利用非離子型表面活性劑0.1％TritonX-100增加細胞膜通透性，然後進行染色；一抗為OCT4特異性抗羊多克隆IgG，稀釋濃度為1:50，置於4℃溼盒中反應過夜，經PBS淋洗去除非結合的抗體，然後用異硫氰酸螢光素標記的驢抗羊多克隆IgG於室溫中反應2h，再次PBS淋洗，DAPI染核，封固，置於螢光顯微鏡下進行觀察。三、實驗結果1、細胞球體形成速度現有技術多採用常規培養皿B的富集方法，無血清培養基加細胞生長因子誘導，一般5-10天可收穫懸浮生長細胞球體。本實施例三組富集方法形成懸浮生長細胞球體時間如下表：包被培養皿常規培養皿A常規培養皿B時間22小時14天8天與常規培養皿A相比，常規培養皿B培養液中含有細胞生長因子，證明細胞生長因子確實可以誘導懸浮生長細胞球體形成；與常規培養皿A相比，包被培養皿於培養皿底部包被有γ聚穀氨酸包被層，但不含細胞生長因子，結果22小時即可形成理想的懸浮生長細胞球體。可以看出，與現有技術相比，本實用新型培養皿可以顯著提高細胞球體形成速度。2、免疫螢光檢測球體細胞標誌物的表達OCT4為幹細胞乾性基因，腫瘤幹細胞中OCT4基因表達呈陽性，且表達量高。通過測定細胞樣本中OCT4陽性細胞的比率可以評估細胞樣本中幹細胞的含量。本實施例三組富集方法獲得的懸浮生長細胞球體中OCT4陽性細胞比例如下表：與SPCA-1細胞相比，本實施例三組富集方法獲得的懸浮生長細胞球體中OCT4陽性細胞比例均顯著升高；與現有技術常規培養皿B相比，常規培養皿A培養法懸浮生長細胞球體中非幹細胞比例較高，包被培養皿培養法懸浮生長細胞球體中幹細胞含量略高。上述實驗表明，本實用新型提供的含有γ聚穀氨酸包被層的培養容器可以顯著提高懸浮生長細胞球體的形成效率，24小時內即可形成理想的懸浮生長細胞球體，且肺癌幹細胞在該懸浮生長細胞球體中高度富集，比現有的無血清培養基加細胞生長因子法效率更高，更便捷。上述實施例的作用在於說明本實用新型的實質性內容，但並不以此限定本實用新型的保護範圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本實用新型的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本實用新型技術方案的實質和保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp